Summary
כאן, אנו מתארים שיטה מדויקת לאיסוף לימפוציטים צינור בית החזה והתבוננות בהגירה של לימפוציטים טרופיים במדבקות של עכברוש פייר במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות. טכניקה זו יכולה להבהיר כיצד הדינמיקה של לימפוציטים מושפעים בתנאים דלקתיים.
Abstract
לימפוציטים נאיביים recirculate מהדם לרקמות הלימפה במצב פיזיולוגי והוא מוכר בדרך כלל כתופעה חשובה בחסינות המעיים. הסטרומה של איברי הלימפה המשניים, כגון טלאים של פייר (PPs) או בלוטות לימפה mesenteric, הם המקום שבו לימפוציטים נאיביים חשים אנטיגנים. לימפוציטים נאיביים מסתובבים במחזור הדם כדי להגיע לצללים אנדותל גבוהים, שער הכניסה ל- PPs. כמה immunomodulators מוערך להשפיע על נדידת לימפוציטים, אבל הערכה מדויקת של דינמיקה microcirculation קשה מאוד, וקביעת שיטה להתבונן נדידת לימפוציטים vivo יכול לתרום בירור המנגנונים המדויקים. אנחנו מעודן השיטה של איסוף לימפוציטים מן צינור הלימפה והתבוננות הדינמיקה המפורטת של לימפוציטים tropic הבטן ב PPs חולדה. בחרנו מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית כדי לצפות PPs חולדה vivo והקלטנו אותו באמצעות צילום זמן לשגות. עכשיו אנחנו יכולים להשיג תמונות ברורות שיכולות לתרום לניתוח של דינמיקה לימפוציטים.
Introduction
הטלאים של פייר (PPs) מורכבים ממאות זקיקי לימפואידים בפרופוריה למינה של המעי הדק. PPs מחולקים זקיקים, האזור interfollicular, ומרכזים נביטה הממוקמים בחלק התחתון של הזקיקים, שם לימפוציטים מגורים על ידי מצגת אנטיגן. אין כלי לימפה afferent, ואת האנטיגנים לפלוש פרופריה למינה מן לומן המעי דרך שכבת תא אפיתל. אזור האפיתל המכסה זקיקי הלימפה נקרא אפיתל הקשורים זקיק, שבתוכו תאי M משולבים מיוחדים ספיגת אנטיגנים ריר. תאי M לוקחים אנטיגנים מהצד הזוהר ואנטיגנים נלכדים לאחר מכן על ידי תאים דנדריטיים ומוצגים לכיוון לימפוציטים נאיביים הזורמים לתוך PPs דרך האנדותל של venules אנדותל גבוה (HEVs)1. PPs לשחק תפקיד חשוב חסינות מעיים קשורים עם השלב המוקדם של דלקת. אינטראקציות מולקולריות רבות כרוכות בכניסה של לימפוציטים לאיברים לימפואידיים משניים (SLOs), כולל מולקולות הידבקות, כימוקינים2,3, ו sphingosine-1-פוספט4; לכן, ישנם מטרות טיפוליות צפויות רבות. לכן, התבוננות בדינמיקה לימפוציטים בתוך PPs מאפשר לנו להציץ בשלב מוקדם מאוד של דלקת ולבחון את התועלת של כמה תרופות מבטיחות.
השיטה כאן מתמקדת בהגירה של לימפוציטים ב PPs, הכולל מספר הליכים (קנולציה לתוך צינור בית החזה5 ואיסוף לימפוציטים ותצפית לטווח ארוך לאחר ההזרקה לתוך לימפוציטים שנאספו). מכיוון שהליכים אלה מורכבים והיה קשה לראות בדיוק כיצד כל הליך בוצע בדוחות קודמים, הזכרנו כאן כמה טיפים להשגת התבוננות מוצלחת. לדוגמה, התבוללות של הצינורות לתוך צינור בית החזה היה קשה מאוד, ואת שיעור ההצלחה הראשונית של קנול היה פחות מ 50%. עם זאת, שיפרנו את השיטה והשגנו שיעור הצלחה העולה על 80%. הזכרנו כמה טיפים אחרים בכתב יד זה הדרושים לתצפית המוצלחת כדי לאפשר הערכה כמותית של הגירה טרנסנדותלאלית של לימפוציטים במספר תנאים.
