Summary
在这里，我们描述了一个精确的方法，收集胸管淋巴细胞和观察肠道热带淋巴细胞在老鼠Peyer的补丁的迁移3小时使用延时摄影。这项技术可以澄清淋巴细胞的动态在炎症条件下是如何受到影响的。
Abstract
天真的淋巴细胞在生理条件下从血液循环到淋巴组织，被公认为肠道免疫中的一个重要现象。二级淋巴细胞器官的频谱，如Peyer的斑块（PPs）或中性淋巴结，是天真淋巴细胞感知抗原的地方。天真的淋巴细胞通过血液循环，以达到高内皮静脉，进入PP的入口。据估计，一些免疫调节器会影响淋巴细胞迁移，但对微循环动力学的精确评估非常困难，建立体内淋巴细胞迁移观测方法有助于澄清精确机制。我们改进了从淋巴管中收集淋巴细胞的方法，并观察了大鼠PP中肠道淋巴细胞的详细动态。我们选择了折叠式激光扫描显微镜来观察体内的老鼠PP，并使用延时摄影进行记录。我们现在可以获得清晰的图像，有助于淋巴细胞动力学的分析。
Introduction
佩耶的斑块（PPs）由小肠的拉米纳柱状物中的数百个淋巴状毛囊组成。PPs分为卵泡、间曲区域和位于毛囊下部的细菌中心，其中淋巴细胞受到抗原表现的刺激。没有发泄淋巴血管，抗原通过上皮细胞层从肠道流明侵入拉米纳丙酸。覆盖淋巴卵泡的上皮区域称为卵泡相关上皮，其中专门穿插M细胞吸收粘膜抗原。M细胞从发光侧摄取抗原，然后由支气管细胞捕获抗原，并呈现给通过高内皮静脉（HEV）1的内皮流入PP的天真淋巴细胞。PPs在肠道免疫中起着重要作用，与炎症的早期阶段有关。许多分子相互作用涉及淋巴细胞进入二级淋巴器官（SLOs），包括粘附分子、化疗因子2、3和磷酸-1-磷酸盐4：因此，有许多预期的治疗目标。因此，观察PP内淋巴细胞动力学使我们能够瞥见炎症的早期阶段，并检查几种有希望的药物的用处。
这里的方法侧重于PP中淋巴细胞的迁移，其中包括几个程序（可以进入胸管5， 收集淋巴细胞和注射到收集淋巴细胞后的长期观察）。由于这些程序很复杂，很难确切地看到以前的报告中每个程序是如何执行的，因此我们在这里提到了一些实现成功观察的技巧。例如，将管子插入胸管非常困难，制精的初始成功率不到50%。然而，我们改进了方法，成功率超过80%。我们在此手稿中提到了一些其他提示，这些提示对于成功观测以实现对淋巴细胞在若干条件下的跨内皮迁移进行定量评估是必要的。
在以前的报告中，很难理解随着时间的推移的三维变化，如静脉注射印度墨水染色PP6的血管结构，或显微镜是单焦7。近年来，利用凯德小鼠等一些光可转换荧光蛋白转基因动物的观察方法，澄清了体内的系统细胞运动。另一项研究澄清了CD69从PP9独立关闭淋巴细胞出口。由于其高分析能力，我们使用共分体激光扫描显微镜 （CLSM）。现在，我们可以很容易地获得高分辨率图像，并用它来分析淋巴细胞动力学。
在这份报告中，我们演示了一系列评估PP淋巴细胞迁移的方法。首先，我们展示了收集淋巴细胞的胸管罐装的精制方法。其次，我们改进了观察方法，在微观观测下尽可能保持客观器官，从而能够获得3小时的高质量图像。第三，我们量化淋巴细胞迁移的细胞运动，以评估某些药物的影响。这些修改后的协议将有助于开展粘膜免疫学评估。
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Protocol
实验方案经国防医学院动物研究委员会批准（第16058号）。这些动物被保存在标准实验室周（CLEA日本公司，东京，日本）。实验室动物按照国家卫生研究院的指导方针进行治疗。
1. 淋巴细胞的收集和分离
注：由于淋巴细胞必须是新鲜的，不能储存，因此每次实验都必须从大鼠那里收集淋巴细胞。此外，肠道热带淋巴细胞必须直接从它们循环的胸管中收集。所有程序预计将在 6 小时内完成，所有仪器、手套和表面均清洁。为了使动物保持生理稳定状态，实验中使用的所有盐水和其他液体都应保持温暖。
- 将大麻管浸入热水（约80-90°C）后，形成一个像肝素曲线（半径约5毫米）一样的制罐管（直径1毫米），并提前几个小时用胶带将其固定在塑料板上。
- 麻醉雄性威斯塔大鼠（8-12周），腹腔内注射米达佐兰（2毫克/千克）、多米托（0.15毫克/千克）和贝图尔帕尔（2.5毫克/千克）的混合物，并用剪发器剪下腹部的体毛。剃须后牢固地取出头发，使头发不会进入腹腔。
- 在确认手术所需的麻醉深度稳定后，通过脚趾捏捏，从中线到左下部区域水平用手术剪刀切口。小心不要通过观察光下的血管来损坏腹膜内的血管。
- 用湿纱布包裹胃部，将胃轻轻地移到身体的右侧，以揭示反胃器官。使用手术剪刀在脊柱直立肌肉和脂肪组织之间插入一个缺口，并用手指将它们直接分离。
- 小心地剥去胸管周围的结缔组织。多余的结缔组织会随着年龄的增长而增加。从隔膜的左十字下方露出胸管，直到可见胸管的20毫米长度。使用精密钳子或湿棉棉签轻轻地将胸管和主动脉之间的粘附物分开。
- 仔细执行这个过程，因为一些大鼠有动脉从腹部动脉分支穿过胸管或短胸管由于淋巴丛（小胸管像蜘蛛网一样蔓延）的较高位置。避免不必要的接触胸管，以避免诱发水肿。
- 在隔膜左十字下方的胸管上用绳子（3-0丝）涂上连结。胸腔胸管变得分散。
- 通过刺穿手术剪刀的尖端，通过发夹弯曲的针管，并在某一点上将管子放到 iliopsoas 肌肉上，在腹部壁上打一个洞（直径 5 毫米）。用含有10U/mL肝素的普通盐水填充罐装管。
- 在松开的胸管下放置一根绳子（3-0根丝绸）后，用罐管的锋利边缘刺穿胸管，将其朝向尾巴约5毫米，用罐装管将胸管固定。
- 为了提供盐水以防止脱水，使用精密钳子在胃的蚂蚁前壁上创建一个孔（直径3毫米），并通过火焰环将硅管（直径2毫米）传给十二指肠。缝合伤口并维持波尔曼笼中的动物后，开始以3mL/h的流动速度从硅管中将含糖盐水注入每只老鼠的十二指肠。用纸巾盖住整个笼子，让它保暖。
- 将制冷管固定在冰上含有6 U/mL肝素、10%胎儿牛血清和RPMI 1640介质（pH 7.4;见材料表）的50mL圆锥管盖的孔中，并在冰上收集胸管淋巴细胞（TDLs）。小心不要将管子的尖端接触到圆锥管的壁上，以防止由于管内纤维蛋白血块的形成而导致的罐管闭塞。淋巴液（约20 mL），包括约1.0 x 108~109淋巴细胞可以在6小时内获得。为了在完全麻醉下获得淋巴细胞，对麻醉平面进行监测，并适当观察淋巴流量。同样的麻醉剂在老鼠被放入鲍尔曼的笼子后大约3小时以同样的剂量添加，以连续接受6小时的深度麻醉。
2. 淋巴细胞标签与卡盒氟雷西汀二乙酸苏奇米迪尔酯 （CFDSE）
- 溶解 CFDSE （材料表） 在二甲基硫化物 （DMSO） 到 15.6 mM （500μg 的 CFDSE 溶解在 60 μL 的 DMSO）。
- 在RPMI 1640的50 mL中孵化淋巴细胞（1 x 108~109），在37°C下孵化50微升的CFDSE溶液，30分钟，如前10次所述。
3. 微血管研究实验设置
- 麻醉接受者大鼠（8-12周）与腹膜注射的混合物米达佐兰（2毫克/公斤），多米托（0.15毫克/公斤）和贝图尔帕尔（2.5毫克/公斤），并通过脚趾捏确认麻醉的深度。在梳理毛皮之前将腹部弄湿，以尽量减少头发污染。然后通过中线切口打开接受者威斯特大鼠的腹部。
- 将鼠放在便携式不锈钢板上（约 120 x 300 mm），中心周围有一个长方形孔，上面覆盖着玻璃滑梯（24 x 50 mm）。选择约10厘米的伊利尔段，包括PP进行观察。
- 保持肠道尽可能温暖和潮湿与磷酸盐缓冲盐水（PBS）加热到37°C。 浸泡纱布，用于覆盖小肠与PBS。
