Summary
Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.
Abstract
Naif lenfositler fizyolojik durum altında kandan lenfoid dokulara sirkülasyon yapar ve genellikle bağırsak bağışıklığında önemli bir fenomen olarak kabul edilir. Peyer yamaları (PP'ler) veya mezenterik lenf düğümleri gibi ikincil lenfoid organların stroma'sı, naif lenfositlerin antijenleri algıladığı yerdir. Naif lenfositler, PP'lere giriş portalı olan yüksek endotel venule'lere ulaşmak için kan dolaşımında dolaşır. Bazı immünomodülatörlerin lenfosit göçini etkilediği tahmin edilmektedir, ancak mikrositülasyon dinamiklerinin kesin olarak değerlendirilmesi çok zordur ve lenfosit göçini in vivo olarak gözlemlemek için bir yöntem oluşturmak kesin mekanizmaların netleşmesine katkıda bulunabilir. Lenf kanalından lenfosit toplama ve sıçan PP'lerindeki bağırsak-tropik lenfositlerin ayrıntılı dinamiklerini gözlemleme yöntemini iyileştirdik. Fare PP'lerini in vivo olarak gözlemlemek için konfokal lazer tarama mikroskopisini seçtik ve zaman atlamalı fotoğrafçılık kullanarak kaydettik. Artık lenfosit dinamiklerinin analizine katkıda bulunabilecek net görüntüler elde edebiliriz.
Introduction
Peyer'in yamaları (PP'ler) ince bağırsağın lamina propriasında yüzlerce lenfoid folikülden oluşur. PP'ler foliküllere, foliküller bölgeye ve lenfositlerin antijen sunumu ile uyarıldığı foliküllerin alt kısmında bulunan germinal merkezlere ayrılır. Farklı lenfatik damarlar yoktur ve antijenler epitel hücre tabakası yoluyla bağırsak lümeninden lamina propriasını istila eder. Lenfoid folikülleri kapsayan epitel bölgesine, özel serpiştirilmiş M hücrelerinin mukozal antijenleri aldığı folikül ilişkili epitel denir. M hücreleri luminal taraftan antijenleri alır ve antijenler daha sonra dendritik hücreler tarafından yakalanır ve yüksek endotel venules (HEV' ler) endotel yoluyla PP'lere akan naif lenfositlere doğru sunulur1. PP'ler bağırsak bağışıklığında önemli bir rol oynar ve iltihabın erken evresi ile ilgilidir. Birçok moleküler etkileşim, lenfositlerin yapışma molekülleri, kemokinler 2,3ve sphingosine-1-fosfat4dahil olmak üzereikincil lenfoid organlara (SLO' lar) girişini içerir; bu nedenle, beklenen birçok terapötik hedef vardır. Bu nedenle, PP'lerdeki lenfosit dinamiklerini gözlemlemek, iltihabın çok erken aşamasına bir göz atmamızı ve umut verici birkaç ilacın yararlılığını incelememizi sağlar.
Buradaki yöntem, PP'lerde lenfositlerin göçüne odaklanır, bu da çeşitli prosedürleri içerir (torasik kanal5'e öykünme ve lenfositlerin toplanması ve toplanan lenfositlere enjeksiyondan sonra uzun süreli gözlem). Bu prosedürler karmaşık olduğundan ve önceki raporlarda her prosedürün tam olarak nasıl yapıldığını görmek zor olduğundan, başarılı bir gözlem elde etmek için burada bazı ipuçlarından bahsettik. Örneğin, tüplerin torasik kanala girebilmesi çok zordu ve ilk başarı oranı% 50'den azdı. Bununla birlikte, yöntemi geliştirdik ve% 80'i aşan bir başarı oranı elde ettik. Bu yazıda, lenfositlerin transendotelit göçünün çeşitli koşullar altında nicel olarak değerlendirilmesini sağlamak için başarılı gözlem için gerekli olan diğer bazı ipuçlarından bahsetmiştir.
