Summary
פוטוימונותרפיה כמעט אינפרא אדום (NIR-PIT) היא אסטרטגיה טיפולית מתפתחת לסרטן המשתמשת בנוגדן-פוטואבסורבר (IR700Dye) מצומד ואור NIR כדי להרוס תאים סרטניים. כאן, אנו מציגים שיטה להערכת ההשפעה האנטי-אטומית של NIR-PIT במודל עכבר של סרטן ריאות מופץ pleural ומזותליומה פלורלית ממאירה באמצעות הדמיית ביולומינציה.
Abstract
את היעילות של פוטוימונותרפיה ניתן להעריך בצורה מדויקת יותר עם מודל עכבר אורתופופי מאשר עם אחד תת עורי. מודל הפצת pleural יכול לשמש להערכת שיטות טיפול למחלות תוך-ריאה כגון סרטן ריאות או מזותליומה פלורלית ממאירה.
פוטוימונותרפיה כמעט אינפרא אדום (NIR-PIT) היא אסטרטגיה לטיפול בסרטן שפותחה לאחרונה המשלבת את הספציפיות של נוגדנים ממוקדי גידולים עם רעילות הנגרמת על ידי פוטואבסורבר (IR700Dye) לאחר חשיפה לאור NIR. היעילות של NIR-PIT דווחה באמצעות נוגדנים שונים; עם זאת, רק כמה דיווחים הראו את ההשפעה הטיפולית של אסטרטגיה זו במודל אורטופי. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים דוגמה להערכת יעילות של מודל סרטן הריאות המופצה pleural, אשר טופל באמצעות NIR-PIT.
Introduction
סרטן נותר אחד הגורמים המובילים לתמותה למרות עשרות שנים של מחקר. סיבה אחת היא כי הקרנות וכימותרפיה הן טכניקות פולשניות מאוד, אשר עשוי להגביל את היתרונות הטיפוליים שלהם. טיפולים תאיים או מולקולריים ממוקדים, שהם טכניקות פחות פולשניות, מקבלים תשומת לב מוגברת. פוטוימונותרפיה היא שיטת טיפול המשפרת באופן סינרגטי את האפקט הטיפולי על ידי שילוב אימונותרפיה ופוטותרפיה. אימונותרפיה מגבירה את חסינות הגידול על ידי הגדלת האימונוגניות של מיקרו-סביבה של הגידול והפחתת דיכוי חיסוני, וכתוצאה מכך הרס של גידולים בגוף. פוטותרפיה הורסת גידולים ראשוניים עם שילוב של רגישים לאור וקרני אור, ואנטיגנים ספציפיים לגידול המשתחררים מתאי הגידול משפרים את חסינות הגידול. גידולים יכולים להיות מטופלים באופן סלקטיבי באמצעות רגישים לפוטו-סנסיטר מכיוון שהם ספציפיים וסלקטיביים עבור תאי היעד. המודאליות של פוטותרפיה כוללת טיפול פוטודינמי (PDT), טיפול פוטותרמי (PTT) וטיפולים מבוססי פוטוכימיה1.
פוטוימונותרפיה כמעט אינפרא אדום (NIR-PIT) היא שיטה שפותחה לאחרונה של פוטותרפיה אנטי-אטומית המשלבת טיפול פוטוכימי ואימונותרפיה1,2. NIR-PIT הוא טיפול ממוקד מולקולרית המכוון למולקולות ספציפיות של פני תא באמצעות הטיות של צבע סיליקון פתלוצינין כמעט אינפרא אדום, IRdye 700DX (IR700), לנוגדן חד שבטי (mAb). קרום התא של תא היעד נהרס על הקרנה עם אור NIR (690 ננומטר)3.