בדיווחים קודמים, היה קשה להבין את השינויים התלת מימדיים לאורך זמן, כגון הזרקה תוך ורידי של דיו הודו כדי להכתים את מבנה כלי הדם של PPs6, או מיקרוסקופ להיות מונופוקלי7. בשנים האחרונות, שיטה תצפיתית באמצעות כמה בעלי חיים מהונדסים חלבון פלואורסצנטי פוטו-מונברט כגון עכברי קדה הבהירו תנועות תאיות שיטתיות ב vivo8. המחקר השני הבהיר CD69 כיבוי עצמאי של יציאת לימפוציטים מ PPs9. השתמשנו במיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) בגלל היכולת האנליטית הגבוהה שלה. עכשיו אנחנו יכולים בקלות להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה ולהשתמש בהם כדי לנתח את הדינמיקה לימפוציטים.
בדו"ח זה, הדגמנו סדרה של שיטות להערכת נדידת לימפוציטים ב- PPs. ראשית, הראינו שיטות מעודנות של קנול צינור בית החזה כדי לאסוף לימפוציטים. שנית, שיפרנו את שיטות התצפית במספר דרכים לשמירה על איברים אובייקטיביים במידת האפשר תחת השגחה מיקרוסקופית, המאפשרת לנו להשיג תמונות באיכות גבוהה במשך 3 שעות. שלישית, כימתנו את התנועות התאיות של נדידת לימפוציטים כדי להעריך את ההשפעות של תרופות מסוימות. פרוטוקולים מותאמים אלה יתרמו לפיתוח הערכות אימונולוגיה ריר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים של המכללה הלאומית לביטחון רפואי (מס' 16058). בעלי החיים נשמרו על צ'או מעבדה סטנדרטי (CLEA יפן Inc, טוקיו, יפן). חיות המעבדה טופלו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות.
1. איסוף והפרדה של לימפוציטים
הערה: מאז לימפוציטים חייב להיות טרי ולא ניתן לאחסן, הם חייבים להיאסף מעכברושים עבור כל ניסוי. בנוסף, לימפוציטים במעיים טרופיים חייבים להיאסף ישירות מן צינור בית החזה שבו הם מסתובבים. כל ההליכים צפויים להסתיים בתוך 6 שעות, וכל המכשירים, הכפפות והמשטחים נקיים. על מנת לשמור על בעלי החיים במצב יציב מבחינה פיזיולוגית, כל מלוחים ונוזלים אחרים המשמשים בניסוי צריך להישמר חם.
- יוצרים צינור קנולציה (בקוטר 1 מ"מ) כמו עקומת הפרין (רדיוס של כ-5 מ"מ) לאחר טבילתו במים חמים (כ-80-90 מעלות צלזיוס) וממקמים אותו ללוח פלסטיק באמצעות סרט הדבקה לכמה שעות מראש.
- הרדמה עכברוש Wistar זכר (8-12 שבועות) עם הזרקה תוך-אישית של תערובת של Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ו Betulphar (2.5mg/kg) לחתוך את שיער הגוף של הבטן באמצעות קוצץ שיער. הסר את השיער בחוזקה לאחר הגילוח, כך השיער לא נכנס לחלל הבטן.
- לאחר אישור כי עומק יציב של הרדמה הנדרש עבור ההליך מתקבל על ידי קמצוץ בוהן, לבצע חתך עם מספריים כירורגיים אופקית מקו האמצע לאזור subcostal שמאל. היזהר לא לפגוע בכלי הדם בצפק הקודקודי על ידי צפייה בכלי הדם תחת אור.
- לעטוף את הבטן עם גזה רטובה ולהעביר את הבטן בעדינות ימינה מחוץ לגוף כדי לחשוף את האיברים retroperitoneal. הכנס חריץ בין שרירי הזקפה של עמוד השדרה לבין רקמת השומן באמצעות מספריים כירורגיים ולהפריד אותם בבוטות עם האצבעות.
- בזהירות להסיר את רקמת החיבור סביב צינור בית החזה. רקמת החיבור העודפת עולה עם הגיל. לחשוף את צינור בית החזה ממש מתחת לצלב השמאלי של הסרעפת caudally עד אורך 20 מ"מ של צינור בית החזה היה גלוי. הפרד בעדינות הידבקויות בין צינור בית החזה לבין אב העורקים באמצעות פינצטה מדויקת או ספוגיות כותנה רטובות.