Önceki raporlarda, PPs6'nındamar yapısını leke etmek için Hindistan mürekkebinin intravenöz enjeksiyonu veya mikroskop monofokal7gibi zamandaki üç boyutlu değişiklikleri anlamak zordu. Son yıllarda, Kaede fareleri gibi bazı foto-dönüşümlü floresan protein transgenik hayvanlar kullanılarak gözlemsel bir yöntem, sistematik hücresel hareketleri netleştirdi vivo8. Diğer çalışma, CD69 lenfosit çıkışlarının PPs9'danbağımsız olarak kapatılmasını açıklığa kavuşturdu. Yüksek analitik özelliği nedeniyle konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullandık. Artık yüksek çözünürlüklü görüntüleri kolayca elde edebilir ve lenfosit dinamiklerini analiz etmek için kullanabiliriz.
Bu olguda PP'lerde lenfosit göçünün değerlendirilmesi için bir dizi yöntem gösterilmiştir. İlk olarak, lenfositleri toplamak için torasik kanal cannülasyonunun rafine yöntemlerini gösterdik. İkinci olarak, gözlemsel yöntemleri mikroskobik gözlem altında mümkün olduğunda objektif organları korumak için çeşitli şekillerde geliştirdik ve 3 saat boyunca yüksek kaliteli görüntüler elde etmemizi sağladık. Üçüncü olarak, bazı ilaçların etkilerini değerlendirmek için lenfosit göçünün hücresel hareketlerini ölçtük. Bu değiştirilmiş protokoller mukozal immünoloji değerlendirmelerinin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokol, Ulusal Savunma Tıp Koleji Hayvan Araştırma Komitesi (no. 16058) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar standart laboratuvar yemeklerinde (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japonya) muhafaza edildi. Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak tedavi edildi.
1. Lenfositlerin toplanması ve ayrılması
NOT: Lenfositler taze olması ve depolanamaması gerektiğinden, her deney için sıçanlardan toplanmalıdır. Ek olarak, bağırsak-tropik lenfositler doğrudan dolaştıkları torasik kanaldan toplanmalıdır. Tüm prosedürlerin 6 saat içinde tamamlanması beklenir ve tüm aletler, eldivenler ve yüzeyler temizdir. Hayvanları fizyolojik olarak stabil bir durumda tutmak için, deneyde kullanılan tüm tuzlu su ve diğer sıvılar sıcak tutulmalıdır.
- Sıcak suya (yaklaşık 80-90 °C) batırdıktan sonra heparin eğrisi (yaklaşık 5 mm yarıçapı) gibi bir kavis tüpü (1 mm çapında) oluşturur ve birkaç saat önceden yapışkan bant kullanarak plastik bir tahtaya sabitleyin.
- Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ve Betulphar (2.5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile erkek bir Wistar sıçanını (8-12 hafta) uyuşturun ve bir saç kesme makinesi kullanarak karnın vücut kıllarını kesin. Tıraş olduktan sonra saçları sıkıca çıkarın, böylece saç karın boşluğuna girmez.
- İşlem için gerekli olan sabit anestezi derinliğinin parmak sıkışması ile elde edildiğini doğruladıktan sonra orta çizgiden sol altkozal bölgeye yatay olarak cerrahi makasla bir kesi yapın. Işık altındaki damarları izleyerek parietal peritondaki kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
- Mideyi ıslak gazlı bezle sarın ve retroperitoneal organları ortaya çıkarmak için mideyi hafifçe vücudun dışına doğru hareket ettirin. Cerrahi makas kullanarak omurganın erektör kasları ile yağ dokusu arasına bir çentik yerleştirin ve parmaklarla açıkça ayırın.
- Torasik kanalın etrafındaki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Fazla bağ dokusu yaşla birlikte artar. Torasik kanalın 20 mm uzunluğu görünene kadar diyaframın sol haçlarının hemen altından kaudally olarak ortaya çıkın. Hassas cımbız veya ıslak pamuklu çubuklar kullanarak torasik kanal ve aort arasındaki yapışıklıkları hafifçe ayırın.
- Bu işlemi dikkatlice gerçekleştirin, çünkü bazı sıçanlar, lenf pleksusunun (örümcek ağları gibi yayılan küçük torasik kanallar) daha yüksek bir konumu nedeniyle torasik kanal veya kısa bir torasik kanal üzerinden geçen karın arterinden dallanma arteriküllerine sahiptir. Ödemi önlemek için torasik kanala gereksiz temastan kaçının.