הרעיון של שימוש בטיפול ממוקד באור על ידי שילוב רגישים קונבנציונליים ונוגדנים או PDT ממוקד הוא מעל שלושה עשורים בן4,5. מחקרים קודמים ניסו למקד סוכני PDT קונבנציונליים על ידי הטיות שלהם נוגדנים. עם זאת, הייתה הצלחה מוגבלת כי מצומדים אלה היו לכודים בכבד, בשל ההידרופוביה של רגישים לאור6,7. יתר על כן, המנגנון של NIR-PIT שונה לחלוטין מזה של PDT קונבנציונאלי. רגישים קונבנציונליים מייצרים עקה חמצונית הנובעת מהמרת אנרגיה הסופגת אנרגיית אור, נקעת למצב נרגש, עוברת למצב הקרקע וגורמת לאפופטוזיס. עם זאת, NIR-PIT גורם נמק מהיר על ידי הרס ישיר של קרום התא על ידי צבירת רגישים על הממברנה באמצעות תגובה פוטוכימית8. NIR-PIT עדיפה על PDT ממוקד קונבנציונלי במובנים רבים. רגישים קונבנציונליים יש מקדמי הכחדה נמוכה, הדורשים התקשרות של מספר גדול של רגישים לאור למולקולת נוגדן אחת, פוטנציאל הפחתת זיקה מחייבת. רוב רגישי האור הקונבנציונליים הם הידרופוביים, מה שמקשה על איגוד הרגישות לאור לנוגדנים מבלי להתפשר על חוסר החיסון שלהם או על הצטברות היעד של vivo. רגישים קונבנציונליים בדרך כלל לספוג אור בטווח הנראה, הפחתת חדירת רקמות.
מספר מחקרים על NIR-PIT מיקוד גידולים תוך-אתורקיים כגון סרטן ריאות ותאי מזותליומה pleural ממאיר (MPM) דווחו9,10,11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, רק כמה דיווחים תיארו את היעילות של NIR-PIT במודלים MPM מופצים pleural או סרטן ריאות9,10,11,12. מודלים תת עוריים של קסנוגרפט גידול נחשבים למודלים סטנדרטיים של גידולים, והם נמצאים כיום בשימוש נרחב להערכת ההשפעות האנטי-אטומיות של הטיפולים החדשים18. עם זאת, microenvironment הגידול תת עורי אינו מתירני להתפתחות של מבנה רקמות מתאים או מצב כי כראוי recapitulates פנוטיפ ממאיר אמיתי19,20,21,22. באופן אידיאלי, מודלים למחלות אורתוטופיות יש להקים להערכה מדויקת יותר של ההשפעות antitumor.
כאן, אנו מדגימים שיטה של הערכת יעילות במודל עכבר של סרטן ריאות מופץ pleural, אשר טופל באמצעות NIR-PIT. מודל עכבר הפצת pleural נוצר על ידי הזרקת תאים סרטניים לתוך חלל בית החזה ואושר באמצעות לוציפראז אור. העכבר טופל בזריקה תוך ורידי של mAb מצומדת עם IR700 והקרנת ניר לחזה. האפקט הטיפולי הוערך באמצעות לוציפראז אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים ב-vivo בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש במשאבי בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת נגויה טיפול ושימוש בבעלי חיים (אישור #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). עכברי עירום הומוזיגוטה אתימיים בני שישה שבועות נרכשו ומתוחזקים במרכז החיות של אוניברסיטת נגויה. בעת ביצוע ההליך בעכברים, הם היו מרדים עם איזופלוריין (מבוא: 4-5%, תחזוקה 2-3%); כף רגלו נלחצה עם פינצטה כדי לאשר את עומק ההרדמה.
1. הטיות של IR700 עם mAb
- דגירה mAb (1 מ"ג, 6.8 ננומול) עם אסתר IR700 NHS (66.8 מ"ג, 34.2 נמול, 5 mmol / L ב- DMSO) ב 0.1 מול / L Na2HPO4 (pH 8.6) ב 15-25 °C ל 1 שעה.