- בצע תהליך זה בזהירות כי כמה חולדות יש arterioles הסתעפות מן עורק הבטן חוצה מעל צינור בית החזה או צינור בית החזה קצר בשל מיקום גבוה יותר של מקלעת הלימפה (צינורות בית החזה קטן מתפשט כמו קורי עכביש). הימנע ממגע מיותר לצינור בית החזה כדי למנוע גרימת בצקת.
- החל קשירה על ידי מחרוזת (3-0 משי) על צינור בית החזה ממש מתחת לצלב השמאלי של הסרעפת. צינור בית החזה הקאודלי מתרוקן.
- לעשות חור (קוטר 5 מ"מ) בקיר הבטן על ידי דקירת חוד החנית של מספריים כירורגיים, לעבור את צינור הקנול מעוקל סיכת ראש, ו ligate הצינור על שריר iliopsoas בשלב מסוים. ממלאים את צינור הקנולציה בתמיסת מלח רגילה המכילה הפרין 10 U/mL.
- לאחר הנחת מחרוזת (3-0 משי) מתחת לצינור בית החזה המנופח, דקרו את צינור בית החזה עם הקצה החתוך בחדות של צינור קנולציה, קנול אותו לכיוון הזנב כ -5 מ"מ, ו ligate צינור בית החזה עם צינור קנולציה עבור קיבוע.
- כדי לספק מלוחים למניעת התייבשות, ליצור חור (קוטר 3 מ"מ) על הקיר האצילי של antrum של הבטן באמצעות פינצטה מדויקת ולהעביר את צינור הסיליקון (2 מ"מ קוטר) לתריסריון דרך הטבעת pyloric. לאחר תפירת פצע ותחזוקת בעלי החיים בכלובים של בולמן, מתחילים להחדיר מלוחים עמוסי סוכר לתריסריון של כל חולדה מצינור הסיליקון בקצב זרימה של 3 מ"ל / שעה. מכסים את הכלוב כולו במגבת נייר כדי לחמם אותו.
- תקן את צינור הקנולציה לחור במרכז המכסה של צינור חרוט 50 מ"ל על קרח המכיל 6 U / mL הפרין, 10% סרום שור עוברי, ו RPMI 1640 בינוני (pH 7.4; ראה את שולחן החומרים), ולאסוף לימפוציטים צינור בית החזה (TDLs) על קרח. היזהר לא ליצור קשר עם קצה הצינור לקיר הצינור החרוטי כדי למנוע חסימה צינור קנולד עקב היווצרות קריש פיברין בתוך הצינור. נוזל הלימפה (כ 20 מ"ל) כולל כ 1.0 x 108~10 9 לימפוציטים ניתן להשיג ב 6 שעות. כדי להשיג את הלימפוציטים תחת הרדמה מלאה, מישור ההרדמה מנוטר וזרימת הלימפה נצפית כראוי. אותו הרדמה מתווספים באותה מנה כ -3 שעות לאחר חולדות מכניסים לכלוב של בלמן כדי לקבל הרדמה עמוקה ברציפות במשך 6 שעות.
2. לימפוציטים תיוג עם קרבוקסיפלואורסצין דיאצטט succinimidyl אסתר (CFDSE)
- להמיס CFDSE (שולחן החומרים) ב דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ל 15.6 מ"מ (500 מיקרוגרם של CFDSE מומס ב 60 μL של DMSO).
- לימפוציטים דגירה (1 x 108~ 109) ב 50 מ"ל של RPMI 1640 עם 50 μL של פתרון CFDSE במשך 30 דקות ב 37 °C (60 °F) כפי שתואר קודם לכן10.
3. התקנה ניסיונית למחקרים מיקרו-וסקולריים
- הרדמה חולדות המטופל (8-12 שבועות) עם הזרקה תוך-אישית של תערובת של Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg), ו Betulphar (2.5mg/kg) ולאשר את עומק ההרדמה על ידי קמצוץ בוהן. הרטב את הבטן לפני טיפוח הפרווה כדי למזער את זיהום השיער. ואז לפתוח את הבטן של החולדה וסטר המטופל באמצעות חתך קו האמצע.
- שים חולדה על צלחת נירוסטה ניידת (כ 120 x 300 מ"מ) עם חור מלבן סביב המרכז מכוסה שקופית זכוכית (24 x 50 מ"מ). בחר כ 10 ס"מ של קטע ileal כולל PPs לתצפית.
