Summary
Här beskriver vi en exakt metod för att samla bröst trumman lymfocyter och observera migrationen av gut-tropiska lymfocyter i råtta Peyers fläckar i 3 timmar med tidsfördröjning fotografering. Denna teknik kan klargöra hur dynamiken hos lymfocyter påverkas under inflammatoriska förhållanden.
Abstract
Naiva lymfocyter återcirkulerar från blodet till lymfoida vävnader under fysiologiskt tillstånd och det är allmänt erkänt som ett viktigt fenomen i tarmimmuniteten. Stromen av sekundära lymfoida organ, såsom Peyers fläckar (PPs) eller mesenteriala lymfkörtlar, är där naiva lymfocyter känner antigener. Naiva lymfocyter cirkulerar genom blodomloppet för att nå höga endotel venuler, portalen för inträde i PPs. Vissa immunmodulatorer uppskattas påverka lymfocytmigration, men den exakta utvärderingen av mikrocirkulationsdynamiken är mycket svår, och att fastställa en metod för att observera lymfocytmigration in vivo kan bidra till klargörandet av de exakta mekanismerna. Vi förfinade metoden att samla lymfocyter från lymfkanalen och observera den detaljerade dynamiken i gut-tropic lymfocyter i råtta PPs. Vi valde confocal laser scanning mikroskopi för att observera råtta PPs in vivo och spelade in det med tidsfördröjning fotografering. Vi kan nu få tydliga bilder som kan bidra till analysen av lymfocytdynamik.
Introduction
Peyers fläckar (PPs) består av hundratals lymfoida folliklar i tunntarmens lamina propria. PPs är indelade i folliklar, interfollicular regionen och germinal centers ligger i den nedre delen av folliklarna, där lymfocyter stimuleras av antigen presentation. Det finns inga afferenta lymfkärl, och antigenerna invaderar lamina propria från tarmlumen via epitelcellskiktet. Epitelregionen som täcker lymfoida folliklar kallas follikel-associerade epitel, inom vilken specialiserade interspersed M celler upptag mucosal antigener. M-celler tar in antigener från den luminala sidan och antigener fångas sedan av dendritiska celler och presenteras mot naiva lymfocyter som strömmar in i PPs genom endotel av höga endotel venuler (HEVs)1. PPs spelar en viktig roll i tarmimmunitet och är relaterade till det tidiga stadiet av inflammation. Många molekylära interaktioner innebär ingången av lymfocyter till sekundära lymfoida organ (SLOs), inklusive vidhäftningsmolekyler, kemokiner2,3, och sphingosine-1-fosfat4; således finns det många förväntade terapeutiska mål. Därför, observera lymfocytdynamiken inom PPs gör det möjligt för oss att få en glimt av det mycket tidiga skedet av inflammation och undersöka nyttan av flera lovande läkemedel.
Metoden här fokuserar på migration av lymfocyter i PPs, som innehåller flera förfaranden (cannulation i bröstkanalen5 och samla lymfocyter och långsiktig observation efter injektionen i insamlade lymfocyter). Eftersom dessa förfaranden är komplexa och det var svårt att se exakt hur varje förfarande utfördes i tidigare rapporter, nämnde vi här några tips för att uppnå en framgångsrik observation. Till exempel var cannulation av rören i bröstkanalen mycket svårt, och den ursprungliga framgångsgraden för cannulation var mindre än 50%. Vi förbättrade dock metoden och uppnådde en framgångsgrad som översteg 80 procent. Vi nämnde några andra tips i detta manuskript som är nödvändiga för framgångsrik observation för att möjliggöra kvantitativ utvärdering av transendotelial migration av lymfocyter under flera förhållanden.
I tidigare rapporter var det svårt att förstå de tredimensionella förändringarna över tiden, såsom intravenös injektion av Indien bläck för att färga kärlstrukturen hos PPs6, eller mikroskopet är monofokal7. Under de senaste åren har en observationsmetod med hjälp av vissa fotokonverterbara fluorescensproteintransgena djur som Kaede möss klargjort systematiska cellulära rörelser in vivo8. Den andra studien klargjorde CD69 oberoende avstängning av lymfocyt utgående från PPs9. Vi använde confocal laser scanning mikroskopi (CLSM) på grund av dess höga analytiska förmåga. Nu kan vi enkelt få högupplösta bilder och använda dem för att analysera lymfocytdynamik.