- לטהר את התערובת באמצעות עמודה (למשל, Sephadex). הכן ושטוף את העמודה באמצעות PBS. לאחר מכן, להחיל את התערובת על העמודה ולאסוף את טיפה, אשר מכיל את הנוגדן IR700-מצומד מטוהר. נוגדן זה, ה-IR700, מכונה הנוגדן רגיש להונאה (APC).
- מדוד את החלבון ואת ריכוז IR700 בנגמ"ש.
- הכינו עקומות כיול לחלבון ו-IR700 באמצעות ספקטרופוטומטר.
- ערבבו ריכוזים סטנדרטיים של אלבומין עם ערכת בדיקה של חלבונים בעקבות פרוטוקול הערכה (ראו טבלה של חומרים, כתמי חלבון כחול מבריק של קומאסי (CBB). מדוד את הספיגה של אלבומין באורך גל של 595 ננומטר, והתווה את עקומת הכיול (נוסחת קירוב ליניארית) עבור החלבון באמצעות המשוואה הבאה: y = גרזן + b (x: ריכוז, y: ספיגה).
- קבל עקומות כיול עבור IR700 עם ספיגה ב 690 ננומטר באמצעות אותו הליך. הריכוז הסטנדרטי של IR700 מומלץ ב 0.1-5 מיקרומטר (0.1954-9.77 מיקרוגרם / מ"ל).
- מדוד את ריכוז החלבון ואת ריכוז IR700 ב- APC באמצעות עקומת כיול [x = (y-b)/a (x: ריכוז, y: ספיגה)].
- קבע את מספר הצבעים של IR700 הכרוך לכל mAb עם התוצאות של ריכוז הטוחנת.
הערה: חשוב לקבוע את מספר ההטיות האופטימלי של מולקולות IR700 לכל מולקולת mAb. בדרך כלל, כשלוש מולקולות IR700 קשורות על מולקולת mAb אחת יהיה יעיל הן במבחנה והן in vivo. IR700 רבים קשורים לנוגדן (למשל, שש) מקלים על להיות לכוד בכבד במהלך ניסויי vivo. היחס בין הנוגדנים הקשורים ל- IR700 היה בטווח של 1:2-1:4. שיעור IR700 הופחת, במידת הצורך.
- בצע אלקטרופורזה ג'ל נתרן דודסיל סולפט-polyacrylamide (SDS-PAGE) כאישור להיווצרות של נגמ"ש. צלם את הג'ל ב- 700 ננומטר באמצעות צלם פלואורסצנטי, והכתים את החלבון בג'ל באמצעות ערכת כתמי חלבון בהתאם לפרוטוקול הערכה (ראה טבלה של חומרים , כתמיחלבון CBB).
2. דור של מודל הפצת pleural
- הכן תאי יעד המביעים לוציפראז והשהה 1.0 × 106 תאי יעד ב-100 מיקרו-אל של תמיסת מלח עם אגירה בפוספט (PBS)
הערה: תאים סרטניים תוך-גזעיים כגון סרטן ריאות ו- MPM מתאימים כתאי יעד. תאים מבטאים לוציפראז הוכנו באמצעות transfection גנים לוציפראז, וביטוי גבוה של לוציפראז אושר לאחר > 10 מעברי תאים. התאים היו בתרבית במדיום בתוספת 10% סרום בקר עוברי ופניצילין (100 IU / ML) וסטרפטומיצין (100 מ"ג / מ"ל). מספר התאים הותאם בהתאם לקצב הגידול ולמהלך הטיפול (1.0. × 105-6.0 × 106 תאים /משקל גוף). - הכן עכברים עירומים הומוזיגוטה אתימיים בני 8-12 שבועות, עם משקל גוף עדיף של 19-21 גרם.
- עכברים מרדים במהלך ההליך עם איזופלוריין (מבוא: 4-5%, תחזוקה 2-3%); לחץ על הזנב עם פינצטה כדי לאשר כי אין תגובה.
