Summary
Hier beschrijven we een nauwkeurige methode voor het verzamelen van thoracale kanaallymfocyten en het observeren van de migratie van darm-tropenlymfocyten in de patches van rat Peyer gedurende 3 uur met behulp van time-lapse fotografie. Deze techniek kan verduidelijken hoe de dynamiek van lymfocyten wordt beïnvloed onder inflammatoire omstandigheden.
Abstract
Naïeve lymfocyten recirculeren van het bloed naar de lymfoïde weefsels onder fysiologische toestand en het wordt algemeen erkend als een belangrijk fenomeen in de darmimmuniteit. Het stroma van secundaire lymfoïde organen, zoals Peyer's patches (PPs) of mesenterische lymfeklieren, zijn waar naïeve lymfocyten antigenen voelen. Naïeve lymfocyten circuleren door de bloedbaan om hoge endotheel venules te bereiken, het portaal van binnenkomst in PPs. Sommige immunomodulatoren worden geschat om lymfocytenmigratie te beïnvloeden, maar de nauwkeurige evaluatie van microcirculatiedynamiek is zeer moeilijk, en het vaststellen van een methode om lymfocytenmigratie in vivo te observeren kan bijdragen aan de verduidelijking van de precieze mechanismen. We hebben de methode verfijnd om lymfocyten uit het lymfekanaal te verzamelen en de gedetailleerde dynamiek van darmtroeplymfocyten in rat-PPs te observeren. We kozen voor confocale laserscanmicroscopie om rat-PPs in vivo te observeren en namen het op met behulp van time-lapse-fotografie. We kunnen nu duidelijke beelden verkrijgen die kunnen bijdragen aan de analyse van de lymfocytendynamiek.
Introduction
Peyer's patches (PPs) bestaan uit honderden lymfoïde follikels in de lamina propria van de dunne darm. PPs zijn onderverdeeld in follikels, het interfolliculaire gebied en kiemcentra in het onderste deel van de follikels, waar lymfocyten worden gestimuleerd door antigeenpresentatie. Er zijn geen afferente lymfevaten en de antigenen dringen de lamina propria van het darmlumen binnen via de epitheelcellaag. Het epitheelgebied dat lymfoïde follikels omvat, wordt het follikel-geassocieerde epitheel genoemd, waarbinnen gespecialiseerde afgewisselde M-cellen slijmvliesantigenen innemen. M-cellen nemen antigenen op van de luminale kant en antigenen worden vervolgens gevangen door dendritische cellen en gepresenteerd in de richting van naïeve lymfocyten die in PPs stromen via het endotheel van hoge endotheel venules (HEVs)1. PPs spelen een belangrijke rol in de darmimmuniteit en zijn gerelateerd aan het vroege stadium van ontsteking. Veel moleculaire interacties omvatten de ingang van lymfocyten tot secundaire lymfoïde organen (SLA's), waaronder hechtingsmoleculen, chemokines2,3en sfingosine-1-fosfaat4; er zijn dus veel verwachte therapeutische doelen. Daarom stelt het observeren van de lymfocytendynamiek binnen PPs ons in staat om een glimp op te vangen van het zeer vroege stadium van ontsteking en het nut van verschillende veelbelovende geneesmiddelen te onderzoeken.
De methode richt zich hier op de migratie van lymfocyten in PPs, die verschillende procedures omvat (cannulatie in het thoracale kanaal5 en het verzamelen van lymfocyten en langetermijnobservatie na de injectie in verzamelde lymfocyten). Aangezien deze procedures complex zijn en het moeilijk was om precies te zien hoe elke procedure in eerdere rapporten werd uitgevoerd, hebben we hier enkele tips genoemd om tot een succesvolle observatie te komen. Cannulatie van de buizen in het thoracale kanaal was bijvoorbeeld erg moeilijk en het aanvankelijke slagingspercentage van cannulatie was minder dan 50%. We hebben de methode echter verbeterd en een slagingspercentage van meer dan 80% bereikt. We noemden enkele andere tips in dit manuscript die nodig zijn voor de succesvolle observatie om de kwantitatieve evaluatie van de transendotheliële migratie van lymfocyten onder verschillende omstandigheden mogelijk te maken.