- שמור על המעי חם ככל האפשר ולח עם מלוחים אגירה פוספט (PBS) מחומם ל 37 מעלות צלזיוס. להשרות גזה המשמשת לכיסוי המעי הדק עם PBS.
- תוך מתן הרדמה רציפה עם 2 % איזופלורן (ראה טבלה של חומרים), לשים את השקופית על הבמה של המיקרוסקופ ולבחור אזורים מתאימים לתצפית של microcirculation ב PPs שבו כמה HEVs פועלים דרך serosa. PPs טווח בגודל; גדולים יותר מתאימים לתצפית על המיקרו-סירקולציה באמצעות CLSM. המעי הדק אינו ישר במקומות; קטע ישר באורך של לפחות 2 ס"מ ללא כל מתח מתאים לתצפית.
- מכסים את קטע המעיים הסמוך ואת mesentery עם כותנה סופג ספוג PBS. מניחים את קטע המעי בין שני כדורי כותנה מגולגלים וממקמים אותו ככל האפשר מגופו של החולדה כדי למנוע ממנו להיות רטט על ידי פעימות הלב של החולדה ונשימה.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל, להזריק לאט (מעל 1 דקות) CFSE שכותרתו TDLs (1 x 108 תאים) לתוך הווריד הצווארי של חולדות הנמען. זריקה תוך ורידי מהירה עשויה להשפיע על זרימת הדם המערכתית.
4. מיקרו-סירקולציה של לימפוציטים
- ניטור רציף TDLs microvasculature של PPs באמצעות CLSM ולהקליט במחשב במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות במרווחי זמן של 30 s. העומק מהסרוסה ל- HEV של PPs הוא כ -25 מיקרומטר, המאפשר תצפית של סטרומה וכלי לימפה נימי לעומק של 30 מיקרומטר.
- הזרק טקסס אדום-dextran (25 מ"ג / קילוגרם) לתוך הווריד הצווארי של כל חולדה המטופל להכתים את זרם הדם Hoechest 33342 (5 מ"ג / קילוגרם) כדי להכתים את גרעיני התא.
- (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' כדי לכמת את הדינמיקה לימפוציטים, להגדיר לימפוציטים דבקים HEVs יותר מ 30 שניות כמו "לימפוציטים דבק" ולימפוציטים מהגרים מ HEVs כדי סטרומה כמו "'לימפוציטים נודדים". לאחר מכן לחשב את האחוז הממוצע של הגירה (לימפוציטים נודדים / לימפוציטים דבק + לימפוציטים נודדים) לכל שדה ראייה (כ 0.3 מ"מ2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איסוף לימפוציטים מהלימפה
כדי להכין את החולדה לתעלת בית החזה, בצעו חתך בצינור בית החזה המתוח כפי שמוצג באיור 1 ולאחר מכן שמרו את החולדה בכלוב בולמן כפי שמוצג באיור 2.
כאשר לימפוציטים נאספים היטב, אנחנו יכולים להשיג על 20 מ"ל / 6 h נוזל הלימפה המכיל כ 107~ 108/ mL לימפוציטים. מתוך TDLs, 70% אקספרס CD4, ביניהם כ 90% תאים להביע CD62L, כלומר הרכב העיקרי של TDLs (>60%) מורכב לימפוציטים נאיביים במעיים טרופיים. מאז לימפוציטים שנאספו כאן הם תאים במיוחד לנדוד למערכת העיכול, הם מתאימים להערכת מצב ההגירה במדבקות של פייר.
תצפית מיקרוסקופית
לאחר הזרקת מנה מספקת של לימפוציטים פלואורסצנטיים, עלו על מעי החולדה של המטופל על מגלשת זכוכית כפי שמוצג באיור 3. תמונה מיקרוסקופית של PPs במצב פיזיולוגי מוצגת באיור 4.
לתצפית מיקרו, חולדות ניתן לרודים ביציבות תחת לפרוטומיה במשך כ 3 שעות. לימפוציטים לדבוק HEVs, רול, לנדוד סטרומה שמסביב, ולאחר מכן לנדוד נימים הלימפה. כימתנו והערכנו את אחוז הלימפוציטים שהיגרו בסטרומה בתוך תקופת התצפית.