- הפוך פקק עם קצף פוליסטירן ולחבר את פקק מחט 30 G, כך הקצה נשאר ב 5 מ"מ כדי למנוע פגיעה ריאות. כופפו את קצה המחט במלקחיים נקיים או על ידי לחיצה עליו כנגד חפץ קשה שהנקה עם 70% EtOH כדי להימנע מפנאומוטורקס(איור 1).
זהירות: היזהר שלא לנקב את עצמך. השתמש במלקחיים כדי לכופף את המחט. אין להחזיק את המעצור בעת חיבורו למחט. זה בטוח יותר לתקוע את פקק לפני מילוי התאים לתוך המזרק. - מלא מזרק (1 מ"ל) בתאי מטרה, וחבר מחט 30G עם פקק.
- לחטא את החזה של החיה עם 70% EtOH לפני ההליך.
- לנקב מחט לתוך החזה של העכבר דרך החלל הבין-צילולי. בשל ההתנגדות תוך כדי פגיעה בצלעות באותו זמן, קצה המחט נע למעלה ולמטה. לאחר שעברו במרחב הבין-צילשי, לחצו על המזרק על העכבר והזריקו 100 מיקרו-אל של תאי יעד(איור 2).
הערה: העכבר נושם עמוק כאשר המחט נכנסת כראוי לחלל החזה. עם כיפוף קצה המחט, פנאומוטהורקס והזרקה לא הולמת של תאים לריאה ניתן היה להימנע.
הערה: נקב דופן החזה הימני מומלץ כדי למנוע את הסיכון של ניקוב דופן הלב. - גלגל את העכבר 2-3 פעמים כדי להפיץ את התאים ברחבי חלל בית החזה.
- החזר את העכבר לכלוב נקי וחם ולפקח עד אמבולטורי. לאחר ההליך, העכבר יתעורר מהרדמה ויתנהג כרגיל.
3. מדידת ביו-לומינציה
הערה: התוכנה המשמשת לרכישת נתונים מופיעה בטבלת החומרים.
- כדי לאשר את הדור של מודל הפצת הפלורלי, להעריך את תמונות bioluminescence כל יום לאחר הזרקת התאים לתוך חלל בית החזה.
- עכברים מרדים (שלב 2.3) ולהזריק תוך-איפריטונית עם D-לוציפרין (15 מ"ג/מ"ל, 200 μL).
- ודא שהעכבר נושם כרגיל לפני ואחרי ההדמיה. השתמש בתנור במידת הצורך כדי למנוע היפותרמיה במהלך הרדמה.
- עשר דקות לאחר ההזרקה, הגדר את העכבר בציוד המדידה של הדמיית הביולומינציה (BLI). לרכישת תמונות, פתח את לוח הבקרה של הרכישה של התוכנה. בחר זוהר, תצלום ושכבת-על (איור 3).
- הגדר זמן חשיפה כאוטוי. הגדר את Binning כקטן.
- הגדר f / עצור כ 1 עבור זוהר ו 8 לצילום; f/stop שולט בכמות האור המתקבל על-ידי גלאי המכשירים הטעון.
- הגדר את שדה הראייה כ- C.
- לאחר שדגימת העכבר מוכנה להדמיה, לחץ על רכש לרכישת הדמיה. עכברים עם פעילות לוציפראז מספיק נבחרו למחקרים נוספים.
הערה: מודל מתאים להפצת pleural מראה זוהר חזק באתר מפוזר בחזה כאשר הוא נצפה מהצד הגחוני. אם תמונות BLI אינן מפוזרות בבית החזה, ורק באתר ההזרקה, הגידול עשוי להיות מושתל תת עורית. - לאחר הצגת התמונה, הגדר את תבנית התצוגה כ'זוהר'. פתחו את החלונית 'לוח כלים' (איור 4A).
- בחר כלי ROI. אנו ממליצים להשתמש במעגל כדי לטווח את אזור הביו-זוהר בתמונות.
