Summary
Фотоиммунотерапия в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR-PIT) является новой терапевтической стратегией рака, которая использует конъюгат антитело-фотоабсорбер (IR700Dye) и свет NIR для уничтожения раковых клеток. Здесь мы представляем метод оценки противоопухолевого эффекта NIR-PIT в мышиной модели плеврального диссеминированного рака легких и злокачественной мезотелиомы плевры с использованием биолюминесцентной визуализации.
Abstract
Эффективность фотоиммунотерапии можно оценить более точно с помощью ортотопической мышиной модели, чем с подкожной. Модель плевральной диссеминации может быть использована для оценки методов лечения внутриторакальных заболеваний, таких как рак легких или злокачественная мезотелиома плевры.
Фотоиммунотерапия ближнего инфракрасного диапазона (NIR-PIT) - это недавно разработанная стратегия лечения рака, которая сочетает в себе специфичность антител, нацеленных на опухоль, с токсичностью, вызванной фотоаборбером (IR700Dye) после воздействия света NIR. Сообщалось об эффективности NIR-PIT с использованием различных антител; однако лишь несколько отчетов показали терапевтический эффект этой стратегии в ортотопической модели. В настоящем исследовании мы демонстрируем пример оценки эффективности модели плеврального диссеминированного рака легких, которую лечили с использованием NIR-PIT.
Introduction
Рак остается одной из ведущих причин смертности, несмотря на десятилетия исследований. Одна из причин заключается в том, что лучевая терапия и химиотерапия являются высокоинвазивными методами, которые могут ограничить их терапевтические преимущества. Клеточная или молекулярная таргетная терапия, которая является менее инвазивными методами, получает повышенное внимание. Фотоиммунотерапия – это метод лечения, который синергетически усиливает терапевтический эффект, сочетая иммунотерапию и фототерапию. Иммунотерапия повышает иммунитет опухоли за счет повышения иммуногенности микроокружения опухоли и снижения иммунорегуляторного подавления, в результате чего опухоли деструктируется в организме. Фототерапия уничтожает первичные опухоли комбинацией фотосенсибилизаторов и световых лучей, а опухолеспецифические антигены, высвобождаемые из опухолевых клеток, повышают опухолевый иммунитет. Опухоли можно избирательно лечить с помощью фотосенсибилизаторов, поскольку они специфичны и селективны для клеток-мишеней. Модальность фототерапии включает фотодинамическую терапию (ФДТ), фототермическую терапию (ПТТ) и терапию наосновефотохимии1.
Ближний инфракрасный фотоиммунотерапия (NIR-PIT) является недавно разработанным методом противоопухолевной фототерапии, который сочетает в себе фотохимическую терапию и иммунотерапию1,2. NIR-PIT представляет собой молекулярно-таргетную терапию, которая нацелена на конкретные молекулы клеточной поверхности путем конъюгации близкого инфракрасного кремниевого фталоцианинового красителя IRdye 700DX (IR700) с моноклональным антителом (mAb). Клеточная мембрана клетки-мишени разрушается при облучении NIR-светом (690 нм)3.
Концепция использования таргетной светотерапии путем комбинирования обычных фотосенсибилизаторов и антител или таргетной ФДТ насчитывает более трех десятилетий4,5. Предыдущие исследования пытались нацелиться на обычные агенты ФДТ, конъюгируя их с антителами. Однако был ограниченный успех, потому что эти конъюгаты были захвачены в печени, из-за гидрофобности фотосенсибилизаторов6,7. Более того, механизм NIR-PIT полностью отличается от механизма обычного PDT. Обычные фотосенсибилизаторы создают окислительный стресс, который возникает в результате преобразования энергии, которое поглощает световую энергию, смещается в возбужденное состояние, переходит в основное состояние и вызывает апоптоз. Однако NIR-PIT вызывает быстрый некроз, непосредственно разрушая клеточную мембрану путем агрегации фотосенсибилизаторов на мембране посредством фотохимической реакции8. NIR-PIT во многом превосходит обычный целевой ФДТ. Обычные фотосенсибилизаторы имеют низкие коэффициенты вымирания, требуя прикрепления большого количества фотосенсибилизаторов к одной молекуле антитела, потенциально снижая сродство связывания. Большинство обычных фотосенсибилизаторов являются гидрофобными, что затрудняет связывание фотосенсибилизаторов с антителами без ущерба для их иммунореактивности или накопления мишеней in vivo. Обычные фотосенсибилизаторы обычно поглощают свет в видимом диапазоне, уменьшая проникновение в ткани.