- Diyaframın sol haçlarının hemen altındaki torasik kanala bir dize (3-0 ipek) ile bir bağ uygulayın. Kaudal torasik kanal distended olur.
- Cerrahi makasın kesme kenarını bıçaklayarak karın duvarında bir delik (5 mm çapında) yapın, saç tokası kavisli kavis tüpünü geçirin ve tüpü bir noktada iliopsoas kasında lige edin. Kanülasyon tüpünü 10 U/mL heparin içeren normal salin ile doldurun.
- Distended torasik kanalın altına bir ip (3-0 ipek) yerleştirdikten sonra, torasik kanalı bir kanülasyon tüpünün keskin bir şekilde kesilmiş kenarıyla bıçaklayın, kuyruğa doğru yaklaşık 5 mm'lik bir şekilde kanülasyona doğru kanülat ve sabitleme için torasik kanalı kanülasyon tüpü ile kesin.
- Dehidrasyonu önlemek için salin sağlamak için, hassas cımbız kullanarak mide karıncalanmasının ön duvarında bir delik (3 mm çapında) oluşturun ve silikon tüpü (2 mm çapında) pirorik halkadan duodenuma geçirin. Bir yarayı diktikten ve Bollman'ın kafeslerindeki hayvanların bakımını yaptıktan sonra, silikon tüpten her sıçanın duodenumuna 3 mL / s akış hızında şeker yüklü salin aşılamaya başlayın. Tüm kafesi sıcak tutmak için bir kağıt havlu ile örtün.
- Kanülasyon tüpünü, 6 U/mL heparin, %10 fetal sığır serumu ve RPMI 1640 ortamı (pH 7.4; malzeme tablosuna bakın) içeren buz üzerindeki 50 mL'lik konik tüpün kapağının ortasındaki deliğe sabitlayın ve buz üzerinde torasik kanal lenfositleri (TDL' ler) toplayın. Tüpün içindeki fibrin pıhtı oluşumuna bağlı olarak kanüle edilmiş tüp tıkanıklığını önlemek için tüpün ucunu konik tüpün duvarına temas etmemeye dikkat edin. Yaklaşık 1.0 x 10 8 ~109lenfosit içeren lenf sıvısı (yaklaşık20 mL) 6 saat içinde elde edilebilir. Lenfositleri tam anestezi altında elde etmek için anestezi düzlemi izlenir ve lenf akışı uygun şekilde gözlenir. Aynı anestezikler, sıçanlar Ballman'ın kafesine konduktan yaklaşık 3 saat sonra 6 saat boyunca sürekli derin anestezi elde etmek için aynı dozda eklenir.
2. Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDSE) ile lenfosit etiketleme
- CFDSE'yi(Malzeme Masası)dimetil sülfit (DMSO) ile 15,6 mM (60 μL DMSO'da çözünmüş 500 μg CFDSE) ile çözün.
- Daha önce açıklandığı gibi 37 °C'de 30 dakika boyunca50 μLCFDSE çözeltisi ile 50 mL RPMI 1640'ta inkübte lenfositler (1 x 108~10 9).
3. Mikrovasküler çalışmalar için deneysel kurulum
- Alıcı sıçanları (8-12 hafta) Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) ve Betulphar (2,5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve anestezinin derinliğini parmak sıkışması ile onaylayın. Saç kirlenmesini en aza indirmek için kürkü tımar etmeden önce karnı ıslatın. Daha sonra alıcı Wister sıçanının karnını orta çizgi kesiğiyle açın.
- Merkezin etrafında cam bir slaytla (24 x 50 mm) kaplı dikdörtgen deliği olan taşınabilir paslanmaz çelik bir plakaya (yaklaşık 120 x 300 mm) bir sıçan koyun. Gözlem için PP'ler de dahil olmak üzere ileal segmentin yaklaşık 10 cm'sini seçin.
- Bağırsağı mümkün olduğunca sıcak tutun ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 °C'ye ısıtılır. İnce bağırsağı PBS ile örtmek için kullanılan gazlı bezi ıslatın.