I detta betänkande visade vi en rad metoder för att utvärdera lymfocyt migration i PPs. Först visade vi raffinerade metoder för bröst trumman cannulation för att samla lymfocyter. För det andra förbättrade vi observationsmetoderna på flera sätt för att upprätthålla objektiva organ när det var möjligt under mikroskopisk observation, vilket gjorde det möjligt för oss att få högkvalitativa bilder i 3 timmar. För det tredje kvantifierade vi cellulära rörelser av lymfocytmigration för att utvärdera effekterna av vissa mediciner. Dessa ändrade protokoll kommer att bidra till utvecklingen av mucosal immunologi utvärderingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det experimentella protokollet godkändes av Animal Research Committee of National Defense Medical College (nr 16058). Djuren hölls på standard laboratorie chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan). Laboratoriedjuren behandlades i enlighet med Nationella hälsoinstitutens riktlinjer.
1. Insamling och separation av lymfocyter
OBS: Eftersom lymfocyter måste vara färska och inte kan lagras måste de samlas in från råttor för varje experiment. Dessutom måste gut-tropikiska lymfocyter samlas direkt från bröstkanalen där de cirkulerar. Alla procedurer förväntas slutföras inom 6 timmar, och alla instrument, handskar och ytor är rena. För att hålla djuren i ett fysiologiskt stabilt tillstånd bör all saltlösning och andra vätskor som används i försöket hållas varma.
- Bilda ett kanyleringsrör (1 mm diameter) som en heparinkurva (en radie på ca 5 mm) efter att ha doppat det i varmt vatten (ca 80-90 °C) och fäst det på en plastbräda med tejp i några timmar i förväg.
- Bedöva en manlig Wistar råtta (8-12 veckor) med intraperitoneal injektion av en blandning av Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) och Betulphar (2,5mg/kg) och klippa kroppshåret i buken med hjälp av en hårklippare. Ta bort håret ordentligt efter rakning så att håret inte kommer in i bukhålan.
- Efter att ha bekräftat att det stabila anestesidjupet som krävs för ingreppet erhålls genom tå nypa, gör ett snitt med kirurgisk sax horisontellt från mittlinjen till det vänstra delkostalområdet. Var försiktig så att blodkärlen inte skadas i parietalperitoneum genom att titta på kärlen under ljus.
- Linda magen med våt gasväv och flytta magen försiktigt till höger utanför kroppen för att avslöja de retroperitoneala organen. Sätt in ett hack mellan ryggradens erektormuskler och fettvävnaden med kirurgisk sax och separera dem rakt ut med fingrarna.
- Ta försiktigt bort bindväven runt bröstkanalen. Överskottet av bindväv ökar med åldern. Exponera bröstkanalen från strax under de vänstra crusna i membranet kaudally tills en 20 mm längd på bröstkanalen var synlig. Separera försiktigt vidhäftningar mellan bröstkanalen och aortan med precisions pincett eller våta bomullspinne.
- Utför denna process noggrant eftersom vissa råttor har artärer som förgrenar sig från bukartären som korsar över bröstkanalen eller en kort bröstkanal på grund av en högre position av lymfplexus (små bröstkanaler som sprider sig som spindelnät). Undvik onödig kontakt med bröstkanalen för att undvika att inducera ödem.
- Applicera en ligatur med en sträng (3-0 silke) på bröstkanalen precis under membranets vänstra crus. Den kaudala bröstkanalen blir distended.
- Gör ett hål (5 mm diameter) i bukväggen genom att sticka skäreggen på kirurgisk sax, passera hårnålsböjda kannulationsröret och ligate röret på iliopsoas muskeln vid ett tillfälle. Fyll kanyleringsröret med normal saltlösning som innehåller 10 U/ml heparin.
- Efter att ha placerat en sträng (3-0 silke) under den distended bröstkanalen, hugg bröstkanalen med den skarpt skurna kanten av ett kannulationsrör, kannulera den mot svansen ca 5 mm och ligat thoraxkanalen med cannulationsrör för fixering.
- För att leverera saltlösning för att förhindra uttorkning, skapa ett hål (3 mm diameter) på den främre väggen i magen med precisions pincett och skicka silikonröret (2 mm i diameter) till tolvfingertarmen genom den pyloriska ringen. Efter att ha sytt ihop ett sår och underhåller djuren i Bollmans burar, börja ingjuta sockerbelastad saltlösning i varje råttas duoden från kiselröret med en flödeshastighet på 3 ml/h. Täck hela buret med en pappershandduk för att hålla den varm.
