Summary
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia terapéutica emergente contra el cáncer que utiliza un conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (IR700Dye) y luz NIR para destruir las células cancerosas. Aquí, presentamos un método para evaluar el efecto antitumoral de NIR-PIT en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural y mesotelioma pleural maligno utilizando imágenes de bioluminiscencia.
Abstract
La eficacia de la fotoinmunoterapia se puede evaluar con mayor precisión con un modelo de ratón ortotópico que con uno subcutáneo. Se puede utilizar un modelo de diseminación pleural para la evaluación de métodos de tratamiento para enfermedades intratorácicas como el cáncer de pulmón o el mesotelioma pleural maligno.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia de tratamiento del cáncer desarrollada recientemente que combina la especificidad de los anticuerpos dirigidos al tumor con la toxicidad causada por un fotoabsorbente (IR700Dye) después de la exposición a la luz NIR. La eficacia de NIR-PIT se ha reportado usando varios anticuerpos; sin embargo, sólo unos pocos informes han demostrado el efecto terapéutico de esta estrategia en un modelo ortotópico. En el presente estudio, demostramos un ejemplo de evaluación de la eficacia del modelo de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT.
Introduction
El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad a pesar de décadas de investigación. Una razón es que la radioterapia y la quimioterapia son técnicas altamente invasivas, lo que puede limitar sus beneficios terapéuticos. Las terapias dirigidas celulares o moleculares, que son técnicas menos invasivas, están recibiendo una mayor atención. La fotoinmunoterapia es un método de tratamiento que mejora sinérgicamente el efecto terapéutico mediante la combinación de inmunoterapia y fototerapia. La inmunoterapia mejora la inmunidad tumoral al aumentar la inmunogenicidad del microambiente tumoral y reducir la supresión inmunorreguladora, lo que resulta en la destrucción de tumores en el cuerpo. La fototerapia destruye los tumores primarios con una combinación de fotosensibilizadores y rayos de luz, y los antígenos específicos del tumor liberados de las células tumorales mejoran la inmunidad tumoral. Los tumores se pueden tratar selectivamente con fotosensibilizadores, ya que son específicos y selectivos para las células diana. La modalidad de fototerapia incluye terapia fotodinámica (PDT), terapia fototérmica (PTT) y terapias basadas en fotoquímica1.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un método recientemente desarrollado de fototerapia antitumoral que combina la terapia basada en fotoquímicos y la inmunoterapia1,2. NIR-PIT es una terapia dirigida molecularmente que se dirige a moléculas específicas de la superficie celular a través de la conjugación de un colorante de ftalocianina de silicio del infrarrojo cercano, IRdye 700DX (IR700), a un anticuerpo monoclonal (mAb). La membrana celular de la célula diana se destruye tras la irradiación con luz NIR (690 nm)3.
El concepto de usar terapia de luz dirigida mediante la combinación de fotosensibilizadores y anticuerpos convencionales o PDT dirigida tiene más de tres décadas de antigüedad4,5. Estudios previos han intentado dirigirse a los agentes PDT convencionales conjudicándolos con anticuerpos. Sin embargo, hubo un éxito limitado porque estos conjugados quedaron atrapados en el hígado, debido a la hidrofobicidad de los fotosensibilizadores6,7. Además, el mecanismo de NIR-PIT es completamente diferente del de la PDT convencional. Los fotosensibilizadores convencionales generan estrés oxidativo que resulta de una conversión de energía que absorbe la energía de la luz, se disloca a un estado excitado, hace la transición al estado fundamental y causa apoptosis. Sin embargo, NIR-PIT causa necrosis rápida al destruir directamente la membrana celular al agregar fotosensibilizadores en la membrana a través de una reacción fotoquímica8. NIR-PIT es superior a la PDT dirigida convencional en muchos sentidos. Los fotosensibilidades convencionales tienen bajos coeficientes de extinción, lo que requiere la unión de un gran número de fotosensibilizadores a una sola molécula de anticuerpo, lo que podría reducir la afinidad de unión. La mayoría de los fotosensibilidades convencionales son hidrófobos, lo que dificulta la unión de los fotosensibilizadores a los anticuerpos sin comprometer su inmunorreactividad o la acumulación de dianas in vivo. Los fotosensibilizadores convencionales suelen absorber la luz en el rango visible, reduciendo la penetración del tejido.