- % 2 izofluran ile sürekli anestezi verirken (bkz. malzeme tablosu), slaytı mikroskop sahnesine koyun ve bazı HEV'lerin serosadan geçtiği PP'lerde mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygun alanları seçin. PEN'lerin boyut aralığı; daha büyük olanlar CLSM kullanarak mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygundur. İnce bağırsak yerlerde düz değildir; herhangi bir gerginlik olmadan en az 2 cm uzunluğunda düz bir segment gözlem için uygundur.
- Bitişik bağırsak segmentini ve mezentery'yi PBS ile ıslatılmış emici pamukla örtün. Bağırsak segmentini iki yuvarlanmış pamuk topu arasına yerleştirin ve sıçanın kalp atışı ve solunumu tarafından titreşmesini önlemek için sıçanın vücudundan mümkün olduğunca uzağa yerleştirin.
- 1 mL şırıng kullanarak, alıcı sıçanların şahdamarına cfse etiketli TDL'leri (1 x10 8 hücre) yavaşça enjekte edin. Hızlı bir intravenöz enjeksiyon sistemik dolaşımı etkileyebilir.
4. Lenfositlerin mikrositülasyonu
- CLSM kullanarak PP'lerin mikrovaskülatındaki TDL'leri sürekli izleyin ve 30 s aralıklarla hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak bir bilgisayarda 3 saat boyunca kayıt yaptırın. Serosadan PP'lerin HEV'sine kadar olan derinlik yaklaşık 25 μm'dir ve stroma ve kılcal lenf damarlarının 30 μm derinliğe kadar gözlemlenmesine olanak tanır.
- Kan dolaşımını lekelamak için her alıcı sıçanın şahdamarına Texas Red-dektran (25 mg/kg) ve hücre çekirdeğini lekelamak için Hoechest 33342 (5 mg/kg) enjekte edin.
- (İsteğe bağlı) Lenfosit dinamiklerini ölçmek için, HEV'lere bağlı kalan lenfositleri 30 saniyeden fazla "yapışkan lenfositler" ve HEV'lerden stroma'ya göç eden lenfositleri ''lenfositler' olarak tanımlayın. Daha sonra görme alanı başına ortalama göç yüzdesini (göç eden lenfositler / yapışkan lenfositler + göç eden lenfositler) hesaplayın (yaklaşık 0,3 mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lenfositlerin lenfositlerden toplanması
Sıçanı torasik kanal cannülasyonuna hazırlamak için, Şekil 1'de gösterildiği gibi gergin torasik kanala bir kesi yapın ve daha sonra sıçanı Şekil 2'degösterildiği gibi bir Bollman'ın kafesinde muhafaza edin.
Lenfositler iyi toplandığında, yaklaşık 107~ 10 8 / mL lenfosit içeren yaklaşık 20 mL /6h lenf sıvısı elde edebiliriz. TDL'lerin% 70'i CD4'ü, aralarında yaklaşık% 90 hücrelerin CD62L'yi ifade ettiği, yani TDL'lerin ana bileşimi (%60) naif bağırsak-tropik lenfositlerden oluşur. Burada toplanan lenfositler özellikle bağırsak sistemine göç eden hücreler olduğundan, Peyer'in yamalarındaki göç durumunu değerlendirmek için uygundurlar.
Mikroskobik gözlem
Yeterli dozda floresan lenfosit enjekte ettikten sonra, alıcı sıçanın bağırsasını Şekil 3'tegösterildiği gibi bir cam kaydırağa monte edin. Fizyolojik durumdaki PP'lerin mikroskobik bir görüntüsü Şekil 4'te gösterilmiştir.
Mikro gözlem için sıçanlar yaklaşık 3 saat boyunca laparotomi altında bıçaklanarak uyuşturulabilir. Lenfositler HEV'lere yapışır, yuvarlanır ve çevredeki stromaya göç eder ve daha sonra lenf kılcal damarlarına göç eder. Gözlem süresi içinde stromada göç eden lenfositlerin yüzdesini ölçtük ve değerlendirdik.
