Mikroskopisk observation af lymfocytdynamik i Rotte Peyers patches

Summary

Her beskriver vi en præcis metode til indsamling af thoraxkanallymfocytter og observation af migrationen af tarmtropiske lymfocytter i rotte Peyers pletter i 3 timer ved hjælp af time-lapse fotografering. Denne teknik kan afklare, hvordan dynamikken i lymfocytter påvirkes under inflammatoriske tilstande.

Abstract

Naive lymfocytter recirkulerer fra blodet til lymfoide væv under fysiologisk tilstand, og det er almindeligt anerkendt som et vigtigt fænomen i tarmens immunitet. Stroma af sekundære lymfoide organer, såsom Peyer's patches (PPs) eller mesenteric lymfeknuder, er, hvor naive lymfocytter forstand antigener. Naive lymfocytter cirkulerer gennem blodbanen for at nå høje endotel venules, portalen for indrejse i PPs. Nogle immunmodulatorer skønnes at påvirke lymfocytmigrationen, men den præcise vurdering af mikrocirkulationsdynamikken er meget vanskelig, og etablering af en metode til at observere lymfocytmigration in vivo kan bidrage til afklaringen af de præcise mekanismer. Vi raffinerede metoden til indsamling af lymfocytter fra lymfekanalen og observerede den detaljerede dynamik i tarm-trope lymfocytter hos rotteP'er. Vi valgte confocal laserscanning mikroskopi til at observere rotteP'er in vivo og indspillede det ved hjælp af time-lapse fotografering. Vi kan nu få klare billeder, der kan bidrage til analysen af lymfocytdynamik.

Introduction

Peyer's patches (PPs) består af hundredvis af lymfoid follikler i lamina propria af tyndtarmen. PPs er opdelt i follikler, den interfollicular region, og germinal centre placeret i den nederste del af folliklerne, hvor lymfocytter stimuleres af antigen præsentation. Der er ingen afferente lymfekar, og antigene invaderer lamina propria fra tarm lumen via epitelcellelaget. Den epitel region, der dækker lymfoid follikler kaldes follikel-associeret epitel, inden for hvilken specialiserede afbrudte M-celler optagelse slimhindeantigener. M celler tage i antigener fra luminal side og antigener er derefter fanget af dendritiske celler og præsenteres mod naive lymfocytter, der strømmer ind i PPs gennem endothelium af høje endotel venules (HEVs)¹. PPs spiller en vigtig rolle i tarmimmunitet og er relateret til den tidlige fase af inflammation. Mange molekylære interaktioner involverer indgangen til lymfocytter til sekundære lymfoide organer (SLOs), herunder vedhæftningsmolekyler, kemokiner^2,3og sphingosin-1-fosfat⁴; der er således mange forventede terapeutiske mål. Derfor gør observation af lymfocytdynamikken inden for PPs det muligt for os at få et glimt af det meget tidlige stadium af inflammation og undersøge nytten af flere lovende lægemidler.

Metoden her fokuserer på migration af lymfocytter i PPs, som omfatter flere procedurer (cannulation i brystkanalen⁵ og indsamling lymfocytter og langsigtet observation efter injektionen i indsamlede lymfocytter). Da disse procedurer er komplekse, og det var vanskeligt at se nøjagtigt, hvordan hver procedure blev udført i tidligere rapporter, nævnte vi her nogle tips til at opnå en vellykket observation. For eksempel var cannulation af rørene i brystkanalen meget vanskelig, og den oprindelige succesrate for cannulation var mindre end 50%. Vi forbedrede imidlertid metoden og opnåede en succesrate på over 80 %. Vi nævnte nogle andre tips i dette manuskript, der er nødvendige for en vellykket observation for at muliggøre den kvantitative evaluering af transendotelmigrationen af lymfocytter under flere forhold.

I tidligere rapporter var det svært at forstå de tredimensionelle ændringer over tid, såsom intravenøs injektion af indisk blæk for at plette den vaskulære struktur af PPs⁶, eller mikroskopet er monofokal⁷. I de senere år har en observationsmetode ved hjælp af nogle fotokonvertible fluorescensproteintransgene dyr som Kaede mus afklaret systematiske cellulære bevægelser in vivo⁸. Den anden undersøgelse præciseret CD69 uafhængig nedlukning af lymfocyt udgang fra PPs⁹. Vi brugte confocal laserscanning mikroskopi (CLSM) på grund af sin høje analytiske kapacitet. Nu kan vi nemt få billeder i høj opløsning og bruge dem til at analysere lymfocytdynamik.

