Summary
Yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT), kanser hücrelerini yok etmek için antikor-fotoabsorber (IR700Dye) konjuge ve NIR ışığı kullanan gelişmekte olan bir kanser terapötik stratejisidir. Burada, nir-PIT'in antitümör etkisini biyolüminesans görüntüleme kullanarak plevral yaygın akciğer kanseri ve malign plevral mezotelioma fare modelinde değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Fotoimmünoterapinin etkinliği ortotopik fare modeli ile deri altı modeline göre daha doğru değerlendirilebilir. Akciğer kanseri veya malign plevral mezotelioma gibi intratorasik hastalıklar için tedavi yöntemlerinin değerlendirilmesi için plevral yayılım modeli kullanılabilir.
Yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT), nir ışığına maruz kaldıktan sonra tümör hedefleyen antikorların özgüllüğünü bir fotoabsorberin (IR700Dye) neden olduğu toksisite ile birleştiren yakın zamanda geliştirilmiş bir kanser tedavi stratejisidir. NIR-PIT'in etkinliği çeşitli antikorlar kullanılarak bildirilmiştir; ancak, sadece birkaç rapor bu stratejinin terapötik etkisini ortotopik bir modelde göstermiştir. Bu çalışmada NIR-PIT kullanılarak tedavi edilen plevral yayılımlı akciğer kanseri modelinin etkinlik değerlendirmesinin bir örneğini ortaya koyuyoruz.
Introduction
Kanser, onlarca yıllık araştırmalara rağmen ölüm oranının önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam ediyor. Bunun bir nedeni, radyasyon tedavisi ve kemoterapinin terapötik faydalarını sınırlandırabilecek son derece invaziv teknikler olmasıdır. Daha az invaziv teknikler olan hücresel veya moleküler hedefli tedaviler daha fazla ilgi görüyor. Fotoimmünoterapi, immünoterapi ve fototerapiyi birleştirerek sinerjik olarak terapötik etkiyi artıran bir tedavi yöntemidir. İmmünoterapi, tümör mikroçevresinin immünojenikliğini artırarak ve immünregülatör baskılamayı azaltarak tümör bağışıklığını arttırır ve vücuttaki tümörlerin yok olmasına neden olur. Fototerapi, primer tümörleri ışığa duyarlılık ve ışık ışınlarının bir kombinasyonu ile yok eder ve tümör hücrelerinden salınan tümöre özgü antijenler tümör bağışıklığını arttırır. Tümörler hedef hücrelere özgü ve seçici oldukları için ışığa duyarlılıklayıcılar kullanılarak seçici olarak tedavi edilebilirler. Fototerapinin modalitesi fotodinamik tedavi (PDT), fototermal tedavi (PTT) ve fotokimya temelli tedavileri içerir1.
Yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT), fotokimyasal bazlı tedavi ve immünoterapiyi birleştiren yakın zamanda geliştirilen bir antitümör fototerapi yöntemidir1,2. NIR-PIT, kızılötesine yakın silikon fitalasiyanin boyası IRdye 700DX'in (IR700) monoklonal antikora (mAb) konjugasyonu yoluyla belirli hücre yüzey moleküllerini hedefleyen moleküler olarak hedeflenmiş bir tedavidir. Hedef hücrenin hücre zarı NIR ışığı (690 nm)3ile ışınlama üzerine yok edilir.
Geleneksel ışığa duyarlılıklayıcılar ve antikorlar veya hedeflenen PDT birleştirerek hedefli ışık tedavisi kullanma kavramı otuz yıldan daha eskidir4,5. Önceki çalışmalar konvansiyonel PDT ajanlarını antikorlara eşlenerek hedeflemeye çalışmıştır. Bununla birlikte, bu konjugeler ışığa duyarlılıklarının hidrofobikliği nedeniyle karaciğerde sıkışıp kaldıkları için sınırlı bir başarı vardı6,7. Ayrıca, NIR-PIT mekanizması geleneksel PDT'den tamamen farklıdır. Geleneksel ışığa duyarlılıklayıcılar, ışık enerjisini emen, heyecanlı bir duruma yer alan, zemin durumuna geçiş yapan ve apoptoza neden olan bir enerji dönüşümünden kaynaklanan oksidatif stres üretir. Bununla birlikte, NIR-PIT, bir fotokimyasal reaksiyon yoluyla membranda fotosensilatizerleri toplayarak hücre zarını doğrudan yok ederek hızlı nekroza neden olur8. NIR-PIT birçok yönden geleneksel hedefli PDT'den daha üstündür. Geleneksel ışığa duyarlılıklar, çok sayıda ışığa duyarlılıklaştırıcının tek bir antikor molekülüne bağlanmasını gerektiren ve potansiyel olarak bağlayıcı yakınlığı azaltan düşük yok olma katsayılarına sahiptir. Geleneksel ışığa duyarlılıkların çoğu hidrofobiktir, bu da fotoizatörlerin immünoreaktivitelerinden veya in vivo hedef birikimlerinden ödün vermeden antikorlara bağlanmasını zorlaştırır. Geleneksel ışığa duyarlılıklar tipik olarak görünür aralıktaki ışığı emerek doku penetrasyonunu azaltır.
