Summary
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 항체-광흡수제(IR700Dye) 컨쥬게이트와 NIR 라이트를 활용하여 암세포를 파괴하는 신흥 암 치료 전략이다. 여기서, 우리는 생물발광 이미징을 사용하여 흉막 전파폐암 및 악성 흉막 중피종의 마우스 모델에서 NIR-PIT의 항종양 효과를 평가하는 방법을 제시한다.
Abstract
광면역요법의 효능은 피하요법보다 치열식 마우스 모델로 보다 더 정확하게 평가될 수 있다. 흉막 보급 모델은 폐암 또는 악성 흉막 중피종과 같은 내트라토라시질환에 대한 치료 방법의 평가를 위해 사용될 수 있다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 NIR 광에 노출된 후 광흡수제(IR700Dye)에 의한 독성과 종양 표적화 항체의 특이성을 결합한 최근 개발된 암 치료 전략이다. NIR-PIT의 효능은 다양한 항체를 사용하여 보고되고 있다; 그러나, 단지 몇몇 보고는 치열 교정 모형에 있는 이 전략의 치료 효력을 보여주었습니다. 본 연구에서는 NIR-PIT를 사용하여 치료된 흉막 전파폐암 모델의 효능 평가의 예를 시연한다.
Introduction
암은 수십 년간의 연구에도 불구하고 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 한 가지 이유는 방사선 요법과 화학 요법이 매우 침습적 인 기술이며 치료 혜택을 제한 할 수 있기 때문입니다. 덜 침습적인 기술인 세포 또는 분자 표적 치료는 증가된 주의를 받고 있습니다. 광면역요법은 면역요법과 광선요법을 결합하여 치료 효과를 시너지효과를 향상시키는 치료 방법입니다. 면역 요법은 종양 미세 환경의 면역원성을 증가시키고 면역 조절 억제를 감소시켜 종양 면역력을 향상시켜 신체에서 종양이 파괴됩니다. 광요법은 광광원과 광선의 조합으로 1차 종양을 파괴하고, 종양 세포에서 방출되는 종양 특이적 항원들은 종양 면역력을 향상시킵니다. 종양은 표적 세포에 대해 구체적이고 선택적이기 때문에 광광합성제를 사용하여 선택적으로 치료될 수 있다. 광요법의 양면에는 광역학 치료(PDT), 광열 요법(PTT), 광화학 계 치료1이포함된다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 광화학계 치료와 면역요법1,2를결합한 최근 개발된 항종양 광요법 방법입니다. NIR-PIT은 근적외선 실리콘 프탈로시아닌 염료, IRdye 700DX(IR700)의 컨쥬레이션을 통해 특정 세포 표면 분자를 단일 클론 항체(mAb)로 표적화하는 분자 표적 요법이다. 표적 셀의 세포막은 NIR 광(690 nm)3로조사시 파괴된다.
기존의 광석제와 항체 또는 표적 PDT를 결합하여 표적 광요법을 사용하는 개념은3년이상4,5이다. 이전 연구는 항체에 그들을 연상시켜 기존의 PDT 에이전트를 대상으로 시도했다. 그러나, 이러한 컨쥬게이트가광세제6,7의소수성 때문에 간속에 갇혀 있었기 때문에 제한된 성공이 있었다. 더욱이, NIR-PIT의 메커니즘은 기존의 PDT와 완전히 다릅니다. 기존의 광세제는 광에너지를 흡수하고, 흥분된 상태로 탈구하고, 지면 상태로 전환하며, 아멸을 유발하는 에너지 변환으로 인한 산화 스트레스를 생성합니다. 그러나, NIR-PIT는 광화학 반응을 통해 막에 광합성제를 집합하여 세포막을 직접 파괴함으로써 급속한 괴사를 일으킨다8. NIR-PIT은 여러 가지 면에서 기존의 표적 PDT보다 우수합니다. 기존의 광세제는 낮은 소멸 계수를 가지고 있으며, 단일 항체 분자에 많은 수의 광세제부착이 필요하여 잠재적으로 결합 선호도를 감소시킵니다. 대부분의 종래의 광감제는 소수성으로, 광광전제를 면역 반응성 또는 생체 내 표적 축적을 손상시키지 않으면서 항체에 결합하는 것을 어렵게 만듭니다. 기존의 광세제는 일반적으로 가시 범위에서 빛을 흡수하여 조직 침투를 감소시킵니다.