Se han reportado varios estudios sobre NIR-PIT dirigidos a tumores intratorácicos como el cáncer de pulmón y las células del mesotelioma pleural maligno (MPM)9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Sin embargo, solo unos pocos informes han descrito la eficacia de NIR-PIT en MPM diseminada pleural o cáncer de pulmón modelos9,10,11,12. Se cree que los modelos de xenoinjerto tumoral subcutáneo son modelos tumorales estándar y actualmente se utilizan ampliamente para evaluar los efectos antitumorales de las nuevas terapias18. Sin embargo, el microambiente tumoral subcutáneo no es permisivo para el desarrollo de una estructura tisular adecuada o una condición que recapitula adecuadamente un verdadero fenotipo maligno19,20,21,22. Idealmente, se deben establecer modelos de enfermedades ortotópicas para una evaluación más precisa de los efectos antitumorales.
Aquí, demostramos un método de evaluación de la eficacia en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT. Un modelo de ratón de diseminación pleural se genera inyectando células tumorales en la cavidad torácica y se confirma utilizando luminiscencia de luciferasa. El ratón fue tratado con una inyección intravenosa de mAb conjugada con IR700 e irradiación NIR al tórax. El efecto terapéutico se evaluó mediante luminiscencia de luciferasa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos in vivo se realizaron de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de los recursos de animales de laboratorio del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nagoya (aprobación # 2017-29438, # 2018-30096, # 2019-31234, # 2020-20104). Ratones desnudos homocigotos homocigotos de seis semanas de edad fueron comprados y mantenidos en el Centro de Animales de la Universidad de Nagoya. Al realizar el procedimiento en ratones, fueron anestesiados con isoflurano (introducción: 4-5%, mantenimiento 2-3%); la pata fue presionada con pinzas para confirmar la profundidad de la anestesia.
1. Conjugación de IR700 con mAb
- Incubar mAb (1 mg, 6,8 nmol) con éster IR700 NHS (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L en DMSO) en 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) a 15-25 °C durante 1 h.
- Purifique la mezcla usando una columna (por ejemplo, Sephadex). Prepare y lave la columna con PBS. Luego, aplique la mezcla sobre la columna y recoja la gota, que contiene el anticuerpo conjugado IR700 purificado. Este anticuerpo conjugado IR700 se conoce como el conjugado fotosensibilizador de anticuerpos (APC).
- Mida la proteína y la concentración de IR700 en el APC.
- Prepare curvas de calibración para proteínas e IR700 utilizando un espectrofotómetro.
- Mezcle las concentraciones estándar de albúmina con un kit de ensayo de proteínas siguiendo el protocolo del kit (consulte la Tabla de materiales,tinción de proteínas Coomassie Brilliant Blue (CBB)). Mida la absorbancia de la albúmina a una longitud de onda de 595 nm y trace la curva de calibración (una fórmula de aproximación lineal) para la proteína utilizando la siguiente ecuación: y = ax + b (x: concentración, y: absorbancia).
- Obtenga curvas de calibración para IR700 con absorción a 690 nm utilizando el mismo procedimiento. La concentración estándar de IR700 se recomienda a 0.1-5 μM (0.1954-9.77 μg/mL).
- Mida la concentración de proteína y la concentración de IR700 en el APC utilizando una curva de calibración [x = (y-b)/a (x: concentración, y: absorbancia)].
- Determinar el número de colorantes IR700 unidos por mAb con los resultados de la concentración molar.
NOTA: Es importante determinar el número óptimo de conjugación de moléculas IR700 por molécula mAb. En general, aproximadamente tres moléculas IR700 unidas en una sola molécula mAb serían efectivas tanto in vitro como in vivo. Muchos IR700 unidos por anticuerpo (por ejemplo, seis) hacen que sea más fácil quedar atrapado en el hígado durante los experimentos in vivo. La proporción de anticuerpos unidos a IR700 estaba en el rango de 1: 2-1: 4. La proporción de IR700 se redujo, si fue necesario.