Akciğer kanseri ve malign plevral mezotelioma (MPM) hücreleri gibi intratorasik tümörleri hedefleyen NIR-PIT üzerinde yapılan çeşitli çalışmalar9, 10,11,12,13,14,15,16,17bildirilmiştir. Bununla birlikte, sadece birkaç rapor NIR-PIT'in plevral yaygın MPM veya akciğer kanseri modellerinde etkinliğini tanımlamıştır9,10,11,12. Deri altı tümör ksinograft modellerinin standart tümör modelleri olduğu düşünülmektedir ve şu anda yeni tedavilerin antitümör etkilerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır18. Bununla birlikte, deri altı tümör mikroçevrİmİ, uygun bir doku yapısının veya gerçek bir malign fenotip 19 , 20 ,21,22'yidüzgün bir şekilde rekapte eden bir durumun geliştirilmesi için izindeğildir. İdeal olarak, antitümör etkilerin daha hassas bir şekilde değerlendirilmesi için ortotopik hastalık modelleri oluşturulmalıdır.
Burada, NIR-PIT kullanılarak tedavi edilen plevral yaygın akciğer kanserinin fare modelinde bir etkinlik değerlendirme yöntemi gösteriyoruz. Plevral yayılım fare modeli, tümör hücrelerinin torasik boşluğa enjekte ederek üretilir ve luciferaz lüminesansı kullanılarak doğrulanır. Fare, IR700 ve NIR ışınlama ile konjuge edilen intravenöz bir mAb enjeksiyonu ile tedavi edildi. Terapötik etki luciferaz lüminesans kullanılarak değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm in vivo deneyler, Nagoya Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Laboratuvar Hayvan kaynaklarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçek gerçekleştirildi (onay #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Nagoya Üniversitesi Hayvan Merkezi'nde altı haftalık homozigot athymic çıplak fareler satın alındı ve bakımı yapıldı. Farelerde prosedürü gerçekleştirirken, izofluran ile uyuşturuldular (giriş: % 4-5, bakım% 2-3); pati, anestezinin derinliğini doğrulamak için cımbızla bastırıldı.
1. iab ile IR700 konjugasyonu
- 1 h için 15-25 °C'de 0.1 mol/L Na 2 HPO 4 (pH 8.6) ile IR700 NHS ester (DMSO'da 66.8 mg,34.2nmol, 5 mmol/L) ile 1 mg, 6.8 nmol) kuluçkaya yatırın.
- Karışımı bir sütun kullanarak arındırın (örneğin, Sephadex). Sütunu PBS ile hazırlayın ve yıkayın. Daha sonra karışımı sütuna uygulayın ve saflaştırılmış IR700 konjuge antikoru içeren damlayı toplayın. Bu IR700 konjuge antikor antikor ışığa duyarlılık konjuge (APC) olarak adlandırılır.
- APC'deki protein ve IR700 konsantrasyonu ölçün.
- Spektrofotometre kullanarak protein ve IR700 için kalibrasyon eğrileri hazırlayın.
- Standart albümin konsantrasyonlarını kit protokolünü takiben bir protein test kiti ile karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu, Coomassie Parlak Mavi (CBB) protein boyama). Albümin absorbansını 595 nm dalga boyunda ölçün ve aşağıdaki denklemi kullanarak protein için kalibrasyon eğrisini (doğrusal bir yaklaşım formülü) çizin: y = ax + b (x: konsantrasyon, y: absorbans).
- Aynı prosedürü kullanarak 690 nm'de emilim ile IR700 için kalibrasyon eğrileri elde edin. Standart IR700 konsantrasyonu 0,1-5 μM'de (0,1954-9,77 μg/mL) önerilir.
