Summary
Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.
Abstract
I linfociti ingenui ricircolano dal sangue ai tessuti linfoidi in condizioni fisiologiche ed è comunemente riconosciuto come un fenomeno importante nell'immunità intestinale. Lo stroma degli organi linfoidi secondari, come le chiazze di Peyer (PS) o i linfonodi mesenterici, sono dove i linfociti ingenui percepisce gli antigeni. I linfociti ingenui circolano attraverso il flusso sanguigno per raggiungere alte venute endoteliali, il portale di ingresso nei PC. Si stima che alcuni immunomodulatori influenzino la migrazione dei linfociti, ma la valutazione precisa della dinamica del microcircolo è molto difficile e stabilire un metodo per osservare la migrazione dei linfociti in vivo può contribuire al chiarimento dei meccanismi precisi. Abbiamo perfezionato il metodo di raccolta dei linfociti dal condotto linfatico e osservando la dinamica dettagliata dei linfociti intestinali-tropici nei PC di ratto. Abbiamo scelto la microscopia a scansione laser confocale per osservare i PC di ratto in vivo e l'abbiamo registrata utilizzando la fotografia time-lapse. Ora possiamo ottenere immagini chiare che possono contribuire all'analisi della dinamica dei linfociti.
Introduction
Le chiazze di Peyer (PPs) sono costituite da centinaia di follicoli linfoidi nella lamina propria dell'intestino tenue. I PP sono divisi in follicoli, la regione interfollicolare e centri germinali situati nella parte inferiore dei follicoli, dove i linfociti sono stimolati dalla presentazione dell'antigene. Non ci sono vasi linfatici afferenti e gli antigeni invadono la lamina propria dal lume intestinale attraverso lo strato cellulare epiteliale. La regione epiteliale che copre i follicoli linfoidi è chiamata epitelio associato al follicolo, all'interno del quale le cellule M intervallate specializzate assuppongono gli antigeni mucosi. Le cellule M assupiscono antigeni dal lato luminale e gli antigeni vengono quindi catturati dalle cellule dendritiche e presentati verso linfociti ingenui che fluiscono nei PPs attraverso l'endotelio di alte venute endoteliali (HEV)1. I PP svolgono un ruolo importante nell'immunità intestinale e sono correlati con la fase iniziale dell'infiammazione. Molte interazioni molecolari coinvolgono l'ingresso di linfociti agli organi linfoidi secondari (SLO), comprese le molecole di adesione, le chemiochine2,3e la sfingosina-1-fosfato4; pertanto, ci sono molti obiettivi terapeutici attesi. Pertanto, osservare la dinamica dei linfociti all'interno dei PPs ci consente di intravedere la fase molto precoce dell'infiammazione ed esaminare l'utilità di diversi farmaci promettenti.
Il metodo qui si concentra sulla migrazione dei linfociti nei PS, che include diverse procedure (cannulazione nel dotto toracico5 e raccolta di linfociti e osservazione a lungo termine dopo l'iniezione nei linfociti raccolti). Poiché queste procedure sono complesse ed è stato difficile capire esattamente come ogni procedura è stata eseguita nelle relazioni precedenti, abbiamo menzionato qui alcuni suggerimenti per ottenere un'osservazione di successo. Ad esempio, la cannulazione dei tubi nel condotto toracico era molto difficile e il tasso iniziale di successo della cannulazione era inferiore al 50%. Tuttavia, abbiamo migliorato il metodo e raggiunto un tasso di successo superiore all'80%. Abbiamo menzionato alcuni altri suggerimenti in questo manoscritto che sono necessari per l'osservazione riuscita per consentire la valutazione quantitativa della migrazione transendoteliale dei linfociti in diverse condizioni.