In eerdere rapporten was het moeilijk om de driedimensionale veranderingen in de loop van de tijd te begrijpen, zoals de intraveneuze injectie van Indiase inkt om de vasculaire structuur van PPs6te bevlekken , of de microscoop die monofocaalis 7. In de afgelopen jaren heeft een observationele methode met behulp van enkele fotoconverteerbare fluorescentie-eiwittransgene dieren zoals Kaede-muizen systematische cellulaire bewegingen in vivo8verduidelijkt . De andere studie verduidelijkte cd69 onafhankelijke uitschakeling van lymfocytenuitgang van PPs9. We gebruikten confocale laser scanning microscopie (CLSM) vanwege het hoge analytische vermogen. Nu kunnen we gemakkelijk afbeeldingen met een hoge resolutie verkrijgen en ze gebruiken om de lymfocytendynamiek te analyseren.
In dit verslag hebben we een reeks methoden gedemonstreerd voor de evaluatie van lymfocytenmigratie bij PPs. Ten eerste toonden we verfijnde methoden van thoracale kanaalconnulatie om lymfocyten te verzamelen. Ten tweede hebben we de observatiemethoden op verschillende manieren verbeterd om objectieve organen waar mogelijk onder microscopische observatie te behouden, waardoor we gedurende 3 uur beelden van hoge kwaliteit kunnen verkrijgen. Ten derde hebben we de cellulaire bewegingen van lymfocytenmigratie gekwantificeerd om de effecten van sommige medicijnen te evalueren. Deze gewijzigde protocollen zullen bijdragen aan de ontwikkeling van evaluaties van mucosale immunologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Animal Research Committee van het National Defense Medical College (nr. 16058). De dieren werden onderhouden op standaard laboratorium chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan). De proefdieren werden behandeld volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. Verzameling en scheiding van lymfocyten
OPMERKING: Aangezien lymfocyten vers moeten zijn en niet kunnen worden opgeslagen, moeten ze voor elk experiment bij ratten worden verzameld. Bovendien moeten darmtroeplymfocyten rechtstreeks worden verzameld uit het thoracale kanaal waar ze circuleren. Alle procedures worden naar verwachting binnen 6 uur voltooid en alle instrumenten, handschoenen en oppervlakken zijn schoon. Om de dieren in een fysiologisch stabiele toestand te houden, moeten alle zoutoplossing en andere vloeistoffen die in het experiment worden gebruikt, warm worden gehouden.
- Vorm een cannulatiebuis (diameter 1 mm) als een heparinecurve (een straal van ongeveer 5 mm) nadat u deze in heet water (ongeveer 80-90 °C) hebt gedompeld en bevestig deze enkele uren van tevoren met plakband aan een plastic plaat.
- Verdoof een mannelijke Wistar-rat (8-12 weken) met intraperitoneale injectie van een mengsel van Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) en Betulphar (2,5mg/kg) en knip het lichaamshaar van de buik met behulp van een haarknipper. Verwijder het haar stevig na het scheren zodat het haar niet in de buikholte komt.
- Nadat u hebt bevestigd dat de stabiele diepte van anesthesie die nodig is voor de procedure wordt verkregen door een teenknijper, maakt u een incisie met een chirurgische schaar horizontaal van de middellijn naar het linker subcostale gebied. Zorg ervoor dat u de bloedvaten in het pariëtale buikvlies niet beschadigt door de bloedvaten onder licht te bekijken.
- Wikkel de maag met nat gaas en beweeg de maag voorzichtig naar de rechterkant van het lichaam om de retroperitoneale organen te onthullen. Steek een inkeping tussen de erectorspieren van de wervelkolom en het vetweefsel met behulp van een chirurgische schaar en scheid ze botweg met vingers.
- Verwijder voorzichtig het bindweefsel rond het thoracale kanaal. Het overtollige bindweefsel neemt toe met de leeftijd. Stel het thoracale kanaal bloot van net onder de linker crus van het middenrif tot een lengte van 20 mm van het thoracale kanaal zichtbaar was. Scheid de verklevingen tussen het thoracale kanaal en de aorta voorzichtig met behulp van een precisiepincet of natte wattenstaafjes.