폐암 과 악성 흉막 중피종 (MPM) 세포와 같은 내트라토라시종양을 대상으로 하는 NIR-PIT에 대한 여러 연구는9,10,11,12,13,14, 15,16,17로보고되었다. 그러나, 단지 몇몇 보고는 흉막 분비MPM 또는 폐암 모형9,10,11,12에서NIR-PIT의효험을기술했습니다. 피하 종양 이종이이식 모델은 표준 종양 모델로 생각되며 현재 새로운치료법(18)의항종양 효과를 평가하기 위해 널리 사용되고 있다. 그러나, 피하 종양 미세환경은 적절한 조직 구조또는 실제 악성표현형(19,20,21,22)을적절히 회수하는 조건의발달을허용하지 않는다. 이상적으로, 치열 교정 질병 모형은 항종양 효력의 보다 정밀한 평가를 위해 설치되어야 합니다.
여기서, 우리는 NIR-PIT를 사용하여 치료된 흉막 전파 폐암의 마우스 모델에서 효능 평가 방법을 시연한다. 흉막 보급 마우스 모델은 흉부 구멍에 종양 세포를 주입하여 생성되고 루시파제 발광을 사용하여 확인된다. 마우스는 IR700과 NIR 조사와 결합된 mAb의 정맥 주사로 가슴에 치료되었다. 치료 효과는 루시파아제 발광을 사용하여 평가하였다.
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Protocol
모든 생체 내 실험은 나고야 대학 동물 관리 및 사용 위원회의 실험실 동물 자원 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수하여 수행되었습니다 (승인 #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). 나고야 대학의 동물 센터에서 6 주 된 호모자고테 자티믹 누드 마우스를 구입하고 유지했습니다. 마우스에서 절차를 수행할 때, 그들은 이소플루란으로 마취하였다 (소개: 4-5%, 유지 보수 2-3%); 발은 마취의 깊이를 확인하기 위해 핀셋으로 눌렀습니다.
1. MAb와 IR700의 컨쥬게이션
- IR700 NHS 에스테르(66.8 mg, 34.2nmol, DMSO의 5mmol/L)를 1h에 대해 15-25°C에서 0.1 몰/L Na2HPO4(pH 8.6)로 인큐베이션멜(1 mg, 6.8nmol)을 장착했다.
- 컬럼(예: 세바덱스)을 사용하여 혼합물을 정화합니다. PBS로 컬럼을 준비하고 씻으시다. 이어서, 혼합물을 컬럼에 적용하고 정제된 IR700-공주 항체를 포함하는 방울을 수집한다. 이러한 IR700-공주 항체는 항체 광합성기 컨쥬게이트(APC)라고 한다.
- APC에서 단백질 및 IR700 농도를 측정합니다.
- 분광광계를 사용하여 단백질 및 IR700에 대한 교정 곡선을 준비합니다.
- 키트 프로토콜에 따라 단백질 분석 키트와 알부민의 표준 농도를 혼합합니다(재료표,쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 단백질 염색 참조). 595nm 파장에서 알부민의 흡광도를 측정하고, 다음 방정식을 사용하여 단백질에 대한 교정 곡선(선형 근사치 포뮬러)을 플롯합니다: y = 도끼 + b(x: 농도, y: 흡광도).
- 동일한 절차를 사용하여 690 nm에서 흡수된 IR700에 대한 교정 곡선을 가져옵니다. IR700의 표준 농도는 0.1-5 μM(0.1954-9.77 μg/mL)에서 권장됩니다.
- 교정 곡선 [x = (y-b)/a(x: 농도, y: 흡광도)]를 사용하여 APC의 단백질 농도 및 IR700 농도를 측정합니다.