Nei rapporti precedenti, era difficile comprendere i cambiamenti tridimensionali nel tempo, come l'iniezione endovenosa di inchiostro indiano per macchiare la struttura vascolare di PPs6, o il microscopio era monofocale7. Negli ultimi anni, un metodo osservazionale che utilizza alcuni animali transgenici proteici a fluorescenza fotoconvertibili come i topi Kaede ha chiarito i movimenti cellulari sistematici in vivo8. L'altro studio ha chiarito l'arresto indipendente del CD69 dell'uscita dei linfociti dai PPs9. Abbiamo utilizzato la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) a causa della sua elevata capacità analitica. Ora possiamo facilmente ottenere immagini ad alta risoluzione e usarle per analizzare la dinamica dei linfociti.
In questa relazione, abbiamo dimostrato una serie di metodi per valutare la migrazione dei linfociti nei PC. In primo luogo, abbiamo mostrato metodi raffinati di cannulazione del dotto toracico per raccogliere i linfociti. In secondo luogo, abbiamo migliorato i metodi osservativi in diversi modi per mantenere organi oggettivi ogni volta che è possibile sotto osservazione microscopica, consentendoci di ottenere immagini di alta qualità per 3 ore. In terzo luogo, abbiamo quantificato i movimenti cellulari della migrazione dei linfociti per valutare gli effetti di alcuni farmaci. Questi protocolli modificati contribuiranno allo sviluppo di valutazioni dell'immunologia mucosa.
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Protocol
Il protocollo sperimentale fu approvato dal Animal Research Committee del National Defense Medical College (n. 16058). Gli animali sono stati mantenuti su chow di laboratorio standard (CLEA Japan Inc, Tokyo, Giappone). Gli animali da laboratorio sono stati trattati in conformità con le linee guida degli Istituti Nazionali di Salute.
1. Raccolta e separazione dei linfociti
NOTA: Poiché i linfociti devono essere freschi e non possono essere conservati, devono essere raccolti dai ratti per ogni esperimento. Inoltre, i linfociti intestinali-tropici devono essere raccolti direttamente dal dotto toracico dove circolano. Tutte le procedure dovrebbero essere completate entro 6 ore e tutti gli strumenti, i guanti e le superfici sono puliti. Al fine di mantenere gli animali in uno stato fisiologicamente stabile, tutti i fluidi salini e altri fluidi utilizzati nell'esperimento devono essere tenuti al caldo.
- Formare un tubo di cannula (1 mm di diametro) come una curva di eparina (un raggio di circa 5 mm) dopo averlo imperniato in acqua calda (circa 80-90 °C) e fissarlo a una tavola di plastica usando nastro adesivo con qualche ora di anticipo.
- Anestetizzare un ratto Wistar maschio (8-12 settimane) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Midazolam (2 mg / kg), Domitor (0,15 mg / kg) e Betulphar (2,5 mg / kg) e tagliare i peli del corpo dell'addome usando un tagliacapelli. Rimuovere saldamente i capelli dopo la rasatura in modo che i capelli non entrino nella cavità addominale.
- Dopo aver confermato che la profondità stabile dell'anestesia richiesta per la procedura si ottiene con il pizzico, fare un'incisione con forbici chirurgiche orizzontalmente dalla linea mediana all'area sottocostale sinistra. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni nel peritoneo parietale osservando i vasi sotto la luce.
- Avvolgere lo stomaco con garza bagnata e spostare delicatamente lo stomaco a destra all'esterno del corpo per rivelare gli organi retroperitoneali. Inserire una tacca tra i muscoli dell'eretore della colonna vertebrale e il tessuto adiposo usando forbici chirurgiche e separarli senza mezzi termini con le dita.
- Togliere con cura il tessuto connettivo attorno al dotto toracico. Il tessuto connettivo in eccesso aumenta con l'età. Esporre il condotto toracico da appena sotto i cru a sinistra del diaframma caudally fino a quando non era visibile una lunghezza di 20 mm del condotto toracico. Separare delicatamente le aderenze tra il dotto toracico e l'aorta utilizzando pinzette di precisione o tamponi di cotone bagnati.
