Summary
Ici, nous décrivons une méthode précise pour recueillir les lymphocytes thoraciques de conduit et observer la migration des lymphocytes intestin-tropiques dans les corrections de Rat Peyer pendant 3 heures utilisant la photographie de time-lapse. Cette technique peut clarifier comment la dynamique des lymphocytes sont affectés dans des conditions inflammatoires.
Abstract
Les lymphocytes naïfs recirculent du sang aux tissus lymphoïdes dans un état physiologique et il est généralement reconnu comme un phénomène important dans l’immunité intestinale. Le stroma des organes lymphoïdes secondaires, tels que les patchs de Peyer (PPs) ou les ganglions lymphatiques mésentériques, sont l’endroit où les lymphocytes naïfs détectent les antigènes. Les lymphocytes naïfs circulent dans le sang pour atteindre les venules endothéliales élevées, le portail d’entrée dans les PPP. On estime que certains immunomodulateurs influencent la migration des lymphocytes, mais l’évaluation précise de la dynamique de microcirculation est très difficile, et l’établissement d’une méthode pour observer la migration des lymphocytes in vivo peut contribuer à la clarification des mécanismes précis. Nous avons affiné la méthode de collecte des lymphocytes du conduit lymphatique et d’observation de la dynamique détaillée des lymphocytes intestino-tropiques chez les rats. Nous avons choisi la microscopie confoccale de balayage de laser pour observer des PP de rat in vivo et l’avons enregistrée utilisant la photographie de time-lapse. Nous pouvons maintenant obtenir des images claires qui peuvent contribuer à l’analyse de la dynamique des lymphocytes.
Introduction
Les patchs de Peyer (PPs) se composent de centaines de follicules lymphoïdes dans la propria lamina de l’intestin grêle. Les PPP sont divisés en follicules, la région interfollicular, et les centres germinaux situés dans la partie inférieure des follicules, où les lymphocytes sont stimulés par la présentation d’antigène. Il n’y a pas de vaisseaux lymphatiques afferents, et les antigènes envahissent le propria lamina du lumen intestinal par l’intermédiaire de la couche épithéliale de cellules. La région épithéliale couvrant les follicules lymphoïdes est appelée épithélium associé au follicule, dans lequel les cellules M intercalées spécialisées absorptionnt des antigènes muqueux. Les lymphocytes M prennent des antigènes du côté luminal et les antigènes sont ensuite capturés par des cellules dendritiques et présentés vers des lymphocytes naïfs qui s’écoulent dans les PPP par l’endothelium des venules endothéliales élevées (HEVs)1. Les PPP jouent un rôle important dans l’immunité intestinale et sont liés au stade précoce de l’inflammation. Beaucoup d’interactions moléculaires impliquent l’entrée des lymphocytes aux organes lymphoïdes secondaires (SLOs), y compris des molécules d’adhérence, des chemokines2,3,et la sphingosine-1-phosphate4; ainsi, il y a beaucoup de cibles thérapeutiques prévues. Par conséquent, l’observation de la dynamique des lymphocytes dans les PPP nous permet d’apercevoir le stade très précoce de l’inflammation et d’examiner l’utilité de plusieurs médicaments prometteurs.
La méthode se concentre ici sur la migration des lymphocytes dans les PPP, qui comprend plusieurs procédures (cannulation dans le conduit thoracique5 et la collecte des lymphocytes et l’observation à long terme après l’injection dans les lymphocytes collectés). Étant donné que ces procédures sont complexes et qu’il était difficile de voir exactement comment chaque procédure a été effectuée dans des rapports précédents, nous avons mentionné ici quelques conseils pour parvenir à une observation réussie. Par exemple, la cannulation des tubes dans le conduit thoracique était très difficile, et le taux de succès initial de la cannulation était inférieur à 50%. Cependant, nous avons amélioré la méthode et obtenu un taux de réussite supérieur à 80%. Nous avons mentionné quelques autres bouts dans ce manuscrit qui sont nécessaires pour l’observation réussie pour permettre l’évaluation quantitative de la migration transendothelial des lymphocytes dans plusieurs conditions.