I denne rapport demonstrerede vi en række metoder til evaluering af lymfocytmigration i PPs. For det første viste vi raffinerede metoder til thoraxkanal cannulation at indsamle lymfocytter. For det andet forbedrede vi observationsmetoderne på flere måder for at opretholde objektive organer, når det var muligt under mikroskopisk observation, så vi kunne få billeder i høj kvalitet i 3 timer. For det tredje kvantificerede vi de cellulære bevægelser af lymfocytmigration for at evaluere virkningerne af nogle medikamenter. Disse ændrede protokoller vil bidrage til udviklingen af slimhinde immunologi evalueringer.

Protocol

Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Animal Research Committee of National Defense Medical College (nr. 16058). Dyrene blev vedligeholdt på standardlaboratoriet chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan). Forsøgsdyrene blev behandlet i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer.

1. Indsamling og adskillelse af lymfocytter

BEMÆRK: Da lymfocytter skal være friske og ikke kan opbevares, skal de opsamles fra rotter til hvert forsøg. Desuden skal tarm-trope lymfocytter indsamles direkte fra brystkanalen, hvor de cirkulerer. Alle procedurer forventes afsluttet inden for 6 timer, og alle instrumenter, handsker og overflader er rene. For at holde dyrene i fysiologisk stabil tilstand bør alle saltvand og andre væsker, der anvendes i forsøget, holdes varme.

1. Der dannes et kannulationsrør (1 mm i diameter) som en heparinkurve (en radius på ca. 5 mm) efter at have dyppet det i varmt vand (ca. 80-90 °C) og fastgør det til et plastbræt ved hjælp af tape i et par timer i forvejen.
2. Bedøve en mandlig Wistar rotte (8-12 uger) med intraperitoneal injektion af en blanding af Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg), og Betulphar (2.5mg/kg) og klippe kropsbehåring i maven ved hjælp af en hårklipper. Fjern håret fast efter barbering, så håret ikke kommer ind i bughulen.
3. Efter at have bekræftet, at den stabile dybde af anæstesi, der kræves til proceduren, opnås ved tåklempning, skal du lave et snit med kirurgisk saks vandret fra midterlinjen til venstre subcostalområde. Pas på ikke at beskadige blodkarrene i parietal peritoneum ved at se fartøjerne under lys.
4. Wrap maven med våd gaze og flytte maven forsigtigt til højre uden for kroppen for at afsløre retroperitoneal organer. Indsæt et hak mellem erector musklerne i rygsøjlen og fedtvævet ved hjælp af kirurgisk saks og stumpt adskille dem med fingrene.
5. Fjern forsigtigt bindevævet omkring brystkanalen. Det overskydende bindevæv stiger med alderen. Udsæt brystkanalen fra lige under mellemgulvets venstre crus caudally, indtil en 20 mm længde af brystkanalen var synlig. Adskil forsigtigt vedhæftninger mellem brystkanalen og aorta ved hjælp af præcisionscetter eller våde vatpinde.
   1. Udfør denne proces omhyggeligt, fordi nogle rotter har arterioler forgrening fra abdominal arterie passage over brystkanalen eller en kort brystkanal på grund af en højere placering af lymfeknuder plexus (små thorax kanaler breder sig som edderkoppespind). Undgå unødvendig kontakt til brystkanalen for at undgå at fremkalde ødem.
6. Påfør en ligatur med en snor (3-0 silke) på brystkanalen lige under mellemgulvets venstre crus. Den kaudale brystkanal bliver udspilet.
7. Lav et hul (5 mm diameter) i bugvæggen ved at stikke skærkanten af kirurgisk saks, passere hårnål-buet cannulation rør, og ligate røret på iliopsoas muskel på et tidspunkt. Fyld kannulationsrøret med normal saltvand indeholdende 10 U/mL heparin.
8. Efter at have placeret en streng (3-0 silke) under den udspilede brystkanal, stikke brystkanalen med den skarpt afskårne kant af et kannulationsrør, kannulere den mod halen ca. 5 mm og ligate brystkanalen med kannulationsrør til fiksering.
9. For at levere saltvand for at forhindre dehydrering skal du oprette et hul (3 mm diameter) på den forreste væg af antrum i maven ved hjælp af præcisionstweezere og overføre siliciumrøret (2 mm i diameter) til duodenum gennem pyloric ringen. Efter at have syet et sår og opretholdt dyrene i Bollmans bure, skal du begynde at indgyde sukkerbelastet saltvand i hver rottes duodenum fra siliciumrøret med en strømningshastighed på 3 mL/h. Dæk hele buret med et køkkenrulle for at holde det varmt.
10. Kannulationsrøret fastgøres til hullet i midten af låget på et 50 mL konisk rør på is, der indeholder 6 U/mL heparin, 10% føtalt kvægserum og RPMI 1640-medium (pH 7.4; se materialetabellen) og opsamle thoraxkanallymfocytter (TDL'er) på is. Pas på ikke at kontakte spidsen af røret til væggen i koniske rør for at forhindre cannulated-tube okklusion på grund af fibrin blodprop dannelse inde i røret. Lymfevæske (ca. 20 mL), herunder ca. 1,0 x 10⁸~10⁹ lymfocytter, kan fås på 6 timer. For at opnå lymfocytterne under fuldstændig anæstesi overvåges anæstesiplanet, og lymfestrømmen observeres korrekt. Den samme bedøvelse tilsættes ved samme dosis ca. 3 timer efter, at rotter sættes i Ballmans bur for at opnå dyb anæstesi kontinuerligt i 6 timer.