- Fäst kanyleringsröret i hålet i mitten av locket på ett 50 ml koniskt rör på is som innehåller 6 U/ml heparin, 10% fetalt bovint serum och RPMI 1640 medium (pH 7.4; se materialtabellen) och samla bröstkanallymfocyter (TDLs) på is. Var försiktig så att du inte kommer i kontakt med rörspetsen till väggen i det koniska röret för att förhindra kannulerad ocklusion på grund av fibrinproppbildning inuti röret. Lymfvätska (ca 20 ml) inklusive ca 1,0 x 108~109 lymfocyter kan erhållas på 6 timmar. För att erhålla lymfocyter under fullständig anestesi övervakas anestesiplanet och lymfflödet observeras på lämpligt sätt. Samma bedövningsmedel tillsätts vid samma dos ca 3 timmar efter att råttor sätts i Ballmans bur för att få djupbedövning kontinuerligt i 6 timmar.
2. Lymfocyt märkning med carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDSE)
- Lös upp CFDSE(Table of Materials)i dimetylsulfoxid (DMSO) till 15,6 mM (500 μg CFDSE upplöst i 60 μL DMSO).
- Inkubera lymfocyter (1 x 108~109)i 50 ml RPMI 1640 med 50 μL CFDSE-lösning i 30 min vid 37 °C enligt beskrivningentidigare 10.
3. Experimentell installation för mikrovaskulära studier
- Bedöva mottagarråttor (8–12 veckor) med intraperitoneal injektion av en blandning av Midazolam (2 mg/kg), Domitor (0,15 mg/kg) och Betulphar (2,5 mg/kg) och bekräfta anestesidjupet genom tånypa. Blöt buken innan du preparerade pälsen för att minimera hårföroreningen. Öppna sedan mottagaren Wister rats buk via ett mittlinjesnitt.
- Sätt en råtta på en bärbar rostfri platta (ca 120 x 300 mm) med ett rektangelhål runt mitten täckt med en glasrutschbana (24 x 50 mm). Välj ca 10 cm av ileal segmentet inklusive PPs för observation.
- Håll tarmarna så varma som möjligt och fuktiga med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) uppvärmd till 37 °C. Blötlägg gasväv som används för att täcka tunntarmen med PBS.
- Samtidigt som du ger kontinuerlig anestesi med 2 % isofluran (se materialförteckning), sätt rutschkanan på mikroskopets scen och välj lämpliga områden för observation av mikrocirkulationen i PPs där vissa hevs kör genom serosa. PPs intervall i storlek; större är lämpliga för observation av mikrocirkulationen med CLSM. Tunntarmen är inte rak på sina ställen; ett rakt segment som är minst 2 cm långt utan spänning är lämpligt för observation.
- Täck det intilliggande tarmsegmentet och tarmseni med absorberande bomull dränkt med PBS. Placera tarmsegmentet mellan två rullade bomullsbollar och placera det så långt som möjligt från råttans kropp för att förhindra att det vibrerar av råttans hjärtslag och andning.
- Använd en 1 ml spruta och injicera långsamt (över 1 min) CFSE-märkta TDLs (1 x 108 celler) i halsvenen hos mottagarråttor. En snabb intravenös injektion kan påverka systemcirkulationen.
4. Mikrocirkulation av lymfocyter
- Övervaka kontinuerligt TDLs i mikrovasculature av PPs med CLSM och spela in på en dator i 3 timmar med tidsfördröjning fotografering med 30 s intervall. Djupet från serosa till PPs HEV är ca 25 μm, vilket möjliggör observation av stroma och kapillärlymfkärl till ett djup av 30 μm.
- Injicera Texas Red–dextran (25 mg/kg) i halsvenen hos varje mottagarråtta för att färga blodomloppet och Hoechest 33342 (5 mg/kg) för att färga cellkärnorna.