- 同时用2%的异氟化物进行连续麻醉（见材料表），将滑梯放在显微镜的舞台上，并选择合适的区域来观察一些高清病毒穿过血清的PP中的微循环。PP 的大小范围;较大的适合使用 CLSM 观察微循环。小肠在有些地方不直：一个至少2厘米长的直段，没有任何张力是适合观察。
- 覆盖相邻的肠道部分，用浸泡在PBS的吸水棉中浸泡。将肠道部分放置在两个轧制的棉球之间，并尽可能将其从大鼠体内放置，以防止它被老鼠的心跳和呼吸振动。
- 使用 1 mL 注射器，缓慢地将 （超过 1 分钟） CFSE 标记的 TDLs （1 x 108 细胞） 注射到受体大鼠的血管中。快速静脉注射可能会影响系统循环。
4. 淋巴细胞的微循环
- 使用 CLSM 持续监控 PP 微血管中的 TDL，并每隔 30 分钟在计算机上使用延时摄影记录 3 小时。从塞罗萨到PP的 HEV 深度约为 25μm，使对频闪和毛细血管的观测深度达到 30μm。
- 将得克萨斯红-德克斯特兰（25毫克/千克）注射到每个受体大鼠的血管中，以弄脏血液，将霍赫斯特33342（5毫克/千克）染色细胞核。
- （可选）要量化淋巴细胞动力学，将粘附于 HEV 的淋巴细胞定义为"粘合淋巴细胞"，将从 HEV 迁移到频闪的淋巴细胞定义为"迁移淋巴细胞"。然后计算每个视野（约0.3毫米2）迁移的平均百分比（迁移淋巴细胞/粘合淋巴细胞+迁移淋巴细胞）。
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Representative Results
从淋巴中收集淋巴细胞
要为大鼠准备胸管罐头，如 图1 所示，在紧张的胸管中切口，然后将大鼠维持在波尔曼的笼子中，如 图2所示。
当淋巴细胞收集良好时，我们可以获得约20 mL/6 h淋巴液，含有约107~108/mL淋巴细胞。在 TDL 中，70% 的快速 CD4，其中约 90% 的细胞表示 CD62L，这意味着 TDL 的主要组成（+60%）由天真的肠道热带淋巴细胞组成。由于这里收集的淋巴细胞是专门迁移到肠道的细胞，因此它们适合评估Peyer斑块的迁移状态。
微观观察
注射足够剂量的荧光淋巴细胞后，将接受者大鼠的肠子安装在玻璃滑梯上，如 图3所示。图 4中显示了生理条件下的PP的微观图像。
对于微观观察，大鼠可以在腹腔切除术下稳定麻醉约3小时。淋巴细胞粘附在 HEV 上，滚动并迁移到周围的频闪，然后迁移到淋巴毛细血管。我们量化和评估了在观测期内在频闪中迁移的淋巴细胞的百分比。
注射足够剂量的荧光淋巴细胞后，肠道热带淋巴细胞开始粘附在 HEV 上，并在大约 1 小时内穿过内皮迁移到频闪中。大多数在频闪中移动，而其他人在大约2-3小时内迁移到淋巴毛细血管。本研究中发育良好的荧光标记前体产生高强度，使我们能够观察非常深区域的淋巴细胞动力学。此外，通过使用另一种荧光标签，我们可以轻松地同时观察不同类型的淋巴细胞的动态。如我们上一份报告所示，这种肠道淋巴细胞迁移可以通过视觉上澄清，以便一些免疫调节剂（如 FTY720）进行抑制。
观察微循环系统本身是极其困难的，建立一种简单的评估方法是可取的。这项研究也使得有可能找出药物的动作部位在佩耶的斑块中的位置。特别是，FTY720淋巴细胞的前体内管理使得将活动地点限制在淋巴细胞上，而不能限制在内皮细胞上。结合特定淋巴细胞的排序，将取得更详细的结果。