- 어금니 농도의 결과로 mAb당 IR700 염료의 수를 결정한다.
참고: mAb 분자당 IR700 분자의 최적의 컨쥬게이션 수를 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 단일 mAb 분자에 결합된 약 3개의 IR700 분자는 시험관 내 및 생체 내모두에서 효과적일 것이다. 항체 당 많은 IR700 바운드 (예를 들어, 6) 쉽게 생체 내 실험 동안 간에서 갇혀 할 수 있습니다. IR700에 결합된 항체의 비율은 1:2-1:4의 범위에 있었다. 필요한 경우 IR700의 비율이 감소했습니다.
- APC의 형성을 위한 확인으로 나트륨 도데딜 황산폴리아크릴라미드 젤 전기포진(SDS-PAGE)을 수행한다. 겔은 700 nm에서 형광 이미저를 사용하여, 키트 프로토콜에 따른 단백질 염색 키트를 사용하여 젤내단백질을 염색한다(재료의 표,CBB 단백질 염색 참조).
2. 흉막 보급 모델의 생성
- 루시파라아제를 발현하는 표적 세포를 준비하고 1.0 × 106개의 표적 세포를 인산염 완충식염수(PBS)의 100μL에서 일시 중단합니다.
참고: 폐암 및 MPM과 같은 내트라토라시암세포는 표적세포로서 적합하다. 루시파아제 발현 세포는 루시파라제 유전자 이식을 통해 제조되었고, 루시파아제의 높은 발현은 > 10개의 세포 구절 후에 확인되었다. 세포는 10% 태아 소 혈청과 페니실린 (100 IU/mL) 및 연쇄상 구균 (100 mg/mL)으로 보충된 매체에서 배양되었다. 세포의 수는 종양 증가율 및 치료 시간 과정에 따라 조정되었다 (10 × 5-6.0 × 106 세포 / 체중). - 8-12주 된 암컷 호모자고테 아티믹 누드 마우스를 준비하여 19-21 g의 체중이 좋습니다.
- 이소플루란과 시술 중 마우스 마취 (소개: 4-5%, 유지 보수 2-3%); 꼬리를 핀셋으로 눌러 반응이 없는지 확인합니다.
- 폴리스티렌 폼으로 스토퍼를 만들고 폐 손상을 방지하기 위해 팁이 5mm에 유지되도록 스토퍼를 30 G 바늘에 부착하십시오. 바늘 끝을 깨끗한 집게로 구부리거나 70% EtOH로 세척된 단단한 물체에 대해 눌러 기압호르몬(그림1)을피하십시오.
주의: 자신을 관통하지 않도록 주의하십시오. 바늘을 구부리기 위해 집게를 사용합니다. 바늘에 부착 할 때 스토퍼를 보유하지 마십시오. 세포를 주사기에 채우기 전에 스토퍼를 붙이는 것이 더 안전합니다. - 표적 셀로 주사기(1mL)를 채우고 스토퍼로 30G 바늘을 부착한다.
- 시술 전에 70% EtOH로 동물의 가슴을 소독하십시오.
- 늑간 공간을 통해 마우스 의 가슴에 바늘을 관통. 그 당시 갈비뼈에 부딪히는 동안 저항으로 인해 바늘 끝이 위아래로 움직였다. 늑간 공간을 통과한 후, 마우스에 대한 주사기를 누르고 표적 셀의 100 μL을 주입한다(도2).
참고: 바늘이 가슴 구멍에 제대로 들어갈 때 마우스는 깊이 숨을 들이습니다. 바늘 끝의 구부러짐으로, 폐렴과 폐에 세포의 부적당한 주입을 피할 수 있었습니다.
참고: 오른쪽 가슴 벽 펑크심장 벽 펑크의 위험을 피하기 위해 권장 됩니다. - 마우스를 2-3번 굴려 흉부 구멍 전체에 세포를 퍼뜨리습니다.
- 마우스를 깨끗하고 따뜻한 케이지에 넣고 외래가 될 때까지 모니터링합니다. 절차 후, 마우스는 마취에서 일어나 정상적으로 행동합니다.