- לחץ על מדוד ROIs כדי למדוד את עוצמת הביו-זוהר של פני השטח (איור 4B).
- השתמשו בקביעת תצורה של מדידה בפינה הימנית של החלונית 'מדידת ROI' לבחירת הערכים/המידע הדרושים. יצא טבלת נתונים זו כקובץ .csv (איור 4C).
- השתמש בערכים של Total Flux (p/s) ככימות עוצמת הביו-זוהר בקובץ .csv.
4. טומוגרפיה של הדמיית לומינציה מפוזרת (DLIT)
הערה: התוכנה המשמשת לרכישת נתונים מופיעה בטבלת החומרים.
- הפעל את כפתור הרנטגן חמוש.
- להכשיר את העכברים (שלב 2.3) ולאחר מכן להזריק D-לוציפרין (15 מ"ג / מ"ל, 200 μL) תוך 100 μL) תוך איטראפריטוני לתוך העכברים. כדי לצלם DLIT ברציפות מ- 3.2 ל- 3.7, דלג על שלב זה.
- עשר דקות לאחר ההזרקה, הגדר את העכבר בציוד BLI.
- פתח את לוח הבקרה של הרכישה של התוכנה. בחר זוהר, תצלום, CT, עכבר רגיל-אחד ושכבת-על. הגדרות אחרות היו זהות להגדרות ב- 3.4-3.6(איור 5A).
- בחר באשף ההדמיה בלוח הבקרה של הרכישה.
- בחר ביו-לומינציה ולאחר מכן DLIT (איור 5B).
- בחר גחלילית כאורך הגל למדידתו (איור 5C).
- הגדר את נושא ההדמיה כעכבר, פרמטרי חשיפה כהגדרות אוטומטיות, שדה ראייה כ- C-13.4 ס"מוגובה הנושא כ- 1.5 ס"מ (איור 5D).
- תדחפו את צילומי הרנטגן כשיהיו אנרגטיים. לרכוש.
- פתח את נתוני התמונה הרציף של CT.
- פתחו את טופוגרפיה של משטח על לוח הכלים. בחר הצג (איור 6A).
- התאם את הסף כאשר התצוגה הסגולה מציגה רק את משטח הגוף(איור 6B). לאחר מכן, בחר בעכבר העירום נושא ולחץ על צור משטח. ודאו שחלוקה לרמות של העכבר מצוירת במדויק (איור 6C).
- פתח את לוח הכלים, הכרטיסיה מאפייני שחזור תלת-ממדי של DLIT. בחר מאפייני רקמות כרקמת עכבר וכספקטרום מקור כ- Firefly (איור 6D). לאחר מכן, פתח את הכרטיסיה ניתוח ואשר את הנתונים עבור כל נתוני אורך גל נבחרים. לבסוף, לחץ על לחצן בנייה מחדש (איור 6E).
- אשר את נוכחותו של BLI בחלל החזה בתמונת DLIT שתצורתה נקבעה.
5. NIR-PIT למודל הפצת pleural של ויוו
- מדוד את מינון האור של לייזר אורך גל של 690 ננומטר (NIR) עם מד כוח, ולהתאים את הפלט ל 100 mW / ס"מ2.
הערה: אור הלייזר קוהרנטי עם גודל סליל מדויק; לכן, אנרגיית האור כמעט ולא משתנה ללא קשר למרחק בטווח של 50 ס"מ. אם יש תופעות לוואי רבות, כגון כוויות, להפחית את הפלט בטווח של 40 mW / ס"מ2. - נקה את הזנב עם 70% EtOH ולהזריק APC תוך ורידי (100 מיקרוגרם) דרך וריד הזנב 24 שעות לפני הקרנת NIR. להפעיל לחץ על אתר ההזרקה כדי לשלוט דימום.
הערה: כוונן את עוצמת הקול של APC ל 50-200 μL להזרקה. - יש להרידים את העכברים (שלב 2.3) ולהניח אותם על גבם. כדי להימנע מהקרנת NIR לאתר שאינו מטרה, הגנו על אתרים אחרים בנייר אלומיניום(איור 7A). הקרנה עם אור NIR בלייזר של 100 J /cm2; אם הגידול מופץ בחזרה לבטן, ניתן לחלק את מינון ההקרנה של אור NIR בכיוונים מרובים (איור 7B).
הערה: להתאים את המינון ב 30-150 J / cm2 בהתאם לתוצאות במבחנה ותופעות לוואי כגון כוויות. - כאשר הקרנת NIR הושלמה והעכבר ער, להחזיר אותו לכלוב.
- שימו לב ל-BLI ומדדו את ההבח"ג לאורך זמן (כל יום) (ראו 3.2-3.12).
- להדמיית ex vivo, להרדים עכברים עם פחמן דו חמצני 24 שעות לאחר הזרקת הנגמ"ש, מיד לפני הקרנת NIR.
- כדי להתבונן בחלק הפנימי של החזה של העכבר, להסיר את בית החזה לחתוך את הצלעות ואת החזה. לכוד את תמונת הפלואורסצנטיות (700 ננומטר) לצד הפקד ללא ניהול APC. לאחר מכן, להחיל D-לוציפרין (150 מיקרוגרם / מ"ל) על בית החזה החשוף, ואת BLI נלקח (עיין 3.2-3.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נוגדן אנטי פוטופלאנין NZ-1 היה מצומד עם IR700 כדי ליצור NZ-1-IR700. אישרנו את הכריכה של NZ-1 ו- IR700 על SDS-PAGE(איור 8). לוציפראז-מבטא H2373 (H2373-luc) הוכן על ידי transfecting תאי מזותליומה ממאירים (H2373) עם גן לוציפראז10.
אנחנו נודן 8-12 שבועות נקבה הומוזיגוטה אתימי עכברים עירומים והזרקנו 1 × 105 H2373-luc תאים לתוך חלל בית החזה. יום הזרקת תאי הגידול לעכברים צוין היום הראשון.
ביום 4, BLI ו- DLIT בוצעו לאחר D-לוציפרין (15 מ"ג / מ"ל, 200 μL) הוזרק תוך איטראפריטוני, ועכברים עם פעילות לוציפראז מספיק בחלל החזה נבחרו למחקרים נוספים (איור 9). מאה מיקרוגרם של NZ-1-IR700 (100 μL) הוזרקו דרך הווריד האחורי. קבוצת הביקורת הוזרקה עם PBS (100 μL).
ביום 5, שני עכברים הוקרבו באמצעות חנק פחמן דו חמצני עבור ex vivo. העכבר המוזרק NZ-1-IR700 הראה הן פלואורסצנטיות IR700 גבוהה והן פעילויות לוציפראז בגידולים בית החזה, מה שמצביע על כך שהוזרקו תוך ורידי NZ-1-IR700 הגיעו לאתרי הגידול הפלגיים המופצים (איור 10).
להערכת ההשפעה של NIR-PIT במודל העכבר המופצה, נורית NIR הופעלה ב-15 J/cm2 משני כיוונים (סה"כ 30 J/cm2)ב-40 מ"ר/ס"מ2 ביום 5 (אור NIR הוקרן חיצונית), ואחריו BLI סדרתי. קבוצת הביקורת לא הוקרן לאור ניר.
לאחר טיפול בעכברים עם NIR-PIT, הקבוצה המטופלת הראתה ירידה בפעילות לוציפראז. עם זאת, יחידת האור היחסית בקבוצת הביקורת הראתה עלייה הדרגתית (*p < 0.05 לעומת בקרה, t-test)(איור 11).