- Eseguire attentamente questo processo perché alcuni ratti hanno arteriole ramificate dall'arteria addominale che attraversano il dotto toracico o un dotto toracico corto a causa di una posizione più elevata del plesso linfatico (piccoli dotti toracici che si diffondono come ragnatele). Evitare il contatto non necessario con il dotto toracico per evitare di indurre edema.
- Applicare una legatura di una corda (seta 3-0) sul condotto toracico appena sotto i cru a sinistra del diaframma. Il dotto toracico caudale viene disteso.
- Fare un foro (5 mm di diametro) nella parete addominale pugnalando il tagliente delle forbici chirurgiche, passare il tubo di cannula curva a forcina e ligare il tubo sul muscolo iliopsoas in un certo punto. Riempire il tubo di cannula con soluzione salina normale contenente 10 U/mL di eparina.
- Dopo aver posizionato una corda (seta 3-0) sotto il dotto toracico disteso, pugnalare il dotto toracico con il bordo affilatamente tagliato di un tubo di cannula, cannularlo verso la coda di circa 5 mm e ligare il dotto toracico con tubo di cannula per la fissazione.
- Per fornire salina per prevenire la disidratazione, creare un foro (3 mm di diametro) sulla parete anteriore dell'antro dello stomaco usando pinzette di precisione e passare il tubo di silicio (2 mm di diametro) al duodeno attraverso l'anello pilorico. Dopo aver ricucito una ferita e mantenuto gli animali nelle gabbie di Bollman, inizia a infondere saline cariche di zucchero nel duodeno di ogni topo dal tubo di silicio ad una portata di 3 mL / h. Coprire l'intera gabbia con un tovagliolo di carta per tenerlo caldo.
- Fissare il tubo di cannula al foro al centro del coperchio di un tubo conico da 50 ml su ghiaccio contenente 6 Eparina U/ml, siero bovino fetale al 10% e mezzo RPMI 1640 (pH 7.4; vedi tabella dei materiali) e raccogliere linfociti del dotto toracico (TDL) sul ghiaccio. Fare attenzione a non contattare la punta del tubo alla parete del tubo conico per evitare l'occlusione del tubo cannulato a causa della formazione di coaguli di fibrina all'interno del tubo. Il liquido linfatico (circa 20 mL) di cui circa 1,0 x 108~ 109 linfociti può essere ottenuto in 6 ore. Per ottenere i linfociti in anestesia completa, viene monitorato il piano di anestesia e il flusso linfatico viene osservato in modo appropriato. Gli stessi anestetici vengono aggiunti alla stessa dose circa 3 ore dopo che i ratti sono stati messi nella gabbia di Ballman per ottenere continuamente anestesia profonda per 6 ore.
2. Etichettatura dei linfociti con carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFDSE)
- Sciogliere il CFDSE(Tabella dei Materiali)nel solfossido di dimetile (DMSO) a 15,6 mM (500 μg di CFDSE sciolto in 60 μL di DMSO).
- Incubare i linfociti (1 x 108~109) in 50 mL di RPMI 1640 con 50 μL di soluzione CFDSE per 30 min a 37 °C come descritto in precedenza10.
3. Configurazione sperimentale per studi microvascolari
- Anestetizzare ratti riceventi (8-12 settimane) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Midazolam (2 mg/kg), Domitor (0,15 mg/kg) e Betulphar (2,5 mg/kg) e confermare la profondità dell'anestesia con il pizzico. Bagnare l'addome prima di toeleggiare la pelliccia per ridurre al minimo la contaminazione dei capelli. Quindi aprire l'addome del ratto Wister ricevente tramite un'incisione della linea mediana.
- Metti un topo su una piastra portatile in acciaio inossidabile (circa 120 x 300 mm) con un foro rettangolare intorno al centro coperto da uno scivolo di vetro (24 x 50 mm). Scegli circa 10 cm del segmento ileale inclusi i PP per l'osservazione.