Dans les rapports précédents, il était difficile de comprendre les changements tridimensionnels au fil du temps, tels que l’injection intraveineuse de l’encre de Chine pour tacher la structure vasculaire desPPP 6, ou le microscope étant monofocal7. Ces dernières années, une méthode d’observation utilisant certains animaux transgéniques de protéine de fluorescence photoconvertible tels que les souris de Kaede ont clarifié les mouvements cellulaires systématiques in vivo8. L’autre étude a clarifié l’arrêt indépendant cd69 de l’évacuation des lymphocytes desPPP 9. Nous avons utilisé la microscopie à balayage laser confoccal (CLSM) en raison de sa capacité d’analyse élevée. Maintenant, nous pouvons facilement obtenir des images à haute résolution et les utiliser pour analyser la dynamique des lymphocytes.
Dans ce rapport, nous avons démontré une série de méthodes pour évaluer la migration de lymphocyte dans les PPP. Tout d’abord, nous avons montré des méthodes raffinées de cannulation thoracique des conduits pour recueillir les lymphocytes. Deuxièmement, nous avons amélioré les méthodes d’observation de plusieurs façons pour maintenir les organes objectifs dans la mesure du possible sous observation microscopique, ce qui nous a permis d’obtenir des images de haute qualité pendant 3 heures. Troisièmement, nous avons quantifié les mouvements cellulaires de la migration des lymphocytes pour évaluer les effets de certains médicaments. Ces protocoles modifiés contribueront au développement d’évaluations d’immunologie muqueuse.
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Protocol
Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de recherche animale du National Defense Medical College (no 16058). Les animaux ont été maintenus sur chow standard de laboratoire (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japon). Les animaux de laboratoire ont été traités conformément aux directives des National Institutes of Health.
1. Collecte et séparation des lymphocytes
REMARQUE : Comme les lymphocytes doivent être frais et ne peuvent pas être stockés, ils doivent être prélevés sur des rats pour chaque expérience. En outre, les lymphocytes intestino-tropiques doivent être prélevés directement dans le conduit thoracique où ils circulent. Toutes les procédures devraient être terminées dans les 6 heures, et tous les instruments, gants et surfaces sont propres. Afin de maintenir les animaux dans un état physiologiquement stable, tous les liquides salins et autres utilisés dans l’expérience doivent être maintenus au chaud.
- Former un tube de cannulation (1 mm de diamètre) comme une courbe d’héparine (un rayon d’environ 5 mm) après l’avoir tremper dans de l’eau chaude (environ 80-90 °C) et le fixer à une planche en plastique à l’aide de ruban adhésif pendant quelques heures à l’avance.
- Anesthésier un rat Wistar mâle (8-12 semaines) avec injection intraperitoneal d’un mélange de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg), et Betulphar (2.5mg/kg) et couper les poils du corps de l’abdomen à l’aide d’une tondeuse à cheveux. Retirez fermement les cheveux après le rasage afin que les cheveux n’entrent pas dans la cavité abdominale.
- Après avoir confirmé que la profondeur stable de l’anesthésie requise pour l’intervention est obtenue par pincement des pieds, faire une incision avec des ciseaux chirurgicaux horizontalement de la ligne médiane à la zone subcostale gauche. Veillez à ne pas endommager les vaisseaux sanguins du péritoine pariétal en observant les vaisseaux sous la lumière.
- Enveloppez l’estomac avec de la gaze humide et déplacez doucement l’estomac vers la droite à l’extérieur du corps pour révéler les organes rétroperitoneal. Insérez un cran entre les muscles erector de la colonne vertébrale et le tissu adipeux à l’aide de ciseaux chirurgicaux et séparez-les franchement avec les doigts.