Yeterli dozda floresan lenfosit enjekte ettikten sonra, bağırsak-tropik lenfositler HEV'lere yapışmaya başlar ve endotel boyunca yaklaşık 1 saat içinde stromaya göç eder. Çoğu stroma içinde hareket ederken, diğerleri yaklaşık 2-3 saat içinde lenf kılcal damarlarına göç eder. Bu çalışmada iyi gelişmiş floresan etiketleme ex vivo yüksek yoğunluklu sonuçlandı ve çok derin alanın lenfosit dinamiklerini gözlemlememizi sağladı. Ek olarak, farklı bir floresan etiketlemesi kullanarak, farklı lenfosit türlerindeki dinamikleri aynı anda kolayca gözlemleyebiliriz. Bu gut-tropik lenfosit göçü, önceki raporumuzda gösterildiği gibi FTY720 gibi bazı immünomodülatörler tarafından baskılama için görsel olarak netleştirilebilir.
Mikro sirkülatör sistemin kendisinin gözlemlenmesi son derece zordur ve kolay bir değerlendirme yöntemi oluşturulması arzu edilir. Bu çalışma, ilacın eylem alanının Peyer'in yamalarında nerede olduğunu bulmayı da mümkün kıldı. Özellikle, FTY720'nin lenfosit için ex vivo yönetimi, etki alanını sadece lenfositlerle sınırlamayı mümkün kıldı, ancak endotel için değil. Spesifik lenfositlerin tasnif edilmesi ile birlikte daha ayrıntılı sonuçlar elde edilecekti.
Şekil 1: Torasik kanalın ortaya çıkarılması ve canülasyonun gerçekleştirilmesi prosedürü. Peritonu boyuna kestikten sonra, torasik kanal mideyi kranially hareket ettirerek ve karın aortunun dorsal sağ tarafındaki bağ dokusunu keserek maruz kalabilir. Diyaframın etrafındaki bağ dokusu yaralanmayı önlemek için dikkatlice incelenmelidir. Torasik kanal, canülasyon için yeterli alan oluşturmak için mümkün olduğunca geniş kranial olarak maruz kalmalı ve daha sonra lenf akışını durdurmak ve sıvıyı kaudally tutmak için diyaframın hemen altında 3-0 ipek dikiş ile liglenmelidir. Sütlü lenf sıvısı, kateterin yerleştirilebileceği lenf kanalından görülebilir. Sıçanın torasik kanalı, pürüzsüz bir canülasyon sağlamak için hafifçe zorlanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Torasik kanal lenfositlerini (TDL' ler) toplamak için tüm ayarın görüntüsü. Sıçanlar Bollman'ın kafeslerinde tutulur ve TDL'ler kanülasyon tüpünden her şişeye toplanır. Şişeler buza ayarlanır ve taze lenf sıvısı toplamak için her 12 saatte bir değiştirilir. Şeker yüklü salin, dehidrasyonu önlemek için yaklaşık 3 mL / s hızında bir şırıng pompası kullanılarak silikon bir tüpten uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıçan, anestezi makinesine bağlı mikroskop aşamasına konur ve venöz kateterden iç juguler damardan(A)floresan bir madde veya floresan etiketli lenfositler enjekte edilir. Bağırsak sisteminin gözlem alanı iki yuvarlanmış pamuk topu arasına hafifçe sabitlendi. Bağırsak sistemi, solunum hareketleriyle titreşimi önlemek için gövdeden uzağa sabitlendi. Yuvarlanmış pamuk topları, gözlem süresi boyunca bağırsağın kurumasını önlemek için fosfat tamponlu salin içine batırılmıştır (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Peyer'in fizyolojik durumdaki yamalarının mikroskobik görüntüsü (A). Vasküler endotel hücrelerinin çekirdekleri maviye boyanmıştır. Kan plazması kırmızıdır ve kan akışı bozulmamış hücrelerin akışı ile tespit edilir. Gut-tropik lenfositler (lekeli yeşil) yüksek endotel venules(B)bağlı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada naif gut-tropik lenfositlerin toplanması ve sıçan PP'lerinde göçlerinin gözlemlenmesi için bir protokol tanımladık. Bu prosedürler, lenfositlerin PP'lerin mikrovaskülürinde nasıl hareket ettiğini ortaya getirebilir ve dinamiklerini normal veya ilaçlı bir durum altında görsel olarak karşılaştırmayı mümkün kılabilir. Gözlem süresi sadece birkaç saatle sınırlı olmasına rağmen, bu dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, bazı ilaçlar tarafından immünolojik modifikasyon için bir ipucu elde etmek için çok değerlidir.