- (Valfritt) För att kvantifiera lymfocytdynamik, definiera lymfocyter som följer HEVs mer än 30 sekunder som "självhäftande lymfocyter" och lymfocyter som emigrerar från HEVs till stroma som "migrerande lymfocyter". Beräkna sedan den genomsnittliga procentandelen migration (migrerande lymfocyter / självhäftande lymfocyter + migrerande lymfocyter) per synfält (cirka 0, 3 mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samla lymfocyter från lymfa
För att förbereda råttan för bröstkanals cannulation, gör ett snitt i den spända bröstkanalen som visas i figur 1 och håll sedan råttan i en Bollmans bur som visas i figur 2.
När lymfocyterna samlas in väl kan vi få ca 20 ml/6 h lymfvätska som innehåller ca 107~108/mLlymfocyter. Av TDLs uttrycker 70% CD4, varav cirka 90% celler uttrycker CD62L, vilket innebär huvudsammansättningen av TDLs (>60%) består av naiva gut-tropika lymfocyter. Eftersom de lymfocyter som samlas in här är celler som specifikt migrerar till tarmkanalen, är de lämpliga för att utvärdera migrationstillståndet i Peyers plåster.
Mikroskopisk observation
Efter att ha injicerat en tillräcklig dos fluorescerande lymfocyter, montera den mottagande råttans tarmar på en glasrutschbana enligt figur 3. En mikroskopisk bild av PPs i fysiologiskt tillstånd visas i figur 4.
För mikroobservationen kan råttor vara stabilt sövd under laparotomi i ca 3 timmar. Lymfocyter följer HEVs, rullar och migrerar till den omgivande stromen och migrerar sedan till lymfkaillärer. Vi kvantifierade och utvärderade andelen lymfocyter som migrerade i stroma inom observationsperioden.
Efter injektionen av en adekvat dos fluorescerande lymfocyter börjar gut-tropiska lymfocyter att hålla fast vid HEVs och migrera över endotel till stromen om ca 1 timme. De flesta rör sig inom stromen, medan andra migrerar till lymfkapillärer på ca 2-3 timmar. Den välutvecklade fluorescensmärkningen ex vivo i denna studie resulterade hög intensitet och det gör det möjligt för oss att observera lymfocytdynamiken i mycket djupt område. Genom att använda en annan typ av fluorescensmärkning kan vi dessutom enkelt observera dynamiken hos olika typer av lymfocyt samtidigt. Denna gut-tropic lymfocyt migration kan klargöras visuellt för undertryckande av vissa immunmodulatorer såsom FTY720 som visas i vår tidigare rapport.
Observation av själva mikrocirkulatoriska systemet är extremt svårt, och det är önskvärt att fastställa en enkel utvärderingsmetod. Denna studie har också gjort det möjligt att ta reda på var läkemedlets åtgärdsplats finns i Peyers fläckar. I synnerhet gjorde ex vivo administrering av FTY720 till lymfocyt det möjligt att begränsa platsen för åtgärder endast till lymfocyter men inte till endotel. I kombination med sortering av specifika lymfocyter skulle mer detaljerade resultat erhållas.
Figur 1: Förfarande för att exponera bröstkanalen och utföra kannulering. Efter att ha skurit bukhinnan längsgående kan bröstkanalen exponeras genom att flytta magen hjärnskålen och dissekera bindväven på den dorsala högra sidan av buken stora kroppspulsådern. Bindväven runt membranet bör noggrant dissekeras för att förhindra skador. Bröstkanalen ska exponeras så brett hjärnskålen som möjligt för att skapa tillräckligt med utrymme för kannulering och sedan ligateras av en 3-0 silkessutur strax under membranet för att stoppa flödet av lymfa och behålla vätskan kaudally. Mjölkig lymfvätska är synlig genom lymfkanalen, där katetern kan sättas in. Råttans bröstkanal bör vara något ansträngd för att säkerställa en jämn kannulation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: En bild av hela inställningen för att samla bröstkanallymfocyter (TDLs). Råttorna hålls i Bollmans burar och TDLs samlas in genom kanyleringsröret i varje flaska. Injektionsflaskan är inställd på is och byts ut var 12:e timme för att samla in färsk lymfvätska. Sockerbelastad saltlösning administreras genom ett silikonrör med en sprutpump med en hastighet av cirka 3 ml/h för att förhindra uttorkning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Råttan sätts på mikroskopets scen ansluten till anestesimaskinen, och en fluorescerande substans eller fluorescerande märkta lymfocyter injiceras från den venösa katetern genom den inre halsvenen (A). Observationsområdet i tarmkanalen var försiktigt fixerade mellan två rullade bomull bollar. Tarmkanalen var fast långt från stammen för att undvika vibrationer genom andningsrörelser. Valsade bomullstussar blötlades i fosfatbuffrad saltlösning för att förhindra torkning av tarmarna under observationsperioden (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Mikroskopisk bild av Peyers fläckar i fysiologiskt tillstånd (A). Atomkärnorna i kärlen endotelceller är färgade blå. Blodplasman är röd och blodflödet detekteras av flödet av obefläckade celler. Gut-tropiska lymfocyter (färgade gröna) som följer höga endotel venuler (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi ett protokoll för att samla naiva gut-tropic lymfocyter och observera deras migration i råtta PPs. Dessa förfaranden kan avslöja hur lymfocyter rör sig i mikrovaskulaturen av PPs och göra det möjligt att visuellt jämföra deras dynamik under ett normalt eller medicinerat tillstånd. Den direkta observationen av denna dynamik har mycket fördelar att få en ledtråd för immunologiska modifiering av vissa läkemedel, även om observationsperioden är begränsad till endast några timmar.