- Voer dit proces zorgvuldig uit omdat sommige ratten slagaders hebben die zich vertakken vanuit de buikslagader die over het thoracale kanaal of een kort thoracaal kanaal kruist vanwege een hogere positie van de lymfevlecht (kleine thoracale kanalen die zich verspreiden als spinnenwebben). Vermijd onnodig contact met het thoracale kanaal om oedeem te voorkomen.
- Breng een ligatuur aan met een snaar (3-0 zijde) op het borstkanaal net onder de linker crus van het middenrif. Het caudale thoracale kanaal wordt opgezwekt.
- Maak een gat (5 mm diameter) in de buikwand door de snijkant van de chirurgische schaar te steken, passeer de haarspeldgebogen cannulatiebuis en ligate de buis op de iliopsoas-spier op een gegeven moment. Vul de cannulatiebuis met normale zoutoplossing met 10 U/ml heparine.
- Na het plaatsen van een koord (3-0 zijde) onder het opgezwepen thoracale kanaal, steekt u het thoracale kanaal met de scherp gesneden rand van een cannulatiebuis, canuleert u het ongeveer 5 mm naar de staart en bindt u het thoracale kanaal met cannulatiebuis voor fixatie.
- Om zoutoplossing te leveren om uitdroging te voorkomen, maakt u met behulp van een precisiepincet een gat (diameter van 3 mm) op de voorwand van de maag en geeft u de siliconenbuis (met een diameter van 2 mm) door aan de twaalfvingerige darm. Na het hechten van een wond en het onderhouden van de dieren in bollmans kooien, begin je met suiker beladen zoutoplossing uit de siliciumbuis in de twaalfvingerige darm van elke rat te infuseren met een debiet van 3 ml /h. Bedek de hele kooi met een keukenpapier om het warm te houden.
- Bevestig de cannulatiebuis aan het gat in het midden van het deksel van een conische buis van 50 ml op ijs met 6 U/ml heparine, 10% foetaal runderserum en RPMI 1640 medium (pH 7,4; zie de tabel met materialen) en verzamel thoracale ductlymfocyten (TDLs) op ijs. Zorg ervoor dat u de punt van de buis niet contacteert met de wand van de conische buis om occlusie van canules te voorkomen als gevolg van de vorming van fibrinestolsels in de buis. Lymfevocht (ongeveer 20 ml) inclusief ongeveer 1,0 x 108~109 lymfocyten kan in 6 uur worden verkregen. Om de lymfocyten onder volledige anesthesie te verkrijgen, wordt het vlak van anesthesie gecontroleerd en wordt de lymfestroom op de juiste manier geobserveerd. Dezelfde verdovingsmiddelen worden toegevoegd in dezelfde dosis ongeveer 3 uur nadat ratten in ballmans kooi zijn geplaatst om gedurende 6 uur onafgebroken diepe anesthesie te verkrijgen.
2. Lymfocytenetikettering met carboxyfluoresceïnediacetaatsuccinimidylester (CFDSE)
- Los CFDSE (Materials Table of Materials) op in dimethylsulfoxide (DMSO) tot 15,6 mM (500 μg CFDSE opgelost in 60 μL DMSO).
- Incubeer lymfocyten (1 x 108~109) in 50 ml RPMI 1640 met 50 μL CFDSE-oplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C zoals eerder beschreven10.
3. Experimentele opstelling voor microvasculaire studies
- Verdoof de ontvangende ratten (8-12 weken) met intraperitoneale injectie van een mengsel van Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) en Betulphar (2,5mg/kg) en bevestig de diepte van de anesthesie door teenknijpen. Maak de buik nat voordat u de vacht verzorgt om haarbesmetting te minimaliseren. Open vervolgens de buik van de ontvangende Wister-rat via een middenlijnincisie.
- Leg een rat op een draagbare roestvrijstalen plaat (ongeveer 120 x 300 mm) met een rechthoekgat rond het midden bedekt met een glazen glijbaan (24 x 50 mm). Kies ongeveer 10 cm van het ileale segment inclusief PPs ter observatie.