- APC'deki protein konsantrasyonunu ve IR700 konsantrasyonunu kalibrasyon eğrisi [x = (y-b)/a (x: konsantrasyon, y: absorbans)] kullanarak ölçün.
- Molar konsantrasyonunun sonuçlarıyla mAb başına bağlı IR700 boya sayısını belirleyin.
NOT: mAb molekülü başına en uygun IR700 moleküllerinin konjugasyon sayısını belirlemek önemlidir. Genel olarak, tek bir mAb molekülüne bağlı yaklaşık üç IR700 molekülü hem in vitro hem de in vivoetkili olacaktır. Antikor başına bağlı birçok IR700 (örneğin, altı), in vivo deneyler sırasında karaciğerde sıkışmayı kolaylaştırır. IR700'e bağlı antikor oranı 1:2-1:4 aralığındaydı. Gerekirse IR700 oranı azaltıldı.
- APC oluşumu için bir onay olarak sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) gerçekleştirin. Jeli floresan görüntüleyici kullanarak 700 nm'de görüntüleyin ve jeldeki proteini kit protokolünü takip eden bir protein boyama kiti kullanarak lekelenin (bkz. Malzeme Tablosu, CBB protein boyama).
2. Plevral yaygınlaştırma modelinin üretimi
- Luciferaz eksprese edici hedef hücreleri hazırlayın ve 100 μL fosfat tamponlu salinde (PBS) 1.0 × 106 hedef hücreyi askıya alın
NOT: Akciğer kanseri ve MPM gibi intratorasik kanser hücreleri hedef hücre olarak uygundur. Luciferaz ekspresyonu hücreleri luciferaz gen transfeksiyon yoluyla hazırlandı ve 10 hücre geçişi > sonra luciferazın yüksek ekspresyonu doğrulandı. Hücreler % 10 fetal sığır serumu ve penisilin (100 IU/mL) ve streptomisinin (100 mg/mL) ile desteklenmiş bir ortamda kültürlendi. Hücre sayısı tümör büyüme hızına ve tedavi süresine göre ayarlandı (1.0. × 105 -6.0× 106 hücre/vücut ağırlığı). - Tercih edilen vücut ağırlığı 19-21 g olan 8-12 haftalık dişi homozigot athymic çıplak fareler hazırlayın.
- İşlem sırasında fareleri izofluran ile uyuşturun (giriş: % 4-5, bakım% 2-3); reaksiyon olmadığını onaylamak için kuyruğa cımbızla bastırın.
- Polistiren köpüklü bir durdurucu yapın ve akciğer yaralanmasını önlemek için ucun 5 mm'de kalması için durdurucuyu 30 G iğneye takın. Pnömotorakstan kaçınmak için iğne ucunu temiz ön ayaklarla veya %70 EtOH ile temizlenmiş sert bir nesneye bastırarak bükün (Şekil 1).
DİkKAT: Kendini delmemeye dikkat edin. İğneyi bükmek için tokmak kullanın. İğneye tağrken durdurucuyu tutmayın. Hücreleri şırındağa doldurmadan önce durdurucuyu yapıştırmak daha güvenlidir. - Bir şırıngayı (1 mL) hedef hücrelerle doldurun ve bir durdurucu ile 30G iğne takın.
- İşlemden önce hayvanın göğsünü% 70 EtOH ile dezenfekte edin.
- Farenin göğsüne bir iğneyi interkostal boşluktan delin. O sırada kaburgalara vururken direnç nedeniyle iğne ucu yukarı ve aşağı hareket etti. Interkostal alandan geçtikten sonra şırınna fareye bastırın ve 100 μL hedef hücre enjekte edin (Şekil 2).
NOT: İğne göğüs boşluğuna düzgün bir şekilde girdiğinde fare derin nefes eder. İğne ucunun bükülmesi ile pnömotoraks ve akciğere uygun olmayan hücre enjeksiyonu önlenebilir.
NOT: Kalp duvarı delinme riskini önlemek için sağ göğüs duvarı delinmesi önerilir. - Hücreleri torasik boşluğa yaymak için fareyi 2-3 kez yuvarlayın.
- Fareyi temiz ve sıcak bir kafese geri döndürün ve ambülatöre kadar izleyin. İşlemden sonra, fare anesteziden uyanacak ve normal davranacaktır.