2. Lymfocytmærkning med carboxyfluorescein diacetate succinimidylester (CFDSE)

1. CFDSE(Tabel over materialer)opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) til 15,6 mM (500 μg CFDSE opløst i 60 μL DMSO).
2. Inkuber lymfocytter (1 x 10⁸~10⁹⁾i 50 ml RPMI 1640 med 50 μL CFDSE-opløsning i 30 min ved 37 °C som beskrevet tidligere¹⁰.

3. Eksperimentel opsætning til mikrovaskulære undersøgelser

1. Bedøve recipientrotter (8-12 uger) med intraperitoneal injektion af en blanding af Midazolam (2 mg/kg), Domitor (0,15 mg/kg) og Betulphar (2,5 mg/kg) og bekræfte anæstesidybdens dybde ved tåklemmer. Våd maven, før pelsen plejes for at minimere hårforurening. Åbn derefter maven af modtageren Wister rotte via en midterlinje snit.
2. Sæt en rotte på en bærbar rustfri stålplade (ca. 120 x 300 mm) med et rektangelhul omkring midten dækket med en glasrutsjebane (24 x 50 mm). Vælg ca. 10 cm af ilealsegmentet inklusive PPs til observation.
3. Tarmen holdes så varm som muligt og fugtig med fosfatbufferet saltvand (PBS) opvarmet til 37 °C. Soak gaze, der bruges til at dække tyndtarmen med PBS.
4. Mens du giver kontinuerlig anæstesi med 2 % isofluran (se materialetabel), skal du sætte rutsjebanen på mikroskopets stadium og vælge egnede områder til observation af mikrocirkulationen i PC'er, hvor nogle HEV'er løber gennem serosaen. PPs varierer i størrelse; større er egnede til observation af mikrocirkulationen ved hjælp af CLSM. Tyndtarmen er ikke lige på steder; et lige segment, der er mindst 2 cm langt uden spænding, er egnet til observation.
5. Dæk det tilstødende tarmsegment og mesentery med absorberende bomuld gennemblødt med PBS. Placer tarmsegmentet mellem to rullede vatkugler og placer det så vidt muligt fra rottens krop for at forhindre, at det vibrerer af rottens hjerteslag og vejrtrækning.
6. Ved hjælp af en 1 mL sprøjte injiceres der langsomt (over 1 min) CFSE-mærkede TDL'er (1 x 10⁸ celler) i recipientrotternes halspulsåre. En hurtig intravenøs injektion kan påvirke den systemiske cirkulation.

4. Mikrocirkulation af lymfocytter

1. Overvåg kontinuerligt TDL'er i mikrovasculaturen af PPs ved hjælp af CLSM og optag på en computer i 3 timer ved hjælp af time-lapse fotografering med 30 s intervaller. Dybden fra serosaen til PS'ernes HEV er ca. 25 μm, hvilket gør det muligt at observere stroma- og kapillærlymfekarrene til en dybde på 30 μm.
2. Injicer Texas Red-dextran (25 mg/kg) i halspulsåren på hver recipientrotter for at plette blodbanen og Hoechest 33342 (5 mg/kg) for at plette cellekernerne.
3. (Valgfrit) For at kvantificere lymfocytdynamikken skal du definere lymfocytter, der klæber til HEV'er, mere end 30 sekunder som "klæbende lymfocytter" og lymfocytter, der emigrerer fra HEV'er til stroma som ''migrerende lymfocytter". Derefter beregnes den gennemsnitlige procentdel af migration (migrerende lymfocytter / selvklæbende lymfocytter + migrerende lymfocytter) pr. Synsfelt (ca. 0,3 mm²).

Representative Results

Indsamling lymfocytter fra lymfeknuder
For at forberede rotten til thoraxkanalkonserves, skal du lave et snit i den spændte brystkanal som vist i figur 1 og derefter holde rotten i en Bollmans bur som vist i figur 2.

Når lymfocytter er godt indsamlet, kan vi få omkring 20 mL/6 h lymfevæske indeholder omkring^{10 7}~ 10⁸/ mL lymfocytter. Af TDL'erne udtrykker 70% CD4, hvoraf ca. 90% celler udtrykker CD62L, hvilket betyder hovedsammensætningen af TDL'er (>60%) består af naive tarm-trope lymfocytter. Da de lymfocytter, der indsamles her, er celler, der specifikt migrerer til tarmkanalen, er de egnede til at evaluere migrationstilstanden i Peyers patches.

Mikroskopisk observation
Efter injektion af en passende dosis fluorescerende lymfocytter monteres recipientrottens tarm på en glasrutsjebane som vist i figur 3. Et mikroskopisk billede af PPs i fysiologisk tilstand er vist i figur 4.

Til mikroobservationen kan rotter bedøves under laparotomi i ca. 3 timer. Lymfocytter klæber til HEV'er, ruller og migrerer til den omgivende stroma og migrerer derefter til lymfekapillærer. Vi kvantificerede og evaluerede procentdelen af lymfocytter, der migrerede i stromaen inden for observationsperioden.

Efter injektionen af en passende dosis fluorescerende lymfocytter begynder tarm-trope lymfocytter at klæbe til HEV'er og migrere over endotelet ind i stromaen om ca. 1 time. De fleste bevæger sig inden for stroma, mens andre migrerer til lymfe kapillærer i omkring 2-3 timer. Den veludviklede fluorescensmærkning ex vivo i denne undersøgelse resulterede i høj intensitet, og det gør det muligt for os at observere lymfocytdynamik i meget dybt område. Derudover kan vi ved hjælp af en anden form for fluorescensmærkning nemt observere dynamikken i forskellige slags lymfocyt samtidigt. Denne tarm-tropic lymphocyte migration kan visuelt afklares for undertrykkelse af nogle immunmodulatorer såsom FTY720 som vist i vores tidligere rapport.

Det er yderst vanskeligt at observere selve mikrocirkulatorsystemet, og det er ønskeligt at etablere en let evalueringsmetode. Denne undersøgelse har også gjort det muligt at finde ud af, hvor handlingsstedet for lægemidlet er i Peyers patches. Især gjorde ex vivo-administrationen af FTY720 til lymfocyt det muligt at begrænse virkningsstedet til lymfocytter, men ikke til endotel. Kombineret med sortering af specifikke lymfocyt, mere detaljerede resultater ville blive opnået.

Figur 1: Procedure for at eksponere brystkanalen og udføre cannulation. Efter at have skåret peritoneum longitudinally, brystkanalen kan eksponeres ved at flytte maven cranially og dissekere bindevævet på dorsal højre side af abdominal aorta. Bindevævet omkring mellemgulvet skal omhyggeligt dissekeres for at forhindre skader. Brystkanalen skal eksponeres så bredt kranialt som muligt for at skabe tilstrækkelig plads til kannulation og derefter ligated af en 3-0 silke sutur lige under mellemgulvet for at stoppe strømmen af lymfeknuder og bevare væsken kaudalet. Mælkeagtig lymfevæske er synlig gennem lymfekanalen, hvor kateteret kan indsættes. Rottens brystkanal skal være let anstrengt for at sikre en glat kannulation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Et billede af hele indstillingen til indsamling af thoraxkanallymfocytter (TDL'er). Rotterne holdes i Bollmans bure, og TDL'er opsamles gennem kannulationsrøret i hvert hætteglas. Hætteglassene er sat på is og udskiftes hver 12. time for at indsamle frisk lymfevæske. Sukkerbelastet saltvand administreres gennem et silikonerør ved hjælp af en sprøjtepumpe med en hastighed på ca. 3 mL/h for at forhindre dehydrering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Rotten sættes på mikroskopets scene, der er forbundet med anæstesimaskinen, og et fluorescerende stof eller fluorescerende mærkede lymfocytter injiceres fra det venøse kateter gennem den indre jugularåre (A). Tarmkanalens observationsområde blev forsigtigt fastgjort mellem to rullede bomuldskugler. Tarmkanalen blev fastgjort langt fra stammen for at undgå vibrationer ved åndedrætsbevægelser. Valsede vatkugler blev gennemblødt i fosfatbufferet saltvand for at forhindre tørring af tarmen i observationsperioden (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Mikroskopisk billede af Peyers pletter i fysiologisk tilstand (A). Kernerne i vaskulære endotelceller er farvede blå. Blodplasmaet er rødt, og blodgennemstrømningen opdages ved strømmen af ikke-indgroede celler. Gut-tropic lymfocytter (farvet grøn) overholder høje endotel venules (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her beskrev vi en protokol for indsamling af naive tarm-trope lymfocytter og observere deres migration i rotteP'er. Disse procedurer kan afsløre, hvordan lymfocytter bevæger sig i mikrovasculature af PPs og gøre det muligt at visuelt sammenligne deres dynamik under en normal eller medicineret tilstand. Den direkte observation af disse dynamikker har meget værdi at få et fingerpeg om immunologisk modifikation af nogle lægemidler, selv om observationsperioden er begrænset til kun et par timer.

Vi nævnte nogle tips i metoderne. Blandt dem er en af de mest delikate procedurer, at operatøren skal cannulate brystkanalen hurtigt og præcist. Hvis en operation tager lang tid og indebærer unødvendig skade, opstår der betydelig blødning og betændelse, hvilket resulterer i en nedsat TDL-samling på grund af ødem af bindevævet og obstruktion af brystkanalen. Vi plejede at cannulate røret efter at have skabt et lille snit på brystkanalen ved hjælp af en saks med en lille skærkant. Denne procedure forstyrrer dog kannulationsstedet på grund af dræning af lymfeknuder. Derfor skærer vi nu ikke brystkanalen; snarere stikker vi det med en skarp kant. Denne metode gør kannulationen lettere og øger succesraterne. Derudover er snitstedet i brystkanalen meget vigtigt på grund af det begrænsede bughule. Hvis indsnitsstedet er for tæt på mellemgulvet, vil den buede del af cannulationsrøret støde mod membranen. Hvis det er for langt fra mellemgulvet, er det også svært at cannulate røret dybt nok til at sikre fiksering på grund af lymfeknuder af kaudale brystkanalen. Selv i tilfælde af god kannulation kan cannulationsrøret let occluded af fibrindannelse. Således anbefaler vi periodisk forsigtigt at skylle røret med heparin.

De seneste fremskridt inden for CLSM gjorde det muligt at observere det fokuserede område tydeligere og mere præcist i realtid sammenlignet med en tidligere undersøgelse¹¹. Vi bruger nu CLSM i vores laboratorium, men vi kan observere mikrocirkulationen tydeligere ved hjælp af et multifotonmikroskop. Selv om protokollen kræver ændringer på flere punkter sammen med den tekniske udvikling, det gør det muligt observation af det lokaliserede område af organet af interesse^12,13.

Metodens fortjeneste og nøgle er, at den involverer adskillelse af lymfocytter fra recipientdyr, inkubation af dem ved hjælp af enhver form for forbindelser in vitro og observere dem efter deres injektion i recipientdyr. Dette gør det muligt at belyse virkningerne af lymfocytter alene. Tværtimod, hvis vi ønsker at belyse virkningerne af enhver form for forbindelser på andre celler end lymfocytter, såsom det vaskulære endotel, kan vi behandle recipientdyr med enhver form for forbindelser og observere dem efter injektion af kontrollymfocytter. For at belyse de samme ting ved hjælp af mus, skal vi skabe betingede genetisk manipulerede dyr en efter en. Derudover ville sortering af de isolerede lymfocytter ved hjælp af specifik overflademarkør gøre det muligt at studere dynamikken i specifikke typer lymfocytter.

Som vist i videoen af denne undersøgelse bevæger lymfocytter sig på ubestemt tid og sideværts gennem det vaskulære endotel i selve kroppen, så det er vanskeligt at evaluere virkningerne på deres adfærd kun ved hjælp af in vivo-observationer. Hvis virkningsmekanismen for et administreret lægemiddel skal undersøges, er det desuden oprindeligt uegnet til at undersøge hvert aktionssted. Fordelen ved denne undersøgelse er, at ved at adskille lymfocytter og inkubere dem in vitro, kan de medicinske virkninger undersøges separat på vaskulære og lymfocyt sider. Færre variabler er nemmere at analysere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R+	Nikon		Comfocal Laser Scanning Microscopy
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isoflurane	Wako Pure Chemical Industries	099-06571
RPMI 1640 medium	GIBCO	11875093
Texas Red–dextran	Thermo Fisher Scientific	D1863