- Houd de darm zo warm mogelijk en vochtig met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) opgewarmd tot 37 °C. Week gaas dat wordt gebruikt om de dunne darm te bedekken met PBS.
- Terwijl u continue anesthesie geeft met 2 % isofluraan (zie tabel met materialen), plaatst u de dia op het podium van de microscoop en kiest u geschikte gebieden voor observatie van de microcirculatie in PPs waar sommige HEVs door de serosa lopen. PPs variëren in grootte; grotere zijn geschikt voor observatie van de microcirculatie met behulp van CLSM. De dunne darm is op sommige plaatsen niet recht; een recht segment van minstens 2 cm lang zonder enige spanning is geschikt voor observatie.
- Bedek het aangrenzende darmsegment en mesentery met absorberend katoen gedrenkt in PBS. Plaats het darmsegment tussen twee opgerolde katoenen ballen en plaats het zo ver mogelijk van het lichaam van de rat om te voorkomen dat het wordt getrild door de hartslag en ademhaling van de rat.
- Injecteer met een spuit met 1 ml langzaam (meer dan 1 min) CFSE-gelabelde TDLs (1 x 108 cellen) in de halsader van de ontvangende ratten. Een snelle intraveneuze injectie kan de systemische circulatie beïnvloeden.
4. Microcirculatie van lymfocyten
- Controleer continu TDLs in de microvasculatuur van PPs met behulp van CLSM en neem gedurende 3 uur op op een computer met behulp van time-lapse fotografie met intervallen van 30 s. De diepte van de serosa tot de HEV van PPs is ongeveer 25 μm, waardoor de stroma- en capillaire lymfevaten kunnen worden geobserveerd tot een diepte van 30 μm.
- Injecteer Texas Red-dextran (25 mg/kg) in de halsader van elke ontvangende rat om de bloedbaan te bevlekken en Hoechest 33342 (5 mg/kg) om de celkernen te bevlekken.
- (Optioneel) Om de lymfocytendynamiek te kwantificeren, definieert u lymfocyten die zich meer dan 30 seconden aan HEV's hechten als "zelfklevende lymfocyten" en lymfocyten die van HEV's naar stroma emigreren als "migrerende lymfocyten". Bereken vervolgens het gemiddelde migratiepercentage (migrerende lymfocyten / zelfklevende lymfocyten + migrerende lymfocyten) per gezichtsveld (ongeveer 0,3 mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lymfocyten verzamelen uit lymfe
Om de rat voor te bereiden op thoracale kanaalkannulatie, maakt u een incisie in het gespannen thoracale kanaal zoals weergegeven in figuur 1 en onderhoudt u de rat vervolgens in een bollmanskooi zoals weergegeven in figuur 2.
Wanneer de lymfocyten goed zijn verzameld, kunnen we ongeveer 20 ml/6 uur lymfevocht verkrijgen dat ongeveer 107~ 108/ ml lymfocyten bevat. Van de TDLs drukt 70% cd4 uit, waarvan ongeveer 90% cellen CD62L uitdrukken, wat de belangrijkste samenstelling van TDLs betekent (>60%) bestaat uit naïeve darm-tropen lymfocyten. Omdat de hier verzamelde lymfocyten cellen zijn die specifiek migreren naar het darmkanaal, zijn ze geschikt voor het evalueren van de staat van migratie in Peyer's patches.
Microscopische observatie
Na het injecteren van een adequate dosis fluorescerende lymfocyten, monteert u de darm van de ontvangende rat op een glazen dia zoals weergegeven in figuur 3. Een microscopisch beeld van PPs in de fysiologische toestand wordt weergegeven in figuur 4.
Voor de microobservatie kunnen ratten ongeveer 3 uur stabiel worden verdoofd onder laparotomie. Lymfocyten hechten zich aan HEVs, rollen en migreren naar het omringende stroma en migreren vervolgens naar lymfecapillairen. We kwantificeerden en evalueerden het percentage lymfocyten dat in het stroma migreerde binnen de observatieperiode.
Na de injectie van een adequate dosis fluorescerende lymfocyten beginnen darmtroeplymfocyten zich aan HEVs te hechten en migreren ze over het endotheel naar het stroma in ongeveer 1 uur. De meeste bewegen binnen het stroma, terwijl anderen migreren naar lymfevaten in ongeveer 2-3 uur. De goed ontwikkelde fluorescentieetikettering ex vivo in deze studie resulteerde in een hoge intensiteit en het stelt ons in staat om de lymfocytendynamiek van een zeer diep gebied te observeren. Bovendien kunnen we, door een ander soort fluorescentie-etikettering te gebruiken, de dynamiek van verschillende soorten lymfocyten tegelijkertijd gemakkelijk observeren. Deze darm-tropen lymfocyten migratie kan visueel worden verduidelijkt voor onderdrukking door sommige immunomodulatoren zoals FTY720 zoals getoond in ons vorige rapport.
Observatie van het microcirculatiesysteem zelf is uiterst moeilijk en het is wenselijk om een eenvoudige evaluatiemethode vast te stellen. Deze studie heeft het ook mogelijk gemaakt om erachter te komen waar de actielocatie van het medicijn zich in de peyer's patches bevindt. Met name ex vivo toediening van FTY720 aan lymfocyten maakte het mogelijk om de werkingsplaats alleen te beperken tot lymfocyten, maar niet tot endotheel. In combinatie met het sorteren van specifieke lymfocyten zouden meer gedetailleerde resultaten worden verkregen.
Figuur 1: Procedure om het thoracale kanaal bloot te leggen en cannulatie uit te voeren. Na het snijden van het peritoneum in de lengterichting, kan het thoracale kanaal worden blootgesteld door de maag cranially te bewegen en het bindweefsel aan de dorsale rechterkant van de abdominale aorta te ontleden. Het bindweefsel rond het middenrif moet zorgvuldig worden ontleed om letsel te voorkomen. Het thoracale kanaal moet zo breed mogelijk worden blootgesteld om voldoende ruimte te creëren voor cannulatie en vervolgens worden verteerd door een 3-0 zijden hechting net onder het middenrif om de lymfestroom te stoppen en het vocht caudaal vast te houden. Melkachtig lymfevocht is zichtbaar via het lymfekanaal, waar de katheter kan worden ingebracht. Het thoracale kanaal van de rat moet enigszins worden gespannen om een soepele cannulatie te garanderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een afbeelding van de gehele instelling om thoracale kanaallymfocyten (TDLs) te verzamelen. De ratten worden in de kooien van Bollman gehouden en TDLs worden verzameld via de cannulatiebuis in elke flacon. De flesjes worden op ijs gezet en om de 12 uur vervangen om vers lymfevocht op te halen. Met suiker beladen zoutoplossing wordt toegediend via een siliconenbuis met behulp van een spuitpomp met een snelheid van ongeveer 3 ml/h om uitdroging te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De rat wordt op het stadium van de microscoop geplaatst dat is verbonden met de anesthesiemachine, en een fluorescerende stof of fluorescerend gelabelde lymfocyten worden vanuit de veneuze katheter geïnjecteerd via de interne halsslagader (A). Het observatiegebied van het darmkanaal werd voorzichtig tussen twee opgerolde katoenen ballen bevestigd. Het darmkanaal werd ver van de romp bevestigd om trillingen door ademhalingsbewegingen te voorkomen. Gerolde katoenen bolletjes werden gedrenkt in fosfaat gebufferde zoutoplossing om uitdroging van de darm tijdens de observatieperiode te voorkomen (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Microscopisch beeld van Peyer's pleisters in de fysiologische toestand (A). De kernen van vasculaire endotheelcellen zijn blauw gekleurd. Het bloedplasma is rood en de bloedstroom wordt gedetecteerd door de stroom van onbevlekte cellen. Darm-tropen lymfocyten (gekleurd groen) hechten zich aan hoge endotheel venules (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven we een protocol voor het verzamelen van naïeve darm-tropen lymfocyten en het observeren van hun migratie in rat PPs. Deze procedures kunnen onthullen hoe lymfocyten bewegen in de microvasculatuur van PPs en maken het mogelijk om hun dynamiek visueel te vergelijken onder een normale of medicinale aandoening. De directe observatie van deze dynamiek heeft veel verdienste om een aanwijzing te krijgen voor immunologische modificatie door sommige geneesmiddelen, hoewel de observatieperiode beperkt is tot slechts een paar uur.