3. Biyolüminesans ölçümü
NOT: Veri toplama için kullanılan yazılım Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
- Plevral yayılım modelinin neslini doğrulamak için, hücreleri torasik boşluğa enjekte ettikten sonra her gün biyolüminesans görüntülerini değerlendirin.
- Fareleri uyuşturun (adım 2.3) ve D-luciferin (15 mg / mL, 200 μL) ile intraperitoneally enjekte edin.
- Farenin görüntülemeden önce ve sonra normal nefes almasını sağlayın. Anestezi sırasında hipotermiyi önlemek için gerekirse bir ısıtıcı kullanın.
- Enjeksiyondan on dakika sonra, fareyi biyolüminesans görüntüleme (BLI) ölçüm ekipmanına ayarlayın. Görüntü alımı için yazılımın Edinme Denetim Masası'nı açın. Parlaklık, Fotoğrafve Kaplama (Şekil 3) 'yiseçin.
- Pozlama süresini Otomatik olarak ayarlayın. Binning'i küçük olarak ayarla.
- F/stop'ı parlaklık için 1 ve fotoğraf için 8 olarak ayarlayın; f/stop, şarjlı bağlı cihaz dedektörü tarafından alınan ışık miktarını kontrol ediyor.
- Görünüm Alanını Colarak ayarlayın.
- Fare örneği görüntülemeye hazır olduğunda, görüntüleme alımı için Al'ı tıklatın. Daha fazla çalışma için yeterli luciferaz aktivitesi olan fareler seçildi.
NOT: Uygun bir plevral yayma modeli, ventral taraftan bakıldığında göğüsteki dağınık bölgede güçlü lüminesans gösterir. BLI görüntüleri toraksta ve sadece enjeksiyon bölgesinde dağıtılmazsa, tümör deri altından nakledilebilir. - Görüntüyü görüntüledikten sonra, görüntü biçimini Radiance olarak ayarlayın. Araç Paleti panelini açın (Şekil 4A).
- Yatırım Getirisi Araçları 'nıseçin. Görüntülerdeki biyolüminesan alanı aralığı için Circle'ı kullanmanızı öneririz.
- Yüzey biyolüminesansı yoğunluğunu ölçmek için RoI'leri ölç'ü tıklatın (Şekil 4B).
- Gereken değerleri/bilgileri seçmek için yatırım getirisi ölçüm panelinin sol köşesindeki Ölçümü Yapılandır'ı kullanın. Bu veri tablosunu .csv dosyası olarak verin (Şekil 4C).
- .csv dosyasında biyolüminesan yoğunluk nicelemesi olarak Toplam Akı (p/s) değerlerini kullanın.
4. Dağınık lüminesans görüntüleme tomografisi (DLIT)
NOT: Veri toplama için kullanılan yazılım Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
- X-ray Armed düğmesini açın.
- Fareleri uyuşturun (adım 2.3) ve ardından D-luciferin (15 mg / mL, 200 μL) intraperitoneally farelere enjekte edin. DLIT'i sürekli olarak 3,2'den 3,7'ye çekmek için bu adımı atlayın.
- Enjeksiyondan on dakika sonra fareyi BLI ekipmanına ayarlayın.
- Yazılımın Edinme Denetim Masası'nı açın. Parlak , Fotoğraf, CT, Standart-Bir Fareve Kaplama 'yıseçin. Diğer ayarlar 3.4-3.6(Şekil 5A)ile aynıydı.
- Edinme Denetim Masası'nda Görüntüleme Sihirbazı'nı seçin.
- Biyolüminesans'ı ve ardından DLIT 'i (Şekil 5B) seçin.
- Ölçülecek dalga boyu olarak Firefly'ı seçin (Şekil 5C).
- Görüntüleme Konusunu Fare, Pozlama parametrelerini Otomatik Ayarlar, Görüş Alanını C-13,4 cmve Konu Yüksekliğini 1,5 cm ( Şekil5D) olarak ayarlayın.
- Itme X ışınları enerjilendiğinde üretilecektir. öğesini 0,.
- CT sıralı görüntü verilerini açın.
- Araç Paletinde Yüzey Topografyası'nı açın. Göster 'i seçin (Şekil 6A).
- Mor ekran yalnızca gövde yüzeyini gösterecek şekilde eşiği ayarlayın (Şekil 6B). Ardından, Konu Çıplak Fare'yi seçin ve Yüzey Oluştur 'utıklatın. Farenin anahattının doğru çizildiğinden emin olun (Şekil 6C).