- Mantenere l'intestino il più caldo possibile e umido con soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) riscaldata a 37 °C. Immergere la garza che viene utilizzata per coprire l'intestino tenue con PBS.
- Pur dando anestesia continua con isoflurane al 2 % (vedi tabella dei materiali), mettere lo scivolo sul palco del microscopio e scegliere le aree adatte per l'osservazione del microcircolo nei PC in cui alcuni veicoli pesanti attraversano il serosa. Le dimensioni dei PC variano; quelli più grandi sono adatti per l'osservazione del microcircolo utilizzando CLSM. L'intestino tenue non è dritto in alcuni punti; un segmento rettilineo lungo almeno 2 cm senza alcuna tensione è adatto per l'osservazione.
- Coprire il segmento intestinale adiacente e mesentere con cotone assorbente imbevuto di PBS. Posizionare il segmento intestinale tra due batuffoli di cotone arrotolati e posizionarlo il più lontano possibile dal corpo del topo per evitare che venga vibrato dal battito cardiaco e dalla respirazione del topo.
- Utilizzando una siringa da 1 ml, iniettare lentamente (oltre 1 minuto) TDL con etichetta CFSE (1 x 108 cellule) nella vena giugulare dei ratti riceventi. Una rapida iniezione endovenosa può influenzare la circolazione sistemica.
4. Microcircolazione dei linfociti
- Monitorare continuamente i TDL nella microvascolarizzazione dei PC utilizzando il CLSM e registrare su un computer per 3 ore utilizzando la fotografia time-lapse a intervalli di 30 s. La profondità dal serosa all'HEV dei PS è di circa 25 μm, consentendo l'osservazione dello stroma e dei vasi linfatici capillari a una profondità di 30 μm.
- Iniettare Texas Red-dextran (25 mg/kg) nella vena giugulare di ogni ratto ricevente per macchiare il flusso sanguigno e Hoechest 33342 (5 mg/kg) per macchiare i nuclei cellulari.
- (Facoltativo) Per quantificare la dinamica dei linfociti, definire i linfociti aderenti agli HEV per più di 30 secondi come "linfociti adesivi" e linfociti che emigrano dagli HEV allo stroma come "linfociti migratori". Quindi calcolare la percentuale media di migrazione (linfociti migratori / linfociti adesivi + linfociti migratori) per campo visivo (circa 0,3 mm2).
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Representative Results
Raccolta di linfociti dalla linfa
Per preparare il ratto alla cannulazione del dotto toracico, fare un'incisione nel dotto toracico teso, come mostrato nella figura 1, quindi mantenere il ratto nella gabbia di Un Bollman, come mostrato nella figura 2.
Quando i linfociti sono ben raccolti, possiamo ottenere circa 20 mL / 6 h di liquido linfatico contenente circa 107~ 108/ mL linfociti. Tra i TDL, il 70% esprime CD4, tra cui circa il 90% delle cellule esprime CD62L, ovvero la composizione principale dei TDL (>60%) è costituito da linfociti intestinali-tropici ingenui. Poiché i linfociti raccolti qui sono cellule che migrano specificamente al tratto intestinale, sono adatti per valutare lo stato di migrazione nelle macchie di Peyer.
Osservazione microscopica
Dopo aver iniettato una dose adeguata di linfociti fluorescenti, montare l'intestino del ratto ricevente su uno scivolo di vetro, come mostrato nella figura 3. Un'immagine microscopica dei PC nelle condizioni fisiologiche è mostrata nella figura 4.
Per la micro-osservazione, i ratti possono essere anestetizzati stabilmente sotto laparotomia per circa 3 ore. I linfociti aderiscono agli HEV, rotolano e migrano verso lo stroma circostante, quindi migrano verso i capillari linfatici. Abbiamo quantificato e valutato la percentuale di linfociti migrati nello stroma entro il periodo di osservazione.