图1：暴露胸管和进行制罐程序。 纵向切开腹膜后，胸管可以通过颅内移动和解剖腹部主动脉右侧的结缔组织来暴露。应仔细解剖隔膜周围的结缔组织，以防止损伤。胸管应尽可能宽地暴露，以创造足够的空间进行凝固，然后用隔膜下方的3-0丝缝线固定，以阻止淋巴的流动，并保持液体。通过淋巴管可以看到乳白色淋巴液，在那里可以插入导管。大鼠的胸管应稍微拉紧，以确保顺利的吞食。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：收集胸管淋巴细胞（TDLs）的整个设置的图像。 老鼠被关在波尔曼的笼子里，TDL通过罐装管收集到每个小瓶中。小瓶被设置在冰上，每12小时更换一次，以收集新鲜的淋巴液。含糖盐水通过硅胶管使用注射器泵以大约3 mL/h的速度施用，以防止脱水。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3： 大鼠被置于与麻醉机相连的显微镜舞台上，通过静脉注射荧光物质或荧光标记淋巴细胞。肠道的观察区域被轻轻地固定在两个轧制的棉球之间。肠道被固定在远离躯干的地方，以避免呼吸运动引起的振动。轧制的棉球浸泡在磷酸盐缓冲盐水中，以防止在观察期间（B）干燥肠道。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：佩耶在生理状况下斑块的微观图像（A）。血管内皮细胞的核染成蓝色。血浆是红色的，血流通过未染色细胞的流动来检测。胶质淋巴细胞（染色绿色）粘合高内皮静脉（B）。请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了收集天真的肠道热带淋巴细胞和观察它们在大鼠PPS中的迁移的协议。这些程序可以揭示淋巴细胞在PP的微血管中如何移动，并使得在正常或用药条件下对它们的动态进行视觉比较成为可能。直接观察这些动态有很多优点，以获得一些药物的免疫修饰的线索，虽然观察期仅限于几个小时。
我们在方法中提到了一些提示。其中，最微妙的程序之一是操作员必须快速准确地对胸管进行制导。如果手术需要很长时间，并涉及不必要的损害，发生明显的出血和炎症，导致TDL收集减少，由于结缔组织水肿和胸管阻塞。我们过去常常用小刀尖的剪刀在胸管上制造一个小切口后，对管子进行精制。然而，由于淋巴排干，此过程会干扰罐装部位。因此，现在我们不切断胸管：相反，我们刺它与尖锐的边缘。这种方法使制精更容易，并增加了成功率。此外，由于腹腔有限，胸管中的切口位非常重要。如果切口部位离隔膜太近，导管的弯曲部分会碰到隔膜。如果它离隔膜太远，也很难将管子深到足以确保固定，因为胸管的淋巴丛。即使在良好的罐装的情况下，罐装管也很容易被纤维蛋白形成遮挡。因此，我们建议定期用肝素轻轻冲洗管子。
与之前的研究11相比，CLSM的最新进展使得能够更清晰、更精确地实时观察重点区域。我们现在在实验室中使用 CLSM，但我们可以使用多光子显微镜更清楚地观察微循环。虽然该议定书需要随着技术进步在几个方面进行修改，但它能够观察利益机关12、13的局部区域。
该方法的优点和关键是，它涉及将淋巴细胞与受体动物分离，在体外使用任何化合物孵育它们，并在注射到受体动物体内后观察它们。这使得单独阐明淋巴细胞的影响成为可能。相反，如果我们想要阐明任何种类的化合物对淋巴细胞以外的细胞的影响，如血管内皮，我们可以用任何化合物治疗受体动物，并在注射对照淋巴细胞后观察它们。为了用老鼠阐明同样的事情，我们必须一个接一个地创造有条件的基因操纵动物。此外，使用特定的表面标记对分离的淋巴细胞进行排序，将有可能研究特定类型的淋巴细胞的动态。
如本研究的视频中所示，淋巴细胞在实际身体的血管内脏中无限期和横向地移动，因此很难仅使用体内观察来评估其行为的影响。此外，如果要检查所管理药物的行动机制，它最初不适合检查每个行动地点。这项研究的优点是，通过分离淋巴细胞并在体外孵育，可以在血管和淋巴细胞两侧分别检查药效。更少的变量更容易分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国防医学院的资助以及日本卫生、劳动和福利省为研究棘手疾病而提供的健康和劳动科学研究补助金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