Vi nämnde några tips i metoderna. Bland dem är en av de mest känsliga procedurerna att operatören måste kannulera bröstkanalen snabbt och exakt. Om en operation tar lång tid och innebär onödiga skador uppstår betydande blödning och inflammation, vilket resulterar i en minskad TDL-insamling på grund av ödem i bindväven och obstruktion av bröstkanalen. Vi brukade kannulera röret efter att ha skapat ett litet snitt på bröstkanalen med hjälp av sax med en liten skäregg. Denna procedur stör dock cannulation platsen på grund av dränerande lymfa. Därför skär vi inte bröstkanalen nu; snarare hugger vi den med en skarp kant. Denna metod gör kannuleringen enklare och ökar framgångsgraden. Dessutom är snittstället i bröstkanalen mycket viktigt på grund av den begränsade bukhålan. Om snittstället är för nära membranet skulle den böjda delen av kannulationsröret stöta mot membranet. Om det är för långt från membranet är det också svårt att kannulera röret tillräckligt djupt för att säkerställa fixering på grund av lymfplexus i den kaudala bröstkanalen. Även vid god kannulering kan kan kannulationsröret lätt ocklusuderas av fibrinbildning. Således rekommenderar vi att du regelbundet försiktigt spolar röret med heparin.
De senaste framstegen inom CLSM gjorde det möjligt att observera det fokuserade området tydligare och exakt i realtid jämfört med en tidigare studie11. Vi använder nu CLSM i vårt laboratorium, men vi kan observera mikrocirkulationen tydligare med hjälp av ett multifotonmikroskop. Även om protokollet kräver modifiering i flera punkter tillsammans med tekniska framsteg, möjliggör det observation av det lokaliserade området i organ av intresse12,13.
Förtjänsten och nyckeln till metoden är att det innebär att separera lymfocyter från mottagardjur, inkubera dem med någon form av föreningar in vitro och observera dem efter injektionen i mottagardjur. Detta gör det möjligt att belysa effekterna av lymfocyter ensam. Tvärtom, om vi vill belysa effekterna av någon form av föreningar på andra celler än lymfocyter, såsom kärlen endotel, kan vi behandla mottagardjur med någon form av föreningar och observera dem efter injektionen av kontrolllymfocyter. För att klargöra samma saker med möss måste vi skapa villkorliga genetiskt manipulerade djur en efter en. Dessutom skulle sortering av isolerade lymfocyter med hjälp av specifik ytmarkör göra det möjligt att studera dynamiken hos specifika typer av lymfocyter.
Som visas i videon av denna studie rör sig lymfocyter på obestämd tid och i sammaled genom den faktiska kroppens kärlenothelium, så det är svårt att utvärdera effekter på deras beteende med endast in vivo-observationer. Dessutom, Om verkningsmekanismen för ett administrerat läkemedel ska undersökas, är det ursprungligen olämpligt att undersöka varje åtgärdsställe. Fördelarna med denna studie är att genom att separera lymfocyter och inkubera dem in vitro, kan de medicinska effekterna undersökas separat på vaskulär och lymfocyt sidor. Färre variabler är lättare att analysera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag från National Defense Medical College och av ett forskningsanslag för hälso- och arbetsvetenskap för forskning om svårbehandlade sjukdomar från ministeriet för hälsa, arbete och välfärd, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B.
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