Сообщалось о нескольких исследованиях NIR-PIT, нацеленных на внутриторакальныеопухоли,такие как рак легких и злокачественные клетки мезотелиомы плевры (MPM),9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Тем не менее, только в нескольких отчетах описана эффективность NIR-PIT в моделях9,10,11,12с диссеминированной плеврой или раком легких. Модели ксенотрансплантатов подкожной опухоли считаются стандартными моделями опухолей и в настоящее время широко используются для оценки противоопухолевых эффектов новых методовлечения18. Однако микроокружение подкожной опухоли не является разрешительным для развития соответствующей структуры ткани или состояния, которое должным образом резюмирует истинный злокачественный фенотип19,20,21,22. В идеале должны быть установлены модели ортотопических заболеваний для более точной оценки противоопухолевого эффекта.
Здесь мы демонстрируем метод оценки эффективности в мышиной модели плеврального диссеминированного рака легких, который лечили с помощью NIR-PIT. Модель плевральной диссеминационной мыши генерируется путем введения опухолевых клеток в грудную полость и подтверждается с помощью люминесценции люциферазы. Мышь лечили внутривенной инъекцией mAb, конъюгированной с IR700 и NIR облучением грудной клетки. Терапевтический эффект оценивали с помощью люминесценции люциферазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты in vivo проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию ресурсов лабораторных животных Комитета по уходу и использованию животных Университета Нагои (одобрение No 2017-29438, No 2018-30096, No 2019-31234, No 2020-20104). Шестинедельные гомозиготные атимические обнаженные мыши были приобретены и содержались в Центре животных Нагойского университета. При выполнении процедуры на мышах их анестезировали изофлураном (введение: 4-5%, поддержание 2-3%); лапу прессингуют пинцетом для подтверждения глубины анестезии.
1. Сопряжение IR700 с mAb
- Инкубат mAb (1 мг, 6,8 нмоль) с эфиром IR700 NHS (66,8 мг, 34,2 нмоль, 5 ммоль/л в ДМСО) в 0,1 моль/лNa2HPO4 (рН 8,6) при 15-25 °C в течение 1 ч.
- Очистите смесь с помощью колонки (например, Sephadex). Подготовьте и вымойте колонну с помощью PBS. Затем нанесите смесь на столб и соберите каплю, которая содержит очищенное IR700-конъюгированное антитело. Это IR700-конъюгированное антитело называется конъюгатом фотосенсибилизатора антител (APC).
- Измерьте концентрацию белка и IR700 в APC.
- Подготовьте калибровочные кривые для белка и IR700 с помощью спектрофотометра.
- Смешайте стандартные концентрации альбумина с набором для анализа белка в соответствии с протоколом набора (см. Таблицу материалов,окрашивание белка Coomassie Brilliant Blue (CBB)). Измерьте поглощение альбумина на длине волны 595 нм и постройте калибровочную кривую (формулу линейного приближения) для белка, используя следующее уравнение: y = ax + b (x: концентрация, y: поглощение).
- Получите калибровочные кривые для IR700 с поглощением при 690 нм с помощью той же процедуры. Стандартная концентрация IR700 рекомендуется на уровне 0,1-5 мкМ (0,1954-9,77 мкг/мл).
- Измерьте концентрацию белка и IR700 в БТР с помощью калибровочной кривой [x = (y-b)/a (x: концентрация, y: абсорбция)].
- Определение количества IR700 красителей, связанных на мАб, с результатами молярной концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить оптимальное число сопряжения молекул IR700 на молекулу mAb. Как правило, приблизительно три молекулы IR700, связанные с одной молекулой mAb, будут эффективны как in vitro, так и in vivo. Многие IR700, связанные с антителом (например, шесть), облегчают попадание в печень во время экспериментов in vivo. Отношение антител, связанных с IR700, находилось в диапазоне 1:2-1:4. При необходимости доля IR700 была снижена.
- Выполняют электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля (SDS-PAGE) в качестве подтверждения образования БТР. Визуйте гель при 700 нм с помощью флуоресцентного томообразователь и окрасьте белок в геле с помощью набора для окрашивания белка в соответствии с протоколом набора (см. Таблицу материалов,окрашивание белка CBB).
2. Генерация модели плевральной диссеминации
- Готовят люцифераз-экспрессивные клетки-мишени и суспендируют 1,0 ×10 6 клеток-мишеней в 100 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутритораковые раковые клетки, такие как рак легких и MPM, подходят в качестве клеток-мишеней. Люцифераза-экспрессивные клетки были получены путем трансфекции гена люциферазы, и высокая экспрессия люциферазы была подтверждена после > 10 клеточных проходов. Клетки культивировали в среде, дополненной 10% фетальной бычим сывороткой и пенициллином (100 МЕ/мл) и стрептомицином (100 мг/мл). Количество клеток корректировали в соответствии со скоростью роста опухоли и временем курса лечения (1,0. × 105-6,0 × 106 клеток/массы тела). - Готовят 8-12-недельную самку гомозиготных атипичных обнаженных мышей, с предпочтительной массой тела 19-21 г.
- Обезболивать мышей во время процедуры изофлураном (введение: 4-5%, поддержание 2-3%); прижмите хвост пинцестом, чтобы подтвердить, что реакции нет.
- Сделайте пробку из пенополистирола и прикрепите пробку к игле 30 Г так, чтобы наконечник оставался на 5 мм, чтобы предотвратить повреждение легких. Согните наконечник иглы чистыми щипцами или прижавите его к твердому предмету, очищенным 70% EtOH, чтобы избежать пневмоторакса(рисунок 1).
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не пронзить себя. Используйте щипцы, чтобы согнуть иглу. Не держите пробку при прикреплении ее к игле. Безопаснее вставить пробку перед заполнением клеток в шприц. - Заполните шприц (1 мл) клетками-мишенью и прикрепите иглу 30G с пробкой.
- Продезинфицируйте грудную клетку животного 70% EtOH перед процедурой.
- Проткните иглу в грудную клетку мыши через межребра. Из-за сопротивления при ударе о ребра в это время кончик иглы двигался вверх и вниз. После прохождения через межреберное пространство прижмите шприц к мыши и введите 100 мкл клеток-мишеней(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь глубоко дышит, когда игла правильно входит в грудную полость. При изгибе кончика иглы можно было бы избежать пневмоторакса и неправильного введения клеток в легкое.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пункция правой грудной стенки рекомендуется, чтобы избежать риска прокола сердечной стенки. - Перекатывайте мышь 2-3 раза, чтобы распределить клетки по всей грудной полости.
- Верните мышь в чистую и теплую клетку и следите за ней до амбулаторного состояния. После процедуры мышь проснется от наркоза и будет вести себя нормально.
3. Измерение биолюминесценции
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое для сбора данных, указано в Таблице материалов.
- Чтобы подтвердить генерацию модели плевральной диссеминации, оценивайте изображения биолюминесценции каждый день после введения клеток в грудную полость.
- Обезболивать мышей (этап 2.3) и вводить внутрибрюшинно D-люциферин (15 мг/мл, 200 мкл).
- Убедитесь, что мышь дышит нормально до и после визуализации. Используйте обогреватель, если это необходимо для предотвращения переохлаждения во время анестезии.
- Через десять минут после инъекции установите мышь в измерительное оборудование для биолюминесцентной визуализации (BLI). Для получения изображений откройте панель управления получением программного обеспечения. Выберите Люминесцентный, Фотографическийи Наложенный (рисунок 3).
- Установите время экспозиции как Auto. Установите для биннинга значение маленького.
- Установите f/stop как 1 для люминесцентных и 8 для фотографии; f/stop контролирует количество света, принимаемого детектором устройства с заряженной связью.
- Задайте для поля зрения значение C.
- Когда образец мыши будет готов к обработке изображений, нажмите кнопку Получить для получения изображений. Мыши с достаточной активностью люциферазы были отобраны для дальнейших исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящая модель плевральной диссеминированности показывает сильную люминесценцию на диффузном участке в грудной клетке при взгляде с вентральной стороны. Если изображения BLI диффузируются не в грудной клетке, а только в месте инъекции, опухоль может быть пересажена подкожно. - После отображения изображения установите формат отображения в Radiance. Откройте панель «Инструментальная палитра» (рисунок 4A).
- Выберите Инструменты окупаемости инвестиций. Мы рекомендуем использовать Circle для диапазона биолюминесцентной области на изображениях.
- Нажмите Измерить рентабельность инвестиций, чтобы измерить интенсивность биолюминесцентной поверхности(рисунок 4B).
- Используйте Настроить измерение в левом углу панели измерения ROI, чтобы выбрать необходимые значения и информацию. Экспортируйте эту таблицу данных в виде файла .csv(рисунок 4C).
- Используйте значения total Flux (p/s) в качестве количественной оценки интенсивности биолюминесцентных веществ в файле .csv.
4. Диффузная люминесцентная томография (DLIT)
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое для сбора данных, указано в Таблице материалов.
- Включите кнопку X-ray Armed.
- Обезболивают мышей (шаг 2.3), а затем вводят D-люциферин (15 мг/мл, 200 мкл) внутрибрюшинно мышам. Чтобы снимать DLIT непрерывно от 3,2 до 3,7, пропустите этот шаг.
- Через десять минут после инъекции установите мышь в оборудование BLI.
- Откройте панель управления приобретением программного обеспечения. Выберите Люминесцентный, Фотографический, Компьютерныйтомограф, Стандартная мышьи Наложение. Остальные настройки были такими же, как и в 3.4-3.6(рисунок 5A).
- Выберите мастер создания образов на панели управления получением.
- Выберите Биолюминесценция, а затем DLIT (рисунок 5B).
- Выберите Светлячок в качестве длины волны для измерения(рисунок 5C).
- Установите объект изображения как мышь,параметры экспозиции как автоматические настройки,поле зрения как C-13,4 сми высоту объекта как 1,5 см (рисунок 5D).
- Толчковые рентгеновские лучи будут производиться при возбуждении. Приобрести.
- Откройте данные последовательного изображения КТ.
- Откройте топографию поверхности на инструментальной палитре. Выберите Показать (рисунок 6A).
- Отрегулируйте пороговое значение, так как фиолетовый дисплей показывает только поверхность тела(рисунок 6B). Затем выберите объект обнаженной мыши и щелкните Создать поверхность. Убедитесь, что контур мыши нарисован точно(рисунок 6C).
- Откройте инструментальный палитру,вкладку Свойства реконструкции DLIT 3D. Выберите Свойства ткани как Ткань мыши и Исходный спектр как Светлячок (рисунок 6D). Затем откройте вкладку Анализ и подтвердите данные для каждой выбранной длины волны. Наконец, нажмите кнопку Reconstruct (Восстановить) (рисунок 6E).
- Подтвердите наличие BLI в грудной полости на настроенном DLIT изображении.
5. NIR-PIT для модели плевральной диссеминиции in vivo
- Измерьте дозу света лазера с длиной волны 690 нм (NIR) с помощью измерителя мощности и отрегулируйте выходную мощность до 100мВт/см2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерный свет является когерентным с точным размером катушки; таким образом, световая энергия практически не изменяется независимо от расстояния в пределах 50 см. Если есть много побочных явлений, таких как ожоги, уменьшитевыход в пределах 40 мВт/см2. - Очистите хвост с помощью 70% EtOH и внутривенно введите APC (100 мкг) через хвостовую вену за 24 ч до облучения NIR. Надавить на место инъекции, чтобы контролировать кровотечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем БТР до 50-200 мкл для инъекций. - Обезбольте мышей (шаг 2.3) и уложите их на спину. Чтобы избежать niR-облучения на нецелевой участок, защитите другие участки алюминиевой фольгой(рисунок 7А). Облучение NIR-светом лазером 100Дж/см2; если опухоль распространяется обратно в живот, дозу облучения NIR-светом можно разделить на несколько направлений(рисунок 7B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировать дозу на уровне 30-150Дж/см2 в зависимости от результатов in vitro и нежелательных явлений, таких как ожоги. - Когда облучение NIR будет завершено и мышь проснется, верните ее в клетку.
- Наблюдайте за BLI и измеряйте ROI с течением времени (каждый день) (см. 3.2-3.12).
- Для визуализации ex vivo усыплите мышей углекислым газом через 24 ч после инъекции APC, непосредственно перед облучением NIR.
- Чтобы понаблюдать за внутренней частью грудной клетки мыши, удалите грудную клетку и отрежьте ребра и грудину. Захват флуоресцентного изображения (700 нм) вместе с элементом управления без администрирования APC. Затем нанесите D-люциферин (150 мкг/мл) на открытую грудную клетку, и BLI был взят (см. 3,2-3,7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анти-подопланин антитело NZ-1 было конъюгировано с IR700 для генерации NZ-1-IR700. Мы подтвердили привязку NZ-1 и IR700 на SDS-PAGE(рисунок 8). Люцифераза-экспрессировка H2373 (H2373-luc) была получена путем трансфектирования клеток злокачественной мезотелиомы (H2373) геном люциферазы10.
Мы анестезировали 8-12-недельных самок гомозиготных атипичных обнаженных мышей и вводили 1 × 105 клеток H2373-luc в грудную полость. День инъекции опухолевых клеток мышам был указан как день 1.
На 4-й день BLI и DLIT проводили после того, как D-люциферин (15 мг/мл, 200 мкл) вводили внутрибрюшинно, и мышей с достаточной активностью люциферазы в грудной полости отбирали для дальнейших исследований(Рисунок 9). Сто микрограммов NZ-1-IR700 (100 мкл) вводили внутривенно через хвостовую вену. Контрольной группе вводили PBS (100 мкл).
На 5-й день две мыши были принесены в жертву с использованием удушья углекислым газом для ex vivo. Введенная мышь NZ-1-IR700 показала как высокую флуоресценцию IR700, так и активность люциферазы в опухолях грудной клетки, что указывает на то, что внутривенно введенный NZ-1-IR700 достиг диссеминированных участков плевральной опухоли(рисунок 10).
Для оценки влияния NIR-PIT в модели плевральной рассеянной мыши свет NIR применяли при 15 Дж/см2 с двух направлений (всего 30 Дж/см2) при 40 мВт/см2 чрескожно на 5-й день (свет NIR облучался снаружи), за которым следовал последовательный BLI. Контрольная группа не облучалась светом NIR.
После лечения мышей NIR-PIT в обработанной группе наблюдалось снижение активности люциферазы. Однако относительная единица освещенности в контрольной группе показала постепенное увеличение (*p < 0,05 по сравнению с контрольной, t-тест)(рисунок 11).
Рисунок 1:Простое ручное устройство для трансплантации клеток. Прикрепите пробку, изготовленную из пенополистирола, к игле 30G так, чтобы наконечник оставался на уровне 5 мм. Кончик иглы должен быть согнут, чтобы избежать пневмоторакса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Инъекция клеток-мишеней в грудную полость. Поверните мышь вбок и проткните иглу в мышь по направлению к легкому. Поскольку пробка и кончик иглы изогнуты, игла попадает в грудную полость, не прилипая к легким. Вводите клетки-мишени, прижимая иглу к мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Панель управления сбором. Выберите Люминесцентный, Фотографияи Наложение. Установите время экспозиции как авто,биннинг как маленький,f / стоп как 1 для люминесцентных и 8 для фотографии, а поле зрения как C. Когда образец мыши будет готов к обработке изображений, нажмите кнопку Получить для получения изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Измерение (BLI). (A) Панель инструментальной палитры. Выберите Инструменты окупаемости инвестиций. Мы рекомендуем Circle для диапазона биолюминесцентной области на изображениях. (B)Количественная оценка BLI. После выбора окупаемоотки в каждом изображении щелкните Измерить рентабельность инвестиций для анализа. (C)Количественная информация. Используйте настроить измерение в левом углу панели измерений ROI, чтобы выбрать необходимые значения и информацию. Экспортируйте эту таблицу данных в виде файла .csv. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Приобретение DLIT. (A) Панель управления приобретением для DLIT. Выберите Люминесцентный, Фотографический, КТ, Стандартная-Одна мышьи Наложение. Другие настройки такие же, как 3.4-3.6(рисунок 3). (B) Панель мастера создания образов. Выберите Биолюминесценцияи DLIT. (C) Выберите длину волны измерения. Выберите длину волны светлячков. (D)Установите объект изображения как мышь,параметры экспозиции как автоматические настройки,поле зрения как C-13,4 сми высоту объекта как 1,5 см. Затем Click рентгеновские лучи будут производиться при возбуждении. Приобретать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Реконструкция панели палитры инструментов DLIT. (A). Откройте топографию поверхности на инструментальной палитре. Выберите Показать. (B) Настройка распознавания поверхности мыши. Отрегулируйте пороговое значение, так как фиолетовый дисплей показывает только поверхность корпуса. Выберите объект «Обнаженная мышь»,затем щелкните «Создать поверхность». Убедитесь, что контур мыши нарисован точно. (C) Палитра инструментов. Откройте вкладку Свойства реконструкции DLIT 3D, выберите Свойства ткани как Ткань мыши и Спектр Источника как Светлячок. (D) Откройте вкладку Анализ и выберите данные для каждой длины волны. (E) Нажмите кнопку Реконструировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Облучение NIR. (A)Защитите его живот алюминиевой фольгой для предотвращения облучения NIR в живот. (B)Облучение NIR-света с помощью лазера там, где BLI сильный; в некоторых случаях NIR-лазер делится на несколько направлений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:SDS-PAGE. Успешное подтверждение сопряжения NZ-1-IR700 на геле SDS-PAGE (левое, коллоидное синее окрашивание; правое, флуоресценция на канале 700 нм). Разбавленный NZ-1 служил в качестве контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9:DLIT. Подтверждение наличия люциферазы-экспрессии опухолевых клеток в грудной полости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Визуализация Ex vivo. Характеристика плеврального диссеминированного МПМ модели 24 ч после инъекции NZ-1-IR700 с BLI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11:Противоопухолевое действие NIR-PIT на плевральную диссеминированную модель. (A) Режим ПОДОПЛАНИН-таргетного NIR-PIT показан в строке. Подопланин-таргетный NIR-PIT с NZ-1-IR700 на плевральной диссеминированной модели с опухолями H2373-luc. Показан BLI плевральной диссеминированной модели. Вто время как активность люциферазы, измеренная с помощью BLI, не увеличивалась в группе NIR-PIT, контрольная группа показала постепенное увеличение вместе с ростом опухоли. (n ≥ 3 в обеих группах, t-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данном исследовании мы продемонстрировали метод измерения терапевтического эффекта NIR-PIT на модель плевральной диссеминации МПМ. Высокоселективное уничтожение клеток проводилось с помощью NIR-PIT; таким образом, нормальная ткань практически не повреждалась23,24,25. При этом типе селективного уничтожения клеток было продемонстрировано, что NIR-PIT безопасен в диссеминированных моделях9,26. Тем не менее, альтернативные методы возможны на некоторых этапах. Сообщалось о различных методах для модели плевральной диссеминации27,28,29,30. Мы выбрали модель инъекций, потому что это простая процедура, которая наименее обременительна для мышей. Мы использовали BLI для измерения терапевтического эффекта NIR-PIT, потому что мы можем количественно оценить с живыми мышами. Например, позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография (ПЭТ/КТ)27 может быть альтернативным способом оценки объема опухоли модели плевральной диссеминиции. Сообщалось о NIR-PIT с BLI в других ортотопических моделях; NIR-PIT может быть использован для модели абдоминальной диссеминации, модели множественной метастатической опухоли легких и опухоли головного мозга12,26,31, 32,33,34,35,36. Даже небольшие метастатические опухолевые очаги могут наблюдаться при БЛИ, а NIR-PIT можно проводить11,12.
Мы описали некоторые части протокола на основе предварительных экспериментов. Во-первых, время от введения БТР до облучения NIR. Фармакокинетика оценивалась заранее с использованием модели подкожной опухоли. АПК достигает пика в опухоли через 24 ч после вмешательства через хвостовую вену с использованием mAb; Облучение NIR может быть выполнено через 24 ч после введения БПК9,10,11,12. Во-вторых, доза света NIR, необходимая для уничтожения опухолевых клеток в NIR-PIT, различается в зависимости от антитела и клеточных линий-мишеней, что прогнозируется с использованием результатов in vitro.
Это исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, опухоли были широко распространены в грудной полости, и энергия, облученная NIR, не могла быть точно измерена. Длина волны niR света возбуждения (пик при 690 нм) позволяет проникать не менее 2-3 дюймов вткань 37. Поэтому в случае с мышами свет NIR достигает грудной полости даже внешне. В настоящее время лазерные устройства NIR используются для плеврального распространения мыши моделей9,10,11,12. Однако в реальном клиническом использовании мы намерены использовать точную волоконную оптику для облучения всей внутригрудной полости через грудную дренажную трубку34. Во-вторых, доза NIR-облучения ограничена в зависимости от специфичности mAb к антигенам, экспрессируемым на опухолевых клетках. Неспецифическое связывание БТР может привести к неожиданному повреждению органов.
В заключение представлен метод оценки терапевтического эффекта NIR-PIT с BLI в плевральной модели диссеминации MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Никакой
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L.
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