3. 생물 발광의 측정
참고: 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어는 재료 표에나열됩니다.
- 흉막 보급 모델의 생성을 확인하기 위해 흉부 구멍에 세포를 주입 한 후 매일 생체 발광 이미지를 평가하십시오.
- 마우스(2.3단계)를 마취하고 D-루시페린(15 mg/mL, 200 μL)으로 인트라피언으로 주입한다.
- 마우스가 이미징 전후에 정상적으로 호흡하고 있는지 확인합니다. 마취 중 저체온증을 방지하기 위해 필요한 경우 히터를 사용합니다.
- 주입 후 10분 후, 생체 발광 이미징(BLI) 측정 장비에 마우스를 설정합니다. 이미지 수집을 위해 소프트웨어의 인수 제어판을 엽니다. 발광, 사진및 오버레이 (그림 3)를선택합니다.
- 노출 시간을 자동으로설정합니다. 비닝을 작게 설정합니다.
- f/stop을 발광용 1개, 사진의 경우 8로 설정합니다. f/stop은 충전된 결합 장치 검출기에 의해 수신된 빛의 양을 제어합니다.
- 뷰 필드를 C로설정합니다.
- 마우스 샘플이 이미징에 대한 준비가 되면 이미징 수집을 클릭합니다. 충분한 루시파아제 활성을 가진 마우스는 추가 연구를 위해 선택되었다.
참고: 적합한 흉막 보급 모델은 복부 측에서 볼 때 가슴의 확산 부위에 강한 발광을 보여줍니다. BLI 이미지가 흉부에서 확산되지 않고 주사 부위에서만 종양을 피하로 이식할 수 있다. - 이미지를 표시한 후 표시 형식을 래디언스로 설정합니다. 도구 팔레트 패널을 엽니다(그림4A).
- ROI 도구를 선택합니다. 원(Circle)을 사용하여 이미지의 생물 발광 영역범위를 조정하는 것이 좋습니다.
- 표면 생체 발광 강도를 측정하려면 측정 ROI를 클릭합니다(그림4B).
- ROI 측정 패널의 왼쪽 모서리에 측정 구성을 사용하여 필요한 값/정보를 선택합니다. 이 데이터 테이블을 .csv파일(그림 4C)으로내보냅니다.
- 총 플럭스(p/s)의 값을 .csv 파일의 생체 발광 강도 정량화로 사용합니다.
4. 확산 발광 화상 진찰 단층 촬영 (DLIT)
참고: 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어는 재료 표에나열됩니다.
- X선 무장 버튼을 켭니다.
- 마우스(2.3단계)를 마취한 다음 D-루시페린(15 mg/mL, 200 μL)을 마우스에 내회음주사한다. 3.2에서 3.7까지 DLIT를 연속 촬영하려면 이 단계를 건너뜁니다.
- 주입 후 10 분, BLI 장비에 마우스를 설정합니다.
- 소프트웨어의 인수 제어판을 엽니다. 발광, 사진, CT, 스탠다드 원 마우스및 오버레이를선택합니다. 다른 설정은 3.4-3.6(그림 5A)과동일했습니다.
- 수집 제어판에서 이미징 마법사를 선택합니다.
- 생물 발광을 선택한 다음 DLIT (그림 5B)를선택합니다.
- 측정할 파장으로 반딧불을 선택합니다(그림 5C).
- 이미징 피사체를 마우스로설정, 노출 매개 변수를 자동 설정으로설정, 시야필드는 C-13.4cm,피사체 높이를 1.5cm(그림 5D)로설정합니다.
- 활력을 불어넣으면 X선을 밀어붙입니다. 획득.
- CT 순차적 이미지 데이터를 엽니다.
- 도구 팔레트에서 표면 지형을 엽니다. 표시(그림 6A)를선택합니다.
- 보라색 디스플레이가 바디표면(도 6B)만표시할 때 임계값을 조정합니다. 그런 다음 피사체 누드 마우스를 선택하고 생성 표면을 클릭합니다. 마우스의 윤곽선이 정확하게 그려졌는지 확인하십시오(그림6C).