Yöntemlerde bazı ipuçlarından bahsettik. Bunlar arasında, en hassas prosedürlerden biri, operatörün torasik kanalı hızlı ve hassas bir şekilde yalıtılması gerektiğidir. Bir operasyon uzun sürerse ve gereksiz hasar içeriyorsa, önemli kanama ve iltihap meydana gelir, bu da bağ dokusunun ödemi ve torasik kanalın tıkanması nedeniyle TDL toplanmasında azalmaya neden olur. Torasik kanal üzerinde küçük bir kesi oluşturduktan sonra tüpü küçük bir kesme kenarlı makas kullanarak yalıtırdık. Bununla birlikte, bu prosedür lenf boşaltma nedeniyle canülasyon bölgesine müdahale eder. Bu nedenle, şimdi torasik kanalı keseceğiz; Aksine, keskin bir kenarla bıçaklarız. Bu yöntem canülasyonu kolaylaştırır ve başarı oranlarını artırır. Ayrıca torasik kanaldaki kesi bölgesi karın boşluğunun kısıtlı olması nedeniyle çok önemlidir. Kesi bölgesi diyaframa çok yakınsa, cannülasyon tüpünün kavisli kısmı diyaframa çarpar. Diyaframdan çok uzaksa, kaudal torasik kanalın lenf pleksusu nedeniyle sabitlenmeyi sağlayacak kadar tüpün yalıtılması da zordur. İyi kanülasyon durumlarında bile, kanülasyon tüpü fibrin oluşumu ile kolayca tıkanabilir. Bu nedenle, tüpü periyodik olarak heparin ile hafifçe yıkamanızı öneririz.
CLSM'deki son gelişmeler, odaklanmış alanın önceki bir çalışmaya kıyasla gerçek zamanlı olarak daha net ve hassas bir şekilde gözlemlenişini mümkün kıldı11. Şimdi laboratuvarımızda CLSM kullanıyoruz, ancak mikroskrkülasyonu çoktoğraf mikroskop kullanarak daha net bir şekilde gözlemleyebiliyorum. Protokol, teknik ilerleme ile birlikte birkaç noktada değişiklik gerektirse de, ilgi organının lokalize alanının gözlemlenmesine izin sağlar12,13.
Yöntemin değeri ve anahtarı, lenfositleri alıcı hayvanlardan ayırmayı, her türlü bileşiği in vitro kullanarak kuluçkaya yatırarak ve alıcı hayvanlara enjeksiyonlarından sonra gözlemlemeyi içermesidir. Bu, lenfositlerin etkilerini tek başına aydınlatıcı hale getirir. Aksine, vasküler endotel gibi lenfositler dışındaki hücreler üzerindeki her türlü bileşiğin etkilerini ortaya çıkarmak istiyorsak, alıcı hayvanları her türlü bileşikle tedavi edebilir ve kontrol lenfositlerinin enjeksiyonundan sonra gözlemleyebiliriz. Fareleri kullanarak aynı şeyleri ortaya çıkarmak için, koşullu genetik olarak manipüle edilmiş hayvanları tek tek yaratmalıyız. Ek olarak, izole lenfositlerin belirli yüzey belirteci kullanılarak sıralenmesi, belirli lenfosit türlerinin dinamiklerinin incelenmesini mümkün klas olacaktır.
Bu çalışmanın videosunda gösterildiği gibi, lenfositler süresiz ve yanal olarak gerçek vücudun vasküler endotelinde hareket eder, bu nedenle davranışları üzerindeki etkileri sadece in vivo gözlemleri kullanarak değerlendirmek zordur. Ayrıca, uygulanan bir ilacın etki mekanizması incelenecekse, başlangıçta her etki alanını incelemek için uygun değildir. Bu çalışmanın değeri, lenfositleri ayırarak ve in vitro olarak inkübe ederek, tıbbi etkilerin damar ve lenfosit taraflarında ayrı ayrı incelenebilmesidir. Daha az değişkeni analiz etmek daha kolaydır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Savunma Tıp Koleji'nden ve Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'nın inatçı hastalıklarla ilgili araştırmalar için sağlık ve çalışma bilimleri araştırma hibesi ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B.
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