- Dépouillez soigneusement le tissu conjonctif autour du conduit thoracique. L’excès de tissu conjonctif augmente avec l’âge. Exposer le conduit thoracique juste sous les crus gauches du diaphragme caudally jusqu’à ce qu’une longueur de 20 mm du conduit thoracique soit visible. Séparez délicatement les adhérences entre le conduit thoracique et l’aorte à l’aide de pinces de précision ou d’écouvillons de coton mouillés.
- Effectuez ce processus avec soin parce que certains rats ont artérioles ramification de l’artère abdominale traversant sur le conduit thoracique ou un conduit thoracique court en raison d’une position plus élevée du plexus lymphatique (petits conduits thoraciques se propageant comme des toiles d’araignée). Évitez tout contact inutile avec le conduit thoracique pour éviter d’induire un œdème.
- Appliquer une ligature par une ficelle (soie 3-0) sur le conduit thoracique juste sous les crus gauches du diaphragme. Le conduit thoracique caudal devient distendu.
- Faire un trou (5 mm de diamètre) dans la paroi abdominale en poignardant le bord de coupe des ciseaux chirurgicaux, passer le tube de cannulation incurvé en épingle à cheveux, et ligate le tube sur le muscle iliopsoas à un moment donné. Remplissez le tube de cannulation avec une solution saline normale contenant 10 U/mL d’héparine.
- Après avoir placé une ficelle (3-0 de soie) sous le conduit thoracique distendu, poignarder le conduit thoracique avec le bord nettement coupé d’un tube de cannulation, le cannuler vers la queue d’environ 5 mm, et ligate le conduit thoracique avec le tube de cannulation pour la fixation.
- Pour fournir de la solution saline pour prévenir la déshydratation, créer un trou (3 mm de diamètre) sur la paroi antérieure de l’antrum de l’estomac à l’aide de pinces de précision et passer le tube de silicium (2 mm de diamètre) au dudénodène à travers l’anneau pylorique. Après avoir brodé une plaie et maintenu les animaux dans les cages de Bollman, commencez à infuser de la solution saline chargée de sucre dans le dudéno de chaque rat à partir du tube de silicium à un débit de 3 mL/h. Couvrir toute la cage d’une serviette en papier pour la garder au chaud.
- Fixer le tube de cannulation au trou au centre du couvercle d’un tube conique de 50 mL sur de la glace contenant 6 U/mL d’héparine, 10 % de sérum bovin fœtal et de milieu RPMI 1640 (pH 7,4; voir le tableau des matériaux) et recueillir les lymphocytes thoraciques des conduits (TDL) sur la glace. Veillez à ne pas entrer en contact entre la pointe du tube et la paroi du tube conique afin d’éviter l’occlusion cannulée due à la formation de caillots fibrins à l’intérieur du tube. Le liquide lymphatique (environ 20 mL) comprenant environ 1,0 x 108~109 lymphocytes peut être obtenu en 6 heures. Pour obtenir les lymphocytes sous anesthésie complète, le plan d’anesthésie est surveillé et le flux lymphatique est observé de manière appropriée. Les mêmes anesthésiques sont ajoutés à la même dose environ 3 heures après que les rats sont mis dans la cage de Ballman pour obtenir une anesthésie profonde en continu pendant 6 heures.
2. Étiquetage des lymphocytes avec carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFDSE)
- Dissoudre le CFDSE(Tableau des matériaux)dans le sulfure de diméthyle (DMSO) à 15,6 mM (500 μg de CFDSE dissous dans 60 μL de DMSO).
- Lymphocytes incubés (1 x 108~109) dans 50 mL de RPMI 1640 avec 50 μL de solution CFDSE pendant 30 min à 37 °C comme décrit précédemment10.
3. Configuration expérimentale pour des études microvasculaires
- Anesthésier les rats receveurs (8 à 12 semaines) par injection intraperitoneal d’un mélange de Midazolam (2 mg/kg), Domitor (0,15 mg/kg) et Betulphar (2,5 mg/kg) et confirmer la profondeur de l’anesthésie par pincement d’orteil. Mouiller l’abdomen avant de toiletter la fourrure pour minimiser la contamination des cheveux. Ensuite, ouvrez l’abdomen du rat Wister receveur par une incision de midline.
- Placez un rat sur une plaque portative en acier inoxydable (environ 120 x 300 mm) avec un trou rectangle autour du centre recouvert d’une glissière en verre (24 x 50 mm). Choisissez environ 10 cm du segment iléal, y compris les PPP pour l’observation.
- Gardez l’intestin aussi chaud que possible et humide avec du phosphate tamponné salin (PBS) réchauffé à 37 °C. Faire tremper la gaze qui est utilisée pour couvrir l’intestin grêle de PBS.
- Tout en donnant une anesthésie continue avec 2 % d’isoflurane (voir tableau des matériaux), mettez la lame sur la scène du microscope et choisissez des zones appropriées pour l’observation de la microcirculation dans les PPP où certains VHS traversent la sérosa. La taille des PPP varie; les plus grands conviennent à l’observation de la microcirculation à l’aide du CLSM. L’intestin grêle n’est pas droit par endroits; un segment droit d’au moins 2 cm de long sans aucune tension convient à l’observation.
- Couvrir le segment intestinal adjacent et la mesenterie de coton absorbant imbibé de PBS. Placez le segment de l’intestin entre deux boules de coton roulées et placez-le aussi loin que possible du corps du rat pour l’empêcher d’être vibré par le battement de cœur et la respiration du rat.
- À l’aide d’une seringue de 1 mL, injecter lentement (plus de 1 min) de TDL étiquetés CFSE (1 x 108 cellules) dans la veine jugulaire des rats receveurs. Une injection intraveineuse rapide peut influencer la circulation systémique.
4. Microcirculation des lymphocytes
- Surveillez en permanence les TDL dans la microvasculature des PPP à l’aide de CLSM et enregistrez sur un ordinateur pendant 3 heures en utilisant la photographie en accéléré à intervalles de 30 s. La profondeur de la serosa à l’HEV des PPP est d’environ 25 μm, permettant l’observation des vaisseaux lymphatiques stroma et capillaires à une profondeur de 30 μm.
- Injecter texas red-dextran (25 mg/kg) dans la veine jugulaire de chaque rat receveur pour tacher la circulation sanguine et Hoechest 33342 (5 mg/kg) pour tacher les noyaux cellulaires.
- (Facultatif) Pour quantifier la dynamique des lymphocytes, définissez les lymphocytes adhérant aux VHS plus de 30 secondes comme des « lymphocytes adhésifs » et les lymphocytes qui émigrent des VOV au stroma comme des lymphocytes migrateurs. Calculez ensuite le pourcentage moyen de migration (lymphocytes migrateurs / lymphocytes adhésifs + lymphocytes migrateurs) par champ de vision (environ 0,3 mm2).
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Representative Results
Collecte des lymphocytes de la lymphe
Pour préparer le rat à la cannulation thoracique du conduit, faites une incision dans le conduit thoracique tendu, comme le montre la figure 1, puis maintenez le rat dans la cage d’un Bollman, comme le montre la figure 2.
Lorsque les lymphocytes sont bien collectés, nous pouvons obtenir environ 20 mL/6 h de liquide lymphatique contenant environ 10lymphocytes 7~108/mL. Parmi les TDL, 70% expriment cd4, parmi lesquels environ 90% des cellules expriment CD62L, ce qui signifie la composition principale des TDLs (>60%) se compose de lymphocytes intestin-tropiques naïfs. Puisque les lymphocytes recueillis ici sont des cellules qui migrent spécifiquement vers le tractus intestinal, ils sont appropriés pour évaluer l’état de migration dans les patchs de Peyer.
Observation microscopique
Après avoir injecté une dose adéquate de lymphocytes fluorescents, montez l’intestin du rat receveur sur une lame de verre, comme le montre la figure 3. Une image microscopique des PPP dans l’état physiologique est indiquée dans la figure 4.
Pour la micro-observation, les rats peuvent être stably anesthésiés sous laparotomie pendant environ 3 heures. Les lymphocytes adhèrent aux HEV, roulent et migrent vers le stroma environnant, puis migrent vers les capillaires lymphatiques. Nous avons quantifié et évalué le pourcentage de lymphocytes qui ont migré dans le stroma au cours de la période d’observation.
Après l’injection d’une dose adéquate de lymphocytes fluorescents, les lymphocytes intestino-tropicaux commencent à adhérer aux VHE et migrent à travers l’endothélium dans le stroma en environ 1 heure. La plupart se déplacent dans le stroma, tandis que d’autres migrent vers les capillaires lymphatiques en environ 2-3 heures. L’étiquetage de fluorescence bien développé ex vivo dans cette étude a donné lieu à une intensité élevée et nous permet d’observer la dynamique des lymphocytes de zone très profonde. En outre, en utilisant un type différent d’étiquetage de fluorescence, nous pouvons facilement observer la dynamique de différents types de lymphocytes simultanément. Cette migration intestinale-tropicale de lymphocyte peut être visuellement clarifiée pour la suppression par quelques immunomodulateurs tels que FTY720 comme montré dans notre rapport précédent.
L’observation du système microcirculatoire lui-même est extrêmement difficile, et il est souhaitable d’établir une méthode d’évaluation facile. Cette étude a également permis de savoir où se trouve le site d’action du médicament dans les patchs du Peyer. En particulier, l’administration ex vivo de FTY720 au lymphocyte a permis de limiter le site d’action seulement aux lymphocytes mais pas à l’endothélium. Combiné avec le tri de lymphocyte spécifique, des résultats plus détaillés seraient obtenus.
Figure 1 : Procédure pour exposer le conduit thoracique et effectuer la cannulation. Après avoir coupé le péritoine longitudinal, le conduit thoracique peut être exposé en déplaçant l’estomac cranially et en disséquant le tissu conjonctif sur le côté droit dorsal de l’aorte abdominale. Le tissu conjonctif autour du diaphragme doit être soigneusement disséqué pour prévenir les blessures. Le conduit thoracique doit être exposé aussi large cranially que possible pour créer suffisamment d’espace pour la cannulation, puis ligated par une suture de soie 3-0 juste sous le diaphragme pour arrêter le flux de la lymphe et de conserver le liquide caudally. Le liquide lymphatique laitier est visible par le conduit lymphatique, où le cathéter peut être inséré. Le conduit thoracique du rat doit être légèrement tendu pour assurer une cannulation lisse. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Image de l’ensemble du paramètre pour recueillir les lymphocytes thoraciques des conduits (TDL). Les rats sont maintenus dans les cages de Bollman et les TDL sont recueillis par le tube de cannulation dans chaque flacon. Les flacons sont mis sur la glace et remplacés toutes les 12 heures pour recueillir le liquide lymphatique frais. La solution saline chargée de sucre est administrée par un tube de silicone à l’aide d’une pompe à seringues à une vitesse d’environ 3 mL/h pour prévenir la déshydratation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Le rat est mis sur la scène du microscope connecté à la machine d’anesthésie, et une substance fluorescente ou des lymphocytes fluorescents sont injectés à partir du cathéter veineux par la veine jugulaire interne (A). La zone d’observation du tractus intestinal a été délicatement fixée entre deux boules de coton roulées. Le tractus intestinal a été fixé loin du tronc pour éviter les vibrations par les mouvements respiratoires. Des boules de coton roulées ont été trempées dans la solution saline tamponnée de phosphate pour empêcher le séchage de l’intestin pendant la période d’observation (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Image microscopique des taches de Peyer dans l’état physiologique (A). Les noyaux des cellules endothéliales vasculaires sont tachés de bleu. Le plasma sanguin est rouge, et le flux sanguin est détecté par le flux de cellules non tachées. Lymphocytes intestino-tropiques (vert taché) adhérant à des venules endothéliales élevées (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici nous avons décrit un protocole pour recueillir les lymphocytes intestin-tropiques naïfs et observer leur migration dans des PP de rat. Ces procédures peuvent révéler comment les lymphocytes se déplacent dans la microvasculature des PPP et rendre possible de comparer visuellement leur dynamique dans un état normal ou médicamenteux. L’observation directe de ces dynamiques a beaucoup de mérite pour obtenir un indice de modification immunologique par certains médicaments, bien que la période d’observation soit limitée à seulement quelques heures.
Nous avons mentionné quelques conseils dans les méthodes. Parmi eux, l’une des procédures les plus délicates est que l’opérateur doit cannulate le conduit thoracique rapidement et précisément. Si une opération prend beaucoup de temps et implique des dommages inutiles, des saignements importants et une inflammation se produisent, ce qui entraîne une diminution de la collecte de TDL due à l’oedème du tissu conjonctif et l’obstruction du conduit thoracique. Nous avions l’habitude de cannulate le tube après avoir créé une petite incision sur le conduit thoracique à l’aide de ciseaux avec un petit bord de coupe. Cependant, cette procédure interfère avec le site de cannulation dû à la lymphe drainante. Par conséquent, maintenant nous ne coupons pas le conduit thoracique ; au contraire, nous le poignardons avec un bord tranchant. Cette méthode facilite la cannulation et augmente les taux de réussite. En outre, le site d’incision dans le conduit thoracique est très important en raison de la cavité abdominale limitée. Si le site d’incision est trop près du diaphragme, la partie incurvée du tube de cannulation se heurterait au diaphragme. S’il est trop loin du diaphragme, il est également difficile de cannulate le tube assez profondément pour assurer la fixation due au plexus lymphatique du conduit thoracique caudal. Même en cas de bonne cannulation, le tube de cannulation peut être facilement occlus par la formation de fibrine. Ainsi, nous recommandons de rincer périodiquement doucement le tube avec de l’héparine.
Les progrès récents du CLSM ont permis d’observer la zone ciblée plus clairement et plus précisément en temps réel par rapport à une étude précédente11. Nous utilisons maintenant CLSM dans notre laboratoire, mais nous pouvons observer la microcirculation plus clairement à l’aide d’un microscope multiphoton. Bien que le protocole nécessite des modifications en plusieurs points ainsi que des progrès techniques, il permet l’observation de la zone localisée de l’organed’intérêt 12,13.
Le mérite et la clé de la méthode est qu’elle consiste à séparer les lymphocytes des animaux receveurs, à les incuber à l’aide de tout type de composés in vitro et à les observer après leur injection chez les animaux receveurs. Cela permet d’élucider les effets des lymphocytes seuls. Au contraire, si nous voulons élucider les effets de tout type de composés sur les cellules autres que les lymphocytes, tels que l’endothélium vasculaire, nous pouvons traiter les animaux receveurs avec n’importe quel type de composés et les observer après l’injection de lymphocytes de contrôle. Pour élucider les mêmes choses à l’aide de souris, nous devons créer des animaux génétiquement manipulés conditionnels un par un. En outre, le tri des lymphocytes isolés à l’aide d’un marqueur de surface spécifique permettrait d’étudier la dynamique de certains types de lymphocytes.
Comme le montre la vidéo de cette étude, les lymphocytes se déplacent indéfiniment et latéralement à travers l’endothélium vasculaire du corps réel, il est donc difficile d’évaluer les effets sur leur comportement en utilisant des observations in vivo seulement. En outre, si le mécanisme d’action d’un médicament administré doit être examiné, il n’est à l’origine pas approprié pour examiner chaque site d’action. Le mérite de cette étude est qu’en séparant les lymphocytes et en les incubant in vitro, les effets médicinaux peuvent être examinés séparément sur les côtés vasculaire et lymphocyte. Moins de variables sont plus faciles à analyser.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des subventions du National Defense Medical College et par une subvention de recherche en sciences de la santé et du travail pour la recherche sur les maladies insolubles du ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être social, au Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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