- 도구 팔레트를엽니 다, DLIT 3D 재건 속성 탭. 마우스 조직으로 조직 속성을 선택하고 반딧불로 소스 스펙트럼(그림 6D). 다음으로 분석 탭을 열고 선택한 각 파장 데이터에 대한 데이터를 확인합니다. 마지막으로 재구성 버튼(그림6E)을클릭합니다.
- 구성된 DLIT 이미지에서 흉부 캐비티에 BLI의 존재를 확인합니다.
5. 생체 내 흉막 보급 모델에 대한 NIR-PIT
- 파워 미터로 690 nm 파장 (NIR) 레이저의 광 용량을 측정하고 출력을 100 mW / cm2로조정합니다.
참고 : 레이저 빛은 정확한 코일 크기와 일치합니다. 따라서, 빛 에너지는 50cm 이내의 거리에 관계없이 거의 변하지 않습니다. 화상과 같은 부작용이 많은 경우 40mW/cm2범위 내에서 출력을 줄입니다. - 70% EtOH로 꼬리를 청소하고 NIR 조사 전에 24h의 꼬리 정맥을 통해 APC(100 μg)를 정맥 주사합니다. 출혈을 제어하기 위해 주사 부위에 압력을 가하십시오.
참고: APC의 부피를 주입시 50-200 μL로 조정합니다. - 마우스 (단계 2.3)를 마취시키고 등에 놓습니다. 비대상 부위에 대한 NIR 조사를 피하기 위해 알루미늄 호일로 다른 부위를 보호하십시오(도7A). 100 J/cm2의레이저로 NIR 빛으로 조사; 종양이 배로 다시 보급되는 경우, NIR 라이트 조사 용량은 여러 방향으로 나눌 수있다(도 7B).
참고: 시험관 내 결과 및 화상과 같은 부작용에 따라 30-150 J/cm2에서 복용량을 조정합니다. - NIR 조사가 완료되고 마우스가 깨어있을 때 케이지로 돌아갑니다.
- BLI를 관찰하고 시간이 지남에 따라 ROI를 측정합니다(매일) (3.2-3.12 참조).
- 전 생체 내 이미징의 경우, NiR 조사 직전에 APC 주입 후 24시간 이산화탄소로 마우스를 안락사시킵니다.
- 마우스 가슴 안쪽을 관찰하려면 흉부를 제거하고 갈비뼈와 흉골을 자른다. APC 투여 없이 제어와 함께 형광 영상(700nm)을 캡처합니다. 이어서, 노출된 흉부 위에 D-루시퍼린(150 μg/mL)을 적용하고, BLI를 촬영하였다(참조 3.2-3.7 참조).
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Representative Results
안티 포도플라닌 항체 NZ-1은 NZ-1-IR700을 생성하기 위해 IR700과 결합되었다. 우리는 SDS-PAGE(도 8)에NZ-1 및 IR700의 바인딩을 확인했다. 루시파아제 발현 H2373(H2373-luc)은 악성 중피종 세포(H2373)를 루시파아제유전자(10)로이식하여 제조하였다.
우리는 8-12 주 된 여성 homozygote athymic 누드 마우스를 마취하고 흉부 구멍에 105 H2373 luc 세포를 × 주입했습니다. 마우스내 종양 세포를 주입하는 날은 1일로 표시되었다.
4일째에 BLI 및 DLIT는 D-루시페린(15 mg/mL, 200 μL)을 주사한 후, 흉부 캐비티에서 충분한 루시파아제 활성을 가진 마우스를 추가 연구를 위해 선택하였다(그림9). NZ-1-IR700(100 μL)의 백 마이크로그램은 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 대조군은 PBS(100 μL)로 주입되었다.
5일째, 2마리의 마우스는 전생체용이산화탄소 질식을 사용하여 희생하였다. NZ-1-IR700 주입 마우스는 흉부 종양에서 높은 IR700 형광 및 루시파아제 활동을 모두 보여주었으며, 이는 정맥 주입 NZ-1-IR700이 보급된 흉막 종양부위(도 10)에도달했음을 나타낸다.