איור 1: מכשיר קל בעבודת יד להשתלת תאים. חבר את פקק עשה עם קצף פוליסטירן למחט 30G, כך הקצה נשאר ב 5 מ"מ. קצה המחט צריך להיות כפוף כדי למנוע דלקת ריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הזרקת תאי מטרה לחלל בית החזה. סובב את העכבר הצידה ונקב את המחט לעכבר לכיוון הריאה. מאז קצה פקק ומחט כפופים, המחט נכנסת לחלל בית החזה מבלי להידבק לריאות. הזרק תאי מטרה תוך כדי לחיצה על המחט נגד העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: לוח הבקרה של הרכישה. בחר זוהר, תצלום ושכבת-על. הגדר זמן חשיפה כאוטומי, Binning כקטן, f / עצור כ- 1 להבהרה ו- 8 לצילום, ושדה תצוגה כ- C. לאחר שדגימת העכבר מוכנה להדמיה, לחץ על רכש לרכישת הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מדידה (BLI). (A) לוח כלים. בחר כלי ROI. אנו ממליצים על המעגל לטווח אזור הביו-זוהר בתמונות. (B)כימות BLI. לאחר בחירת ההבחז לכל תמונה, לחץ על מדוד ROIs כדי לנתח. (ג)מידע כימות. השתמשו בקביעת תצורה של מדידה בפינה הימנית של החלונית 'מדידות ROI' לבחירת הערכים/המידע הדרושים. יצא טבלת נתונים זו כקובץ .csv. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: רכישת DLIT. (A)לוח הבקרה לרכישה עבור DLIT. בחר זוהר, תצלום, CT, עכבר רגיל-אחד ושכבת-על. הגדרות אחרות זהות ל- 3.4-3.6(איור 3). (B)החלונית אשף ההדמיה. בחר ביו-לומינציהו- DLIT. (C)בחר אורך גל מדידה. בחר את אורך הגל כצחלילית. (D)הגדר את נושא ההדמיה כעכבר,פרמטרי חשיפה כהגדרות אוטומטיות,שדה הראייה כ- C-13.4 ס"מוגובה הנושא כ- 1.5 ס"מ. לאחר מכן לחץ על צילומי הרנטגן יופקו כאשר הם ימרצו. למד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שחזור לוחלוח הכלים שלDLIT. פתחו את טופוגרפיה של משטח על לוח הכלים. בחר הצג. (B)התאמת זיהוי משטח העכבר. התאם את הסף מכיוון שהתצוגה הסגולה מציגה רק את משטח הגוף. בחר את הנושא עכבר עירוםולאחר מכן לחץ על צור משטח. ודא שחלוקה לרמות של העכבר מצוירת במדויק. (C)לוח כלים. פתח את הכרטיסיה מאפייני שחזור תלת-ממדי של DLIT, בחר מאפייני רקמות כרקמת עכבר וכספקטרום מקור כ- Firefly. (D)פתח את הכרטיסיה ניתוח ובחר את הנתונים עבור כל נתוני אורך גל. (E)לחץ על לחצן בנייה מחדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הקרנת ניר. (א)יש להגן על בטנו בנייר אלומיניום כדי למנוע הקרנה של NIR לבטן. (B)הקרנת אור NIR באמצעות לייזר שבו BLI הוא חזק; במקרים מסוימים, לייזר NIR מחולק לכיוונים מרובים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: SDS-PAGE. אישור מוצלח של NZ-1-IR700 מצומד על ג'ל SDS-PAGE (שמאל, כתמים כחולים קולואידיים; ימין, פלואורסצנטיות בערוץ 700 ננומטר). NZ-1 מדולל שימש כשליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9:DLIT. אישור של תאי הגידול המביעים לוציפראז בחלל בית החזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: הדמיית אקס ויוו. אפיון של מודל MPM מופץ pleural 24 שעות לאחר הזרקת NZ-1-IR700 עם BLI. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: אפקט אנטי-טומור של NIR-PIT על דגם מופץ pleural. (A)משטר NIR-PIT ממוקד פודופלנין מוצג בשורה. PODoplanin ממוקד NIR-PIT עם NZ-1-IR700 על מודל מופץ pleural עם גידולים H2373-luc. BLI של המודל המופצה pleural מוצג. (B)בעוד שפעילות לוציפראז שנמדדה עם BLI לא גדלה בקבוצת NIR-PIT, קבוצת הביקורת הראתה עלייה הדרגתית יחד עם גידול. (n ≥ 3 בשתי הקבוצות, t-test). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה הדגמנו שיטה למדידת ההשפעה הטיפולית של NIR-PIT על מודל הפצת הפלורל של MPM. הרג תאים סלקטיבי מאוד בוצע עם NIR-PIT; לכן, הרקמה הרגילה כמעט ולא ניזוקה23,24,25. עם סוג זה של הרג תאים סלקטיביים, NIR-PIT הוכח להיות בטוח בדגמים מופצים9,26. עם זאת, שיטות חלופיות אפשריות בשלבים מסוימים. שיטות שונות דווחו עבור מודל הפצת pleural27,28,29,30. בחרנו את מודל ההזרקה כי זה הליך פשוט כי הוא פחות מעיק לעכברים. השתמשנו BLI כדי למדוד את ההשפעה הטיפולית של NIR-PIT כי אנחנו יכולים להעריך כמותית עם עכברים חיים. לדוגמה, טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT)27 יכולה להיות דרך חלופית להעריך את נפח הגידול של מודל הפצת הפלורל. ניר-פיט עם BLI בדגמים אורתוטופיים אחרים דווח; NIR-PIT יכול לשמש עבור מודל הפצת הבטן, מודל גידול גרורתי מרובה ריאות, וגידול במוח12,26,31,32,33,34,35,36. אפילו מוקדי גידול גרורתיים קטנים ניתן לראות עם BLI, ו- NIR-PIT ניתן לבצע11,12.
תיארנו חלקים מסוימים של הפרוטוקול בהתבסס על ניסויים ראשוניים. ראשית, הזמן מהנהלת נגמ"ש להקרנת ניר. הפרמקוקינטיקה נבדקה מראש באמצעות מודל גידול תת עורי. APC פסגות הגידול 24 שעות לאחר התערבות באמצעות וריד הזנב באמצעות mAb; הקרנת NIR יכולה להתבצע 24 שעות לאחר ניהול הנגמ"ש9,10,11,12. שנית, מינון האור של NIR הנדרש להריגת תאים סרטניים ב- NIR-PIT שונה בהתאם לנוגדן ולקווי תאי היעד, אשר צפוי באמצעות תוצאות מביטה.
למחקר זה יש כמה מגבלות. ראשית, גידולים הופצו באופן נרחב בחלל בית החזה, ולא ניתן היה למדוד במדויק אנרגיה מוקרן של NIR. אורך הגל של אור העירור NIR (שיא ב 690 ננומטר) מאפשר חדירה של לפחות 2-3 אינץ 'לתוך הרקמה37. לכן, במקרה של עכברים, אור NIR מגיע לחלל בית החזה אפילו חיצונית. נכון לעכשיו, התקני לייזר NIR משמשים עבור דגם הפצת pleural העכבר9,10,11,12. עם זאת, בשימוש קליני בפועל, אנו מתכוונים להשתמש סיבים אופטיים מדויקים כדי להקרין את כל החלל התוך-גזעי באמצעות צינור ניקוז בית החזה34. שנית, מינון ההקרנה של NIR מוגבל בהתאם לספציפיות של mAb לאנטיגנים המתבטאים בתאי הגידול. כריכה לא ספציפית של נגמ"ש עלולה לגרום לנזק בלתי צפוי לאיברים.
לסיכום, הצגנו שיטה להערכת ההשפעה הטיפולית של NIR-PIT עם BLI במודל הפצת הפלורל של MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ללא
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L.
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