Dopo l'iniezione di una dose adeguata di linfociti fluorescenti, i linfociti intestino-tropici iniziano ad aderire agli HEV e migrano attraverso l'endotelio nello stroma in circa 1 ora. La maggior parte si muove all'interno dello stroma, mentre altri migrano verso i capillari linfatici in circa 2-3 ore. L'etichettatura a fluorescenza ben sviluppata ex vivo in questo studio ha portato ad alta intensità e ci consente di osservare la dinamica dei linfociti di un'area molto profonda. Inoltre, utilizzando un diverso tipo di etichettatura a fluorescenza, possiamo facilmente osservare contemporaneamente dinamiche di diversi tipi di linfociti. Questa migrazione dei linfociti intestino-tropici può essere chiarita visivamente per la soppressione da parte di alcuni immunomodulatori come FTY720 come mostrato nel nostro precedente rapporto.
L'osservazione del sistema microcircolatorio stesso è estremamente difficile ed è auspicabile stabilire un metodo di valutazione facile. Questo studio ha anche permesso di scoprire dove si trova il sito d'azione del farmaco nelle patch del Peyer. In particolare, la somministrazione ex vivo di FTY720 ai linfociti ha permesso di limitare il sito d'azione solo ai linfociti ma non all'endotelio. In combinazione con la cernita di linfociti specifici, si oserebbe ottenere risultati più dettagliati.
Figura 1: Procedura per esporre il dotto toracico ed eseguire la cannulazione. Dopo aver tagliato il peritoneo longitudinalmente, il dotto toracico può essere esposto spostando lo stomaco cranicamente e sezionando il tessuto connettivo sul lato destro dorsale dell'aorta addominale. Il tessuto connettivo intorno al diaframma deve essere accuratamente sezionato per prevenire lesioni. Il dotto toracico deve essere esposto nel modo più ampio possibile per creare spazio sufficiente per la cannulazione e quindi legato da una sutura di seta 3-0 appena sotto il diaframma per fermare il flusso di linfa e trattenere il fluido caudally. Il liquido linfatico lattiero è visibile attraverso il condotto linfatico, dove è possibile inserire il catetere. Il dotto toracico del ratto deve essere leggermente teso per garantire una cannulazione liscia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Un'immagine dell'intera impostazione per raccogliere i linfociti del dotto toracico (TDL). I ratti vengono mantenuti nelle gabbie di Bollman e i TDL vengono raccolti attraverso il tubo di cannula in ogni flaconcino. Le fiale vengono impostate sul ghiaccio e sostituite ogni 12 ore per raccogliere liquido linfatico fresco. La salina carica di zucchero viene somministrata attraverso un tubo di silicone utilizzando una pompa per siringhe ad una velocità di circa 3 ml/h per prevenire la disidratazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il ratto viene messo sullo stadio del microscopio collegato alla macchina per anestesia e una sostanza fluorescente o linfociti con etichetta fluorescente vengono iniettati dal catetere venoso attraverso la vena giugulare interna (A). L'area di osservazione del tratto intestinale è stata delicatamente fissata tra due batuffoli di cotone arrotolati. Il tratto intestinale è stato fissato lontano dal tronco per evitare vibrazioni da movimenti respiratori. I batuffoli di cotone arrotolati sono stati imbevuti di salina tamponata dal fosfato per evitare l'essiccazione dell'intestino durante il periodo di osservazione (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine microscopica delle chiazze di Peyer nella condizione fisiologica (A). I nuclei delle cellule endoteliali vascolari sono macchiati di blu. Il plasma sanguigno è rosso e il flusso sanguigno viene rilevato dal flusso di cellule non contaminate. Linfociti guttropici (verde macchiato) che aderiscono ad alte venute endoteliali(B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui abbiamo descritto un protocollo per la raccolta di linfociti intestinali-tropici ingenui e l'osservazione della loro migrazione nei PC di ratto. Queste procedure possono rivelare come i linfociti si muovono nella microvascolarizzazione dei PC e consentire di confrontare visivamente la loro dinamica in una condizione normale o medicata. L'osservazione diretta di queste dinamiche ha molto merito di ottenere un indizio per la modifica immunologica da parte di alcuni farmaci, anche se il periodo osservazionale è limitato a poche ore.