לאחר הזרקת מנה נאותה של לימפוציטים פלואורסצנטיים, לימפוציטים טרופיים במעיים מתחילים לדבוק ב- HEVs ונודדים על פני האנדותל לתוך הסטרומה תוך כשעה. רוב לנוע בתוך סטרומה, בעוד שאחרים נודדים נימים לימפה בתוך כ 2-3 שעות. פלואורסצנטי מפותח תיוג ex vivo במחקר זה הביא בעוצמה גבוהה וזה מאפשר לנו להתבונן דינמיקה לימפוציטים של אזור עמוק מאוד. בנוסף, באמצעות סוג אחר של תיוג פלואורסצנטי, אנו יכולים בקלות להתבונן בדינמיקה מסוג אחר של לימפוציטים בו זמנית. נדידת לימפוציטים טרופית זו יכולה להיות ברורה ויזואלית לדיכוי על ידי כמה immunomodulators כגון FTY720 כפי שמוצג בדו"ח הקודם שלנו.
התבוננות במערכת microcirculatory עצמה קשה מאוד, ורצוי לקבוע שיטת הערכה קלה. מחקר זה גם אפשר לגלות היכן נמצא אתר הפעולה של התרופה במדבקות של פייר. בפרט, לשעבר ויוו הממשל של FTY720 כדי לימפוציטים אפשר להגביל את אתר הפעולה רק לימפוציטים אבל לא אנדותל. בשילוב עם מיון של לימפוציטים ספציפיים, תוצאות מפורטות יותר יתקבלו.
איור 1: הליך לחשיפת צינור בית החזה ולביצוע קנולציה. לאחר חיתוך הצפק longitudinally, צינור בית החזה יכול להיחשף על ידי הזזת הבטן בגולגולת וניתוח רקמת החיבור בצד ימין הגבי של העורקים הבטן. יש לנתח בזהירות את רקמת החיבור סביב הסרעפת כדי למנוע פגיעה. צינור בית החזה צריך להיחשף רחב ככל האפשר בגולגולת כדי ליצור מספיק מקום עבור קנולציה ולאחר מכן רץ על ידי תפר משי 3-0 רק מתחת לסרעפת כדי לעצור את זרימת הלימפה ולשמור על הנוזל caudally. נוזל לימפה חלבי גלוי דרך צינור הלימפה, שבו קטטר ניתן להכניס. צינור בית החזה של החולדה צריך להיות מתוח מעט כדי להבטיח קנולציה חלקה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונה של ההגדרה כולה לאיסוף לימפוציטים של צינור בית החזה (TDLs). החולדות נשמרות בכלובים של בולמן ו- TDLs נאספים דרך צינור הקנולציה לתוך כל בקבוקון. הבקבוקונים מוגדרים על קרח ומוחלפים כל 12 שעות כדי לאסוף נוזל לימפה טרי. מלוחים עמוסי סוכר מנוהלים באמצעות צינור סיליקון באמצעות משאבת מזרק בקצב של כ 3 מ"ל / שעה כדי למנוע התייבשות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: החולדה מועלית על במת המיקרוסקופ המחוברת למכונת ההרדמה, וחומר פלואורסצנטי או לימפוציטים בעלי תווית פלואורסצנטית מוזרקים מהקטטר הורידי דרך הווריד הצווארי הפנימי (A). אזור התצפית של מערכת העיכול תוקן בעדינות בין שני כדורי כותנה מגולגלים. מערכת העיכול תוקנה הרחק מתא המטען כדי למנוע רטט על ידי תנועות נשימה. כדורי כותנה מגולגלים היו ספוגים מלוחים אגירת פוספט כדי למנוע ייבוש של המעי במהלך תקופת התצפית (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונה מיקרוסקופית של כתמי פייר במצב הפיזיולוגי (A). הגרעינים של תאי אנדותל כלי הדם מוכתמים בכחול. פלזמת הדם אדומה, וזרימת הדם מזוהה על ידי זרימת תאים לא מוכתמים. לימפוציטים טרופיים במעיים (ירוק מוכתם) היצמדות לוורידים אנדותל גבוהים (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן תיארנו פרוטוקול לאיסוף לימפוציטים נאיביים במעיים ולהתבוננות בנדידתם בחולדות PPs. הליכים אלה יכולים לחשוף כיצד לימפוציטים לנוע microvasculature של PPs ומאפשרים להשוות חזותית את הדינמיקה שלהם תחת מצב נורמלי או תרופות. התצפית הישירה של דינמיקה זו יש הרבה ערך כדי לקבל רמז לשינוי חיסוני על ידי תרופות מסוימות, אם כי תקופת התצפית מוגבלת רק כמה שעות.
הזכרנו כמה טיפים בשיטות. ביניהם, אחד ההליכים העדינים ביותר הוא כי המפעיל חייב cannulate צינור בית החזה במהירות ובדיוק. אם ניתוח לוקח זמן רב כרוך נזק מיותר, דימום משמעותי ודלקת להתרחש, וכתוצאה מכך אוסף TDL ירד עקב בצקת של רקמת החיבור וחסימת צינור בית החזה. נהגנו לסנוור את הצינור לאחר יצירת חתך קטן בצינור בית החזה באמצעות מספריים עם חוד החנית קטן. עם זאת, הליך זה מפריע לאתר הקנולציה עקב ניקוז הלימפה. לכן, עכשיו אנחנו לא חותכים את צינור בית החזה; במקום זאת, אנחנו דוקרים אותו עם קצה חד. שיטה זו מקלה על הקנדול ומגדילה את שיעורי ההצלחה. בנוסף, אתר החתך בצינור בית החזה חשוב מאוד בגלל חלל הבטן המוגבל. אם אתר החתך קרוב מדי לסרעפת, החלק המעוקל של צינור הקנדולה יתנגש בסרעפת. אם זה רחוק מדי מן הסרעפת, זה גם קשה cannulate הצינור עמוק מספיק כדי להבטיח קיבעון בשל מקלעת הלימפה של צינור בית החזה caudal. גם במקרים של קנולציה טובה, צינור הצינור קנולציה ניתן לחסן בקלות על ידי היווצרות פיברין. לכן, אנו ממליצים מדי פעם בעדינות לשטוף את הצינור עם הפרין.
ההתקדמות האחרונה ב- CLSM אפשרה להתבונן באזור הממוקד בצורה ברורה ומדויקת יותר בזמן אמת בהשוואה למחקר קודם11. עכשיו אנחנו משתמשים CLSM במעבדה שלנו, אבל אנחנו יכולים לצפות microcirculation בצורה ברורה יותר באמצעות מיקרוסקופ מולטי פוטון. למרות שהפרוטוקול דורש שינוי במספר נקודות יחד עם התקדמות טכנית, הוא מאפשר תצפית על האזור המקומי של איבר העניין12,13.
היתרון והמפתח של השיטה הוא שהיא כרוכה בהפרדת לימפוציטים מבעלי חיים נמענים, דגירה אותם באמצעות כל סוג של תרכובות במבחנה, והתבוננות בהם לאחר הזרקתם לבעלי חיים המטופל. זה מאפשר להבהיר את ההשפעות של לימפוציטים לבד. להיפך, אם אנחנו רוצים להבהיר את ההשפעות של כל סוג של תרכובות על תאים שאינם לימפוציטים, כגון אנדותל כלי הדם, אנו יכולים לטפל בבעלי חיים המטופל עם כל סוג של תרכובות ולצפות בהם לאחר הזרקת לימפוציטים שליטה. כדי להבהיר את אותם הדברים באמצעות עכברים, עלינו ליצור בעלי חיים מותנים שעברו מניפולציה גנטית בזה אחר זה. בנוסף, מיון לימפוציטים מבודדים באמצעות סמן משטח ספציפי יאפשר ללמוד את הדינמיקה של סוגים מסוימים של לימפוציטים.
כפי שמוצג בסרטון של מחקר זה, לימפוציטים לנוע ללא הגבלת זמן לרוחב דרך אנדותל כלי הדם של הגוף בפועל, ולכן קשה להעריך את ההשפעות על התנהגותם באמצעות תצפיות vivo בלבד. יתר על כן, אם יש לבחון את מנגנון הפעולה של תרופה מנוהלת, זה במקור לא מתאים לבדיקת כל אתר פעולה. היתרון של מחקר זה הוא כי על ידי הפרדת לימפוציטים והדגרת אותם במבחנה, ההשפעות הרפואיות ניתן לבחון בנפרד על הצדדים כלי הדם והלימפוציטים. פחות משתנים קלים לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכללה הלאומית לביטחון רפואי ועל ידי מענק מחקר במדעי הבריאות והעבודה למחקר על מחלות עקשניות ממשרד הבריאות, העבודה והרווחה, יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B.
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