- Realizar electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como confirmación de la formación de un APC. Imagine el gel a 700 nm utilizando un imager fluorescente y manche la proteína en el gel utilizando un kit de tinción de proteínas siguiendo el protocolo del kit (consulte la Tabla de materiales,Tinción de proteínas CBB).
2. Generación de un modelo de difusión pleural
- Preparar células diana que expresan luciferasa y suspender 1,0 × 106 células diana en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS)
NOTA: Las células cancerosas intratorácicas como el cáncer de pulmón y MPM son adecuadas como células diana. Las células que expresan luciferasa se prepararon a través de la transfección del gen de la luciferasa, y se confirmó una alta expresión de luciferasa después de > 10 pasajes celulares. Las células se cultivaron en un medio suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). El número de células se ajustó de acuerdo con la tasa de crecimiento del tumor y el curso de tiempo del tratamiento (1.0. × 105-6.0 × 106 células / peso corporal). - Prepare ratones desnudos homocigotos homocigotos hembra de 8-12 semanas de edad, con un peso corporal preferible de 19-21 g.
- Anestesiar ratones durante el procedimiento con isoflurano (introducción: 4-5%, mantenimiento 2-3%); presione la cola con pinzas para confirmar que no hay reacción.
- Haga un tapón con espuma de poliestireno y fije el tapón a la aguja de 30 G para que la punta permanezca a 5 mm para evitar lesiones pulmonares. Doble la punta de la aguja con fórceps limpios o presionándola contra un objeto duro limpiado con 70% de EtOH para evitar el neumotórax(Figura 1).
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no perforarse. Use forrceps para doblar la aguja. No sostenga el tapón cuando lo conecte a la aguja. Es más seguro pegar el tapón antes de llenar las células en la jeringa. - Llene una jeringa (1 ml) con células diana y conecte una aguja de 30 G con un tapón.
- Desinfecte el pecho del animal con 70% de EtOH antes del procedimiento.
- Perfore una aguja en el pecho del ratón a través del espacio intercostal. Debido a la resistencia al golpear contra las costillas en ese momento, la punta de la aguja se movió hacia arriba y hacia abajo. Después de pasar por el espacio intercostal, presione la jeringa contra el ratón e inyecte 100 μL de células diana (Figura 2).
NOTA: El ratón respira profundamente cuando la aguja entra correctamente en la cavidad torácica. Con la flexión de la punta de la aguja, se podría evitar el neumotórax y la inyección inadecuada de células en el pulmón.
NOTA: Se recomienda la punción de la pared torácica derecha para evitar el riesgo de punción de la pared cardíaca. - Enrolle el ratón 2-3 veces para extender las células por toda la cavidad torácica.
- Devuelva el ratón a una jaula limpia y caliente y monitoree hasta que sea ambulatorio. Después del procedimiento, el ratón se despertará de la anestesia y se comportará normalmente.
3. Medición de la bioluminiscencia
NOTA: El software utilizado para la adquisición de datos se enumera en la Tabla de materiales.
- Para confirmar la generación del modelo de diseminación pleural, evalúe las imágenes de bioluminiscencia todos los días después de inyectar las células en la cavidad torácica.
- Anestesiar ratones (paso 2.3) e inyectar por vía intraperitoneal D-luciferina (15 mg/mL, 200 μL).
- Asegúrese de que el ratón está respirando normalmente antes y después de la obtención de imágenes. Use un calentador si es necesario para prevenir la hipotermia durante la anestesia.
- Diez minutos después de la inyección, coloque al ratón en el equipo de medición de imágenes de bioluminiscencia (BLI). Para la adquisición de imágenes, abra el Panel de control de adquisición del software. Seleccione Luminiscente, Fotografíay Superposición (Figura 3).
- Establezca el tiempo de exposición como Automático. Establezca Binning como pequeño.
- Establezca f/stop como 1 para luminiscente y 8 para fotografía; f/stop controla la cantidad de luz recibida por el detector de dispositivos de acoplamiento cargado.
- Establezca el campo de visión como C.
- Una vez que la muestra del ratón esté lista para la obtención de imágenes, haga clic en Adquirir para la adquisición de imágenes. Se seleccionaron ratones con suficiente actividad luciferasa para estudios adicionales.