Abbiamo menzionato alcuni suggerimenti nei metodi. Tra questi, una delle procedure più delicate è che l'operatore deve cannulato il dotto toracico in modo rapido e preciso. Se un'operazione richiede molto tempo e comporta danni inutili, si verificano sanguinamenti e infiammazioni significativi, con conseguente diminuzione della raccolta di TDL a causa dell'edema del tessuto connettivo e dell'ostruzione del dotto toracico. Abbiamo usato per cannulare il tubo dopo aver creato una piccola incisione sul condotto toracico usando forbici con un piccolo tagliente. Tuttavia, questa procedura interferisce con il sito di cannula a causa della linfa drenante. Pertanto, ora non tagliamo il dotto toracico; piuttosto, lo pugnaliamo con un bordo affilato. Questo metodo semplifica la cannulazione e aumenta i tassi di successo. Inoltre, il sito di incisione nel dotto toracico è molto importante a causa della limitata cavità addominale. Se il sito di incisione è troppo vicino al diaframma, la parte curva del tubo di cannula urterebbe contro il diaframma. Se è troppo lontano dal diaframma, è anche difficile cannulare il tubo abbastanza profondamente da garantire la fissazione dovuta al plesso linfatico del dotto toracico caudale. Anche in caso di buona cannulazione, il tubo di cannula può essere facilmente occluso dalla formazione di fibrina. Pertanto, si consiglia periodicamente di lavare delicatamente il tubo con eparina.
I recenti progressi nel CLSM hanno permesso di osservare l'area focalizzata in modo più chiaro e preciso in tempo reale rispetto a un precedente studio11. Ora usiamo clsm nel nostro laboratorio, ma possiamo osservare il microcircolo più chiaramente utilizzando un microscopio multifotonico. Sebbene il protocollo richieda modifiche in diversi punti insieme al progresso tecnico, consente l'osservazione dell'area localizzata dell'organodi interesse 12,13.
Il merito e la chiave del metodo è che si tratta di separare i linfociti dagli animali riceventi, incubarli utilizzando qualsiasi tipo di composti in vitro e osservarli dopo la loro iniezione negli animali riceventi. Ciò consente di chiarire gli effetti dei soli linfociti. Al contrario, se vogliamo chiarire gli effetti di qualsiasi tipo di composti su cellule diverse dai linfociti, come l'endotelio vascolare, possiamo trattare gli animali riceventi con qualsiasi tipo di composti e osservarli dopo l'iniezione di linfociti di controllo. Per chiarire le stesse cose usando i topi, dobbiamo creare animali geneticamente manipolati condizionali uno per uno. Inoltre, lo smistamento dei linfociti isolati utilizzando specifici marcatori superficiali consentirebbe di studiare la dinamica di specifici tipi di linfociti.
Come mostrato nel video di questo studio, i linfociti si muovono indefinitamente e lateralmente attraverso l'endotelio vascolare del corpo reale, quindi è difficile valutare gli effetti sul loro comportamento usando solo osservazioni in vivo. Inoltre, se si vuole esaminare il meccanismo d'azione di un farmaco somministrato, in origine non è adatto per esaminare ogni sito d'azione. Il merito di questo studio è che separando i linfociti e incubandoli in vitro, gli effetti medicinali possono essere esaminati separatamente sul lato vascolare e linfocitario. Meno variabili sono più facili da analizzare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Defense Medical College e da una borsa di ricerca per la salute e le scienze del lavoro per la ricerca sulle malattie intrattabili del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
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