We noemden enkele tips in de methoden. Een van de meest delicate procedures is dat de operator het thoracale kanaal snel en nauwkeurig moet cannuleren. Als een operatie lang duurt en onnodige schade met zich meebrengt, treden significante bloedingen en ontstekingen op, wat resulteert in een verminderde TDL-verzameling als gevolg van oedeem van het bindweefsel en obstructie van het thoracale kanaal. We gebruikten om de buis te canuleeren na het maken van een kleine incisie op het thoracale kanaal met behulp van een schaar met een kleine snijkant. Deze procedure interfereert echter met de cannulatieplaats als gevolg van drainerende lymfe. Daarom snijden we nu het thoracale kanaal niet door; Integendeel, we steken het met een scherpe rand. Deze methode maakt de cannulatie eenvoudiger en verhoogt de slagingspercentages. Bovendien is de incisieplaats in het thoracale kanaal erg belangrijk vanwege de beperkte buikholte. Als de incisieplaats te dicht bij het middenrif ligt, zou het gebogen deel van de cannulatiebuis tegen het middenrif botsen. Als het te ver van het middenrif ligt, is het ook moeilijk om de buis diep genoeg te canuleren om fixatie te garanderen vanwege de lymfevlecht van het caudale thoracale kanaal. Zelfs in gevallen van goede cannulatie kan de cannulatiebuis gemakkelijk worden afgesloten door fibrinevorming. Daarom raden we aan om de buis regelmatig voorzichtig door te spoelen met heparine.
Recente vooruitgang in clsm maakte het mogelijk het aandachtsgebied duidelijker en nauwkeuriger in realtime te observeren in vergelijking met een eerdere studie11. We gebruiken nu CLSM in ons laboratorium, maar we kunnen de microcirculatie duidelijker observeren met behulp van een multifotonenmicroscoop. Hoewel het protocol op verschillende punten moet worden gewijzigd , samen met de technische vooruitgang , maakt het observatie van het gelokaliseerde gebied van het orgaan van belangmogelijk 12,13.
De verdienste en de sleutel van de methode is dat het gaat om het scheiden van lymfocyten van ontvangende dieren, het incuberen ervan met behulp van elke vorm van verbindingen in vitro en het observeren ervan na hun injectie in ontvangende dieren. Dit maakt het mogelijk om de effecten van lymfocyten alleen op te helderen. Integendeel, als we de effecten van elke vorm van verbindingen op andere cellen dan lymfocyten, zoals het vasculaire endotheel, willen ophelderen, kunnen we ontvangende dieren behandelen met elke vorm van verbindingen en ze observeren na de injectie van controlelymfocyten. Om dezelfde dingen met muizen op te helderen, moeten we voorwaardelijke genetisch gemanipuleerde dieren één voor één creëren. Bovendien zou het sorteren van de geïsoleerde lymfocyten met behulp van specifieke oppervlaktemarker het mogelijk maken om de dynamiek van specifieke soorten lymfocyten te bestuderen.
Zoals getoond in de video van deze studie, bewegen lymfocyten voor onbepaalde tijd en lateraal door het vasculaire endotheel van het eigenlijke lichaam, dus het is moeilijk om effecten op hun gedrag te evalueren met alleen in vivo observaties. Bovendien, als het werkingsmechanisme van een toegediend geneesmiddel moet worden onderzocht, is het oorspronkelijk ongeschikt voor het onderzoeken van elke actielocatie. De verdienste van deze studie is dat door lymfocyten te scheiden en ze in vitro te incuberen, de medicinale effecten afzonderlijk kunnen worden onderzocht aan de vasculaire en lymfocytenkanten. Minder variabelen zijn gemakkelijker te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van het National Defense Medical College en een onderzoeksbeurs voor gezondheid en arbeidswetenschappen voor onderzoek naar hardnekkige ziekten van het Ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B.
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