NOTA: Un modelo de diseminación pleural adecuado muestra una fuerte luminiscencia en el sitio difuso en el tórax cuando se ve desde el lado ventral. Si las imágenes de BLI no se difunden en el tórax, y solo en el sitio de inyección, el tumor puede trasplantarse por vía subcutánea. - Después de mostrar la imagen, establezca el formato de visualización en Radiance. Abra el panel Paleta de herramientas (Figura 4A).
- Seleccione Herramientas de ROI. Recomendamos usar el Círculo para variar el área bioluminiscente en las imágenes.
- Haga clic en Medir ROI para medir la intensidad bioluminiscente de la superficie (Figura 4B).
- Utilice Configurar medición en la esquina izquierda del panel de medición de ROI para seleccionar los valores/información necesarios. Exporte esta tabla de datos como un archivo .csv (Figura 4C).
- Utilice los valores de Flujo Total (p/s) como cuantificación de la intensidad bioluminiscente en el archivo de .csv.
4. Tomografía por imágenes de luminiscencia difusa (DLIT)
NOTA: El software utilizado para la adquisición de datos se enumera en la Tabla de materiales.
- Encienda el botón X-ray Armed.
- Anestesiar a los ratones (paso 2.3) y luego inyectar D-luciferina (15 mg / ml, 200 μL) por vía intraperitoneal en los ratones. Para disparar DLIT continuamente de 3.2 a 3.7, omita este paso.
- Diez minutos después de la inyección, coloque el ratón en el equipo BLI.
- Abra el Panel de control de adquisición del software. Seleccione Luminiscente, Fotografía, CT, Ratón estándary Superposición. Otros ajustes fueron los mismos que en 3.4-3.6(Figura 5A).
- Seleccione el Asistente para imágenes en el Panel de control de adquisición.
- Seleccione Bioluminiscencia y luego DLIT (Figura 5B).
- Seleccione Firefly como la longitud de onda a medir (Figura 5C).
- Establezca el sujeto de imagen como ratón,los parámetros de exposición como configuración automática,el campo de visión como C-13,4 cmy la altura del sujeto como 1,5 cm (Figura 5D).
- Empujar los rayos X se producirá cuando se energize. Adquirir.
- Abra los datos de la imagen secuencial de TC.
- Abra Topografía de superficie en la paleta de herramientas. Seleccione Mostrar (Figura 6A).
- Ajuste el umbral ya que la pantalla púrpura muestra solo la superficie del cuerpo (Figura 6B). A continuación, seleccione el ratón desnudo del sujeto y haga clic en generar superficie. Asegúrese de que el contorno del ratón se dibuja con precisión (Figura 6C).
- Abra la ficha Paleta de herramientas, Propiedades de reconstrucción 3D de DLIT. Seleccione Propiedades del tejido como tejido de ratón y Espectro de fuente como luciérfrica (Figura 6D). A continuación, abra la pestaña Analizar y confirme los datos para cada dato de longitud de onda seleccionado. Finalmente, haga clic en el botón Reconstruir (Figura 6E).
- Confirme la presencia de BLI en la cavidad torácica en la imagen DLIT configurada.
5. NIR-PIT para el modelo de diseminación pleural in vivo
- Mida la dosis de luz del láser de longitud de onda (NIR) de 690 nm con un medidor de potencia y ajuste la salida a 100 mW/cm2.
NOTA: La luz láser es coherente con un tamaño de bobina preciso; por lo tanto, la energía de la luz apenas cambia independientemente de la distancia dentro de los 50 cm. Si hay muchos eventos adversos, como quemaduras, reduzca la salida dentro del rango de 40 mW / cm2. - Limpie la cola con 70% de EtOH e inyecte APC por vía intravenosa (100 μg) a través de la vena de la cola 24 h antes de la irradiación NIR. Aplique presión en el lugar de la inyección para controlar el sangrado.