흉막 전파 마우스 모델에서 NIR-PIT의 효과를 평가하기 위해, NIR 광은 5일째에 40mW/cm2에서 2방향(총 30 J/cm2)에서15 J/cm2로 적용되었다(NIR 라이트는 외부로 조사됨), 그 뒤를 이어 연속 BLI가 뒤따랐다. 대조군은 NIR 빛으로 조사되지 않았다.
NIR-PIT을 가진 마우스의 처리 후에, 처리된 단은 감소된 luciferase 활동을 보여주었습니다. 그러나, 대조군내 상대광단위는 점진적인 증가(*p < 0.05 대 대조군, t-test)(도11)를나타냈다.
그림 1: 세포 이식을위한 쉬운 수제 장치. 폴리스티렌 폼으로 만든 스토퍼를 30G 바늘에 부착하여 팁이 5mm로 유지되도록 합니다. 바늘의 끝은 기흉을 피하기 위해 구부러져야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 흉부 구멍에 표적 세포의 주입. 마우스를 옆으로 돌리고 바늘을 마우스로 관통하여 폐쪽으로 향합니다. 스토퍼와 바늘 끝이 구부러져 있기 때문에 바늘은 폐에 달라붙지 않고 흉부 구멍에 들어갑니다. 마우스에 바늘을 누르는 동안 대상 세포를 주입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인수 제어판. 발광, 사진및 오버레이를선택합니다. 노출 시간을 자동으로설정하고, 작은것으로 비닝, 발광용 은 1으로 f / 정지, 사진에 대한 8, C로보기의 필드. 마우스 샘플이 이미징에 대한 준비가 되면 이미징 수집을 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 측정 (BLI). (A)도구 팔레트 패널. ROI 도구를 선택합니다. 원에서는 이미지의 생물 발광 영역범위를 조정하는 것이 좋습니다. (B)BLI 정량화. 각 이미지에서 ROI를 선택한 후 측정 ROI를 클릭하여 분석합니다. (C)정량화 정보. ROI 측정 패널의 왼쪽 모서리에 측정 구성을 사용하여 필요한 값/정보를 선택합니다. 이 데이터 테이블을 .csv 파일로 내보냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: DLIT 인수. (A)DLIT에 대한 인수 제어판. 발광, 사진, CT, 스탠다드 원 마우스및 오버레이를선택합니다. 다른 설정은 3.4-3.6(그림 3)과동일합니다. (B)이미징 마법사 패널. 생물 발광및 DLIT를 선택합니다. (C)측정 파장을 선택합니다. 파장을 반딧불로 선택합니다. (D)이미징 피사체를 마우스로설정, 노출 매개 변수를 자동 설정으로,시야는 C-13.4 cm,피사체 높이를 1.5 cm로설정합니다. 그런 다음 활력을 불어넣을 때 생성되는 X선을 클릭합니다. 얻다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: DLIT의 재구성. (A)도구 팔레트 패널. 도구 팔레트에서 표면 지형을 엽니다. 표시를선택합니다. (B)마우스 표면 인식을 조정. 보라색 디스플레이에 바디 표면만 표시할 때 임계값을 조정합니다. 피사체 누드 마우스를선택한 다음 표면 생성을 클릭합니다. 마우스의 윤곽선이 정확하게 그려져 있는지 확인합니다. (C)도구 팔레트. DLIT 3D 재구성 속성 탭을 열고, 마우스 조직및 소스 스펙트럼으로 조직 속성을 반딧불로 선택합니다. (D) 분석 탭을 열고 각 파장 데이터에 대한 데이터를 선택합니다. (E)재구성 버튼을 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: NIR 조사. (A)배에 대한 NIR 조사를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 배를 보호합니다. (B)BLI가 강한 레이저를 사용하여 NIR 광을 조사; 경우에 따라 NIR 레이저는 여러 방향으로 나뉩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: SDS 페이지. SDS-PAGE 젤에 컨쥬게이드 NZ-1-IR700의 성공적인 확인(왼쪽, 콜로이드 블루 스테인링; 오른쪽, 700 nm 채널의 형광). 희석 된 NZ-1은 제어 역할을했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: DLIT. 흉부 구멍에서 루시파아제 발현 종양 세포의 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: Ex vivo 이미징. BLI를 가진 NZ-1-IR700 주입 후 흉막 전파 MPM 모델 24 h의 특성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 11: 흉막 전파 모델에 NIR-PIT의 항종양 효과. (A)포도플라닌 표적 NIR-PIT 식이요법은 선에 도시된다. H2373-luc 종양을 가진 흉막 보급 모형에 NZ-1-IR700를 가진 Podoplanin 표적으로 한 NIR-PIT. 흉막 전파 모델의 BLI가 도시되어 있다. (B)BLI로 측정된 루시파아제 활동은 NIR-PIT 그룹에서 증가하지 는 않았지만, 대조군은 종양 성장과 함께 점진적인 증가를 보였다. (n ≥ 3 두 그룹에서, t-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서는, MPM의 흉막 보급 모델에 대한 NIR-PIT의 치료 효과를 측정하는 방법을 시연하였다. 매우 선택적 세포 살인은 NIR-PIT로 수행되었다; 따라서, 정상 조직은 거의손상되지 않았다 23,24,25. 이러한 유형의 선택적 세포 살인으로 NIR-PIT은 보급 된 모델9,26에서안전하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 일부 단계에서는 대체 방법이 가능합니다. 흉막보급모델(27,28,29,30)에대해 다양한 방법이 보고되었다. 생쥐에게 부담이 가장 적은 간단한 절차이기 때문에 사출 모델을 선택했습니다. 우리는 살아있는 마우스로 정량적으로 평가할 수 있기 때문에 NIR-PIT의 치료 효과를 측정하기 위해 BLI를 사용했습니다. 예를 들어, 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영(PET/CT)(27)은 흉막 보급 모델의 종양 부피를 평가하는 대안이 될 수 있다. 다른 치열 교정 모델에서 BLI를 가진 NIR-PIT이 보고되었습니다. NIR-PIT는 복부 보급 모델, 폐 다중 전이성 종양 모델 및뇌종양(12,26,31,32,33,34, 35,35,36)에사용될 수 있다. 작은 전이성 종양 foci도 BLI로 관찰될 수 있으며, NIR-PIT은11,12를수행할 수 있다.
우리는 예비 실험에 근거를 둔 프로토콜의 몇몇 부분을 기술했습니다. 첫째, APC 투여에서 NIR 조사에 이르는 시간입니다. 약물 역학은 피하 종양 모델을 사용하여 사전에 평가되었다. MAb를 이용한 꼬리 정맥을 통한 개입 후 종양 24시간 에서 APC 피크; NIR 조사는 APC 투여 후 24h를 수행할 수있으며,10,11,12. 둘째, NIR-PIT에서 종양 세포를 죽이는 데 필요한 NIR 광 용량은 항체 및 표적 세포주에 따라 다르며, 이는 체외 결과를 사용하여 예측된다.
이 연구는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 종양은 흉부 구멍에 널리 분포되었고, NIR 조사 에너지는 정확하게 측정할 수 없었다. NIR 흥분광(690nm에서 피크)의 파장은조직(37)에적어도 2-3인치의 침투를 허용한다. 따라서, 마우스의 경우, NIR 광은 외부에서도 흉부 구멍에 도달한다. 현재 NIR 레이저 장치는 마우스 흉막 보급 모델9,10,11,12에사용된다. 그러나, 실제 임상사용에서는, 흉부배수관(34)을 통해 전체 내트라토라시캐비티를 조사하기 위해 정밀광섬유를 사용할 계획이다. 둘째, NIR-조사 용량은 종양 세포에 발현된 항원에 대한 mAb의 특이성에 따라 제한됩니다. APC의 비특이적 결합은 예기치 않은 장기 손상을 일으킬 수 있습니다.
결론적으로, MPM의 흉막 보급 모델에서 BLI를 이용한 NIR-PIT의 치료 효과를 평가하는 방법을 제시했습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
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