- Araç Paleti, DLIT 3D Rekonstrüksiyon Özellikleri sekmesini açın. Fare Dokusu olarak Doku Özelliklerini ve Ateş Böceği Olarak Kaynak Spektrumu 'nı seçin(Şekil 6D). Ardından, Çözümle sekmesini açın ve seçilen her dalga boyu verisi için verileri onaylayın. Son olarak, Yeniden Yapılandır düğmesini (Şekil 6E) tıklatın.
- Yapılandırılmış DLIT görüntüsünde göğüs boşluğunda BLI varlığını onaylayın.
5. In vivo plevral yayma modeli için NIR-PIT
- Bir güç ölçer ile 690 nm dalga boyu (NIR) lazer ışık dozunu ölçün ve çıkışı 100 mW / cm2'yeayarlayın.
NOT: Lazer ışığı hassas bir bobin boyutu ile tutarlıdır; böylece, ışık enerjisi 50 cm içindeki mesafeden bağımsız olarak neredeyse hiç değişmez. Yanıklar gibi birçok olumsuz olay varsa, 40 mW / cm2aralığında çıkışı azaltın. - Kuyruğu% 70 EtOH ile temizleyin ve NIR ışınlamadan 24 saat önce kuyruk damarı aracılığıyla APC (100 μg) enjekte edin. Kanamayı kontrol etmek için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.
NOT: Enjeksiyon için APC hacmini 50-200 μL'ye ayarlayın. - Fareleri uyuşturun (adım 2.3) ve sırt üstü yatırın. Hedef olmayan bölgeye NIR ışınını önlemek için, diğer bölgeleri alüminyum folyo ile siper edin (Şekil 7A). 100 J/cm2lazer ile NIR ışık ile ışınlanın; tümör göbeğe geri yayılırsa, NIR-ışık ışınlama dozu birden fazla yöne bölünebilir (Şekil 7B).
NOT: İn vitro sonuçlara ve yanık gibi olumsuz olaylara bağlı olarak dozu30-150 J/cm 2 olarak ayarlayın. - NIR ışınlama tamamlandığında ve fare uyanık olduğunda, kafese geri döndürün.
- BLI'ye uyun ve yatırım getirisini zaman içinde (her gün) ölçün (Bkz. 3.2-3.12).
- Ex vivo görüntüleme için, NIR ışınlamadan hemen önce, APC enjeksiyonundan 24 saat sonra karbondioksitli fareleri ötenazi edin.
- Farenin göğsünün içini gözlemlemek için toraksı çıkarın ve kaburgaları ve sternumu kesin. APC yönetimi olmadan kontrolün yanında floresan görüntüsünü (700 nm) yakalayın. Daha sonra, maruz kalan toraksın üzerine D-luciferin (150 μg/mL) uygulayın ve BLI alındı (bkz. 3.2-3.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-podoplanin antikoru NZ-1, NZ-1-IR700 üretmek için IR700 ile eşleştirilmişti. NZ-1 ve IR700'ün bir SDS-PAGE(Şekil8)üzerinde bağlanmasını doğruladık. Luciferaz ekspresyatif H2373 (H2373-luc), malign mezotelioma hücrelerinin (H2373) luciferaz geni10ile transfecting ile hazırlanmıştır.
8-12 haftalık dişi homozigot athymic çıplak fareleri uyuşturduk ve torasik boşluğa 1 ×10 5 H2373-luc hücresi enjekte ettik. Tümör hücrelerinin farelere enjeksiyon günü 1.
4. günde, D-luciferin (15 mg/mL, 200 μL) intraperitoneal olarak enjekte edildikten sonra BLI ve DLIT yapıldı ve daha sonraki çalışmalar için göğüs boşluğunda yeterli luciferaz aktivitesi olan fareler seçildi(Şekil 9). Kuyruk damarı üzerinden yüz mikrogram NZ-1-IR700 (100 μL) intravenöz olarak enjekte edildi. Kontrol grubuna PBS (100 μL) enjekte edildi.
5. günde, iki fare ex vivoiçin karbondioksit boğulması kullanılarak kurban edildi. NZ-1-IR700 enjekte edilen fare, torasik tümörlerde hem yüksek IR700 floresan hem de luciferaz aktivitelerini göstererek intravenöz olarak enjekte edilen NZ-1-IR700'in yaygın plevral tümör bölgelerine ulaştığını göstermiştir (Şekil 10).
Nir-PIT'in plevral yaygınlaştırılmış fare modelinde etkisinin değerlendirilmesi için NIR ışığı 15 J/cm2'de iki yönden (toplam 30 J/cm2)40 mW/cm2 transkütan olarak 5. günde (NIR ışığı dışarıdan ışınlandı) uygulandı ve ardından seri BLI uygulandı. Kontrol grubu NIR ışığı ile ışınlanmamıştır.
NIR-PIT ile farelerin tedavisinden sonra, tedavi edilen grup luciferaz aktivitesinin azaldığını gösterdi. Bununla birlikte, kontrol grubundaki göreli ışık birimi kademeli bir artış göstermiştir (*p < 0.05'e karşı kontrol, t-test) (Şekil 11).
Şekil 1: Hücre nakli için kolay el yapımı cihaz. Polistiren köpükle yapılan durdurucuyu 30G iğneye takın, böylece uç 5 mm'de kalır. Pnömotorakstan kaçınmak için iğnenin ucu bükülmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hedef hücrelerin torasik boşluğa enjeksiyonu. Fareyi yana çevirin ve iğneyi fareye doğru akciğere doğru delin. Durdurucu ve iğne ucu büküldüğü için iğne akciğerlere yapışmadan torasik boşluğa girer. İğneyi fareye bastırırken hedef hücreleri enjekte edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Alım Kontrol Paneli. Parlak , Fotoğrafve Kaplama 'yıseçin. Pozlama Süresini Otomatik, Binning'i Küçük,f/stop'u lüminesan ve 8'i fotoğraf için 8 ve Görüş Alanını Colarak ayarlayın. Fare örneği görüntülemeye hazır olduğunda, görüntüleme alımı için Al'ı tıklatın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ölçüm (BLI). (A) Takım Paleti paneli. Yatırım Getirisi Araçları'nı seçin. Circle'a görüntülerdeki biyolüminesan alanı kapsamasını öneririz. (B) BLI nicelemesi. Her görüntüde yatırım getirisini seçtikten sonra, analiz etmek için RoI'leri ölç'ü tıklatın. (C) Nicelik bilgileri. Gereken değerleri/bilgileri seçmek için yatırım getirisi ölçümleri panelinin sol köşesindeki Ölçümü Yapılandır'ı kullanın. Bu veri tablosunu .csv dosyası olarak verin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: DLIT'in kazanılması. (A) DLIT için Alım Kontrol Paneli. Parlak, Fotoğraf, CT, Standart Bir Fareve Kaplama 'yıseçin. Diğer ayarlar 3.4-3.6 (Şekil 3) ile aynıdır. (B) Görüntüleme Sihirbazı paneli. Biyolüminesansve DLIT'i seçin. (C) Ölçüm dalga boylarını seçin. Dalga boylarını ateş böceği olarakseçin. (D) Görüntüleme Konusunu Fare, Pozlama Parametrelerini Otomatik Ayarlar, Görüş Alanını C-13,4 cmve Konu Yüksekliğini 1,5 cm olarak ayarlayın. Daha sonra Click X ışınları enerjilendiğinde üretilecektir. Kazanmak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: DLIT.(A) Takım Paletipanelinin yeniden yapılandırılması. Araç Paletinde Yüzey Topografyası'nı açın. Göster 'iseçin. (B) Fare yüzeyi tanıma ayarlanması. Mor ekran yalnızca gövde yüzeyini gösterecek şekilde Eşiği ayarlayın. Çıplak Farekonusunu seçin, sonra Yüzey Oluştur 'utıklatın. Farenin anahattının doğru çizilmiş olduğundan emin olun. (C) Araç Paleti. DLIT 3D rekonstrüksiyon Özellikleri sekmesini açın, Fare Dokusu olarak Doku Özellikleri'ni ve Fireflyolarak Kaynak Spektrumu 'nı seçin. (D) Çözümle sekmesini açın ve her dalga boyu verisi için verileri seçin. (E) Yeniden Yapılandır düğmesine tıklayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: NIR ışınlama. (A) Nir ışınlanmasını önlemek için karnını alüminyum folyo ile siper edin. (B) BLI'nin güçlü olduğu lazer kullanarak NIR ışığını ışınla; Bazı durumlarda, NIR lazer birden fazla yöne bölünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: SDS-PAGE. Bir SDS-PAGE jelinde konjuge NZ-1-IR700'ün başarılı bir şekilde onaylanması (sol, kolloidal mavi boyama; sağ, floresan 700 nm kanalda). Seyreltilmiş NZ-1 kontrol görevi buldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: DLIT. Torasik boşluktaki luciferaz ekspresyel tümör hücrelerinin doğrulanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Ex vivo görüntüleme. BLI ile NZ-1-IR700 enjeksiyonundan sonra plevral yaygın MPM modeli 24 saat karakterizasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: NIR-PIT'in plevral yaygın model üzerindeki antitümör etkisi. (A) Podoplanin hedefli NIR-PIT rejimi bir çizgide gösterilir. Podoplanin hedefli NIR-PIT ile NZ-1-IR700 Plevral yayılımlı modelde H2373-luc tümörleri. Plevral yaygın modelin BLI'si gösterilmiştir. (B) NIR-PIT grubunda BLI ile ölçülen luciferaz aktiviteleri artmazken, tümör büyümesi ile birlikte kontrol grubu da kademeli bir artış göstermiştir. (n ≥ her iki grupta da 3, t-test). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada NIR-PIT'in MPM'nin plevral yayılım modeli üzerindeki terapötik etkisini ölçmek için bir yöntem ortaya koyduk. NIR-PIT ile son derece seçici hücre öldürme yapıldı; böylece, normal doku neredeyse hiç zarar görmedi23,24,25. Bu tür seçici hücre öldürme ile NIR-PIT'in yaygın modeller9,26'dagüvenli olduğu gösterilmiştir. Ancak, bazı adımlarda alternatif yöntemler mümkündür. Plevral yayılma modeli27 , 28,29,30için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Enjeksiyon modelini seçtik çünkü farelere en az külfetli olan basit bir prosedürdür. NIR-PIT'in terapötik etkisini ölçmek için BLI'yi kullandık çünkü canlı farelerle nicel olarak değerlendirebiliyoruz. Örneğin pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT)27 plevral yayılım modelinin tümör hacmini değerlendirmenin alternatif bir yolu olabilir. Diğer ortotopik modellerde BLI ile NIR-PIT bildirilmiştir; NIR-PIT karın yayılım modeli, akciğer çoklu metastatik tümör modeli ve beyin tümörü12,26,31,32,33,34,35,36için kullanılabilir. BLI ile küçük metastatik tümör odakları bile gözlenebilir ve NIR-PITyapılabilir 11,12.
Protokolün bazı kısımlarını ön deneylere dayanarak tanımladık. İlk olarak, APC yönetiminden NIR ışınlama dönemine kadar olan süre. Farmakokinetikler deri altı tümör modeli kullanılarak önceden değerlendirildi. APC, mAb kullanılarak kuyruk damarı üzerinden yapılan müdahaleden 24 saat sonra tümörde zirveler; NIR ışınlama, APC yönetimi 9 , 10,11,12'densonra24saat gerçekleştirilebilir. İkinci olarak, NIR-PIT'teki tümör hücrelerini öldürmek için gereken NIR ışık dozu, in vitro sonuçlar kullanılarak tahmin edilen antikor ve hedef hücre hatlarına bağlı olarak farklılık gösterir.
Bu çalışmanın birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, tümörler torasik boşlukta yaygın olarak dağıtıldı ve NIR ışınlanmış enerji tam olarak ölçülemedi. NIR ekscitasyon ışığının dalga boyu (690 nm'de tepe) dokuya en az 2-3 inç penetrasyon sağlar37. Bu nedenle, fareler durumunda, NIR ışığı torasik boşluğa dışarıdan bile ulaşır. Şu anda, NIR lazer cihazları fare plevral yayma modeli9, 10,11,12için kullanılır. Bununla birlikte, gerçek klinik kullanımda, torasik drenaj tüpü34 aracılığıyla tüm intratorasik boşluğu ışınlamak için hassas fiber optikler kullanmayı planlıyoruz. İkinci olarak, NIR ışınlama dozu, mAb'nin tümör hücreleri üzerinde ifade edilen antijenlere özgülüğüne bağlı olarak sınırlıdır. APC'nin spesifik olmayan bağlanması beklenmedik organ hasarına neden olabilir.
Sonuç olarak, MPM'nin plevral yayılım modelinde BLI ile NIR-PIT'in terapötik etkisini değerlendirmek için bir yöntem sunduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Hiç kimse
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L.
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