NOTA: Ajuste el volumen de APC a 50-200 μL para inyección. - Anestesiar a los ratones (paso 2.3) y acostarlos sobre su espalda. Para evitar la irradiación NIR al sitio no objetivo, proteja otros sitios con papel de aluminio(Figura 7A). Irradiar con luz NIR con un láser de 100 J/cm2; si el tumor se disemina de nuevo al vientre, la dosis de irradiación con luz NIR podría dividirse en múltiples direcciones(Figura 7B).
NOTA: Ajuste la dosis a 30-150 J/cm2 dependiendo de los resultados in vitro y eventos adversos como quemaduras. - Cuando la irradiación NIR esté completa y el ratón esté despierto, devuélvalo a la jaula.
- Observe el BLI y mida el ROI a lo largo del tiempo (todos los días) (ver 3.2-3.12).
- Para imágenes ex vivo, eutanasiar ratones con dióxido de carbono 24 h después de la inyección de APC, inmediatamente antes de la irradiación NIR.
- Para observar el interior del pecho del ratón, retire el tórax y corte las costillas y el esternón. Capture la imagen de fluorescencia (700 nm) junto con el control sin administración de APC. Luego, aplique D-luciferina (150 μg / ml) sobre el tórax expuesto, y se tomó el BLI (consulte 3.2-3.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El anticuerpo anti-podoplanina NZ-1 se conjudicó con IR700 para generar NZ-1-IR700. Confirmamos la unión de NZ-1 e IR700 en un SDS-PAGE (Figura 8). La expresión de luciferasa H2373 (H2373-luc) se preparó transfectando células malignas de mesotelioma (H2373) con un gen luciferasa10.
Anestesiamos ratones desnudos homocigómicos hembra de 8-12 semanas de edad e inyectamos 1 × 105 células H2373-luc en la cavidad torácica. El día de la inyección de células tumorales en los ratones se indicó como día 1.
En el día 4, se realizaron BLI y DLIT después de que se inyectó D-luciferina (15 mg / ml, 200 μL) por vía intraperitoneal, y se seleccionaron ratones con suficiente actividad luciferasa en la cavidad torácica para estudios adicionales (Figura 9). Cien microgramos de NZ-1-IR700 (100 μL) se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Al grupo control se le inyectó PBS (100 μL).
En el día 5, dos ratones fueron sacrificados usando asfixia de dióxido de carbono para ex vivo. El ratón inyectado con NZ-1-IR700 mostró actividades altas de fluorescencia IR700 y luciferasa en tumores torácicos, lo que indica que NZ-1-IR700 inyectado por vía intravenosa alcanzó los sitios tumorales pleurales diseminados(Figura 10).
Para la evaluación del efecto de NIR-PIT en el modelo de ratón pleural diseminado, se aplicó la luz NIR a 15 J/cm2 desde dos direcciones (total de 30 J/cm2) a 40 mW/cm2 por vía transcutánea el día 5 (la luz NIR se irradió externamente), seguida de BLI serial. El grupo de control no fue irradiado con luz NIR.
Después del tratamiento de ratones con NIR-PIT, el grupo tratado mostró una disminución de la actividad de la luciferasa. Sin embargo, la unidad de luz relativa en el grupo de control mostró un aumento gradual (*p < 0,05 versus control, prueba t) (Figura 11).
Figura 1: Dispositivo fácil hecho a mano para trasplante de células. Fije el tapón hecho con espuma de poliestireno a la aguja 30G para que la punta permanezca a 5 mm. La punta de la aguja debe doblarse para evitar el neumotórax. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Inyección de células diana en la cavidad torácica. Gire el ratón hacia los lados y perfore la aguja en el ratón hacia el pulmón. Dado que el tapón y la punta de la aguja están doblados, la aguja ingresa a la cavidad torácica sin adherirse a los pulmones. Inyecte células diana mientras presiona la aguja contra el ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Panel de control de adquisición. Seleccione Luminiscente, Fotografíay Superposición. Establezca el tiempo de exposición como automático,el binning como pequeño,f/stop como 1 para luminiscente y 8 para fotografía, y el campo de visión como C. Una vez que la muestra del ratón esté lista para la obtención de imágenes, haga clic en Adquirir para la adquisición de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medición (BLI). (A) Panel Paleta de herramientas. Seleccione Herramientas de ROI. Recomendamos el Círculo para variar el área bioluminiscente en las imágenes. (B) Cuantificación del BLI. Después de seleccionar el ROI en cada imagen, haga clic en Medir ROI para analizar. C)Información sobre cuantificación. Utilice Configurar medición en la esquina izquierda del panel de mediciones de ROI para seleccionar los valores/información necesarios. Exporte esta tabla de datos como .csv archivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Adquisición de DLIT. (A) Panel de control de adquisición para DLIT. Seleccione Luminiscente, Fotografía, CT, Mouse estándaruno y Superposición. Otras configuraciones son las mismas que 3.4-3.6(Figura 3). (B) Panel Asistente para imágenes. Seleccione Bioluminiscenciay DLIT. (C) Seleccione la longitud de onda de medición. Seleccione la longitud de onda como luciérfes. (D) Establezca el sujeto de imagen como ratón,los parámetros de exposición como ajustes automáticos,el campo de visión como C-13,4 cmy la altura del sujeto como 1,5 cm. Luego, haga clic en los rayos X que se producirán cuando se energize. Adquirir. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Reconstrucción de DLIT. (A) Panel Paleta de herramientas. Abra Topografía de superficie en la paleta de herramientas. Seleccione Mostrar. (B) Ajuste del reconocimiento de la superficie del ratón. Ajuste el umbral ya que la pantalla púrpura muestra solo la superficie del cuerpo. Seleccione el asunto Nude Mousey, a continuación, haga clic en generar superficie. Asegúrese de que el contorno del ratón se dibuja con precisión. (C) Paleta de herramientas. Abra la pestaña Propiedades de reconstrucción 3D de DLIT, seleccione Propiedades del tejido como tejido de ratón y Espectro de fuente como luciérfrica. (D) Abra la pestaña Analizar y seleccione los datos para cada dato de longitud de onda. (E) Haga clic en el botón Reconstruir. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Irradiación NIR. (A) Proteja su vientre con papel de aluminio para evitar la irradiación NIR al vientre. (B) Irradiar luz NIR usando láser donde BLI es fuerte; en algunos casos, el láser NIR se divide en múltiples direcciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: SDS-PAGE. Confirmación exitosa de NZ-1-IR700 conjugado en un gel SDS-PAGE (izquierda, tinción azul coloidal; derecha, fluorescencia a 700 nm canal). El NZ-1 diluido sirvió como control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: DLIT. Confirmación de las células tumorales que expresan luciferasa en la cavidad torácica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Imágenes ex vivo. Caracterización del modelo de MPM diseminado pleural 24 h después de la inyección de NZ-1-IR700 con BLI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Efecto antitumoral de NIR-PIT sobre el modelo diseminado pleural. (A) El régimen NIR-PIT dirigido a podoplanina se muestra en una línea. NIR-PIT dirigida a podoplanina con NZ-1-IR700 en modelo diseminado pleural con tumores H2373-luc. Se muestra el BLI del modelo pleural diseminado. (B) Mientras que las actividades de luciferasa medidas con BLI no aumentaron en el grupo NIR-PIT, el grupo de control mostró un aumento gradual junto con el crecimiento tumoral. (n ≥ 3 en ambos grupos, prueba t). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este estudio, demostramos un método para medir el efecto terapéutico de NIR-PIT en el modelo de diseminación pleural de MPM. La muerte celular altamente selectiva se realizó con NIR-PIT; así, el tejido normal apenas se dañó23,24,25. Con este tipo de muerte celular selectiva, se demostró que NIR-PIT es seguro en los modelos diseminados9,26. Sin embargo, los métodos alternativos son posibles en algunos pasos. Se han reportado diversos métodos para el modelo de diseminación pleural27,28,29,30. Seleccionamos el modelo de inyección porque es un procedimiento simple que es menos oneroso para los ratones. Utilizamos BLI para medir el efecto terapéutico de NIR-PIT porque podemos evaluar cuantitativamente con ratones vivos. Por ejemplo, la tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/TC)27 podría ser una forma alternativa de evaluar el volumen tumoral del modelo de diseminación pleural. Se ha notificado NIR-PIT con BLI en otros modelos ortotópicos; NIR-PIT se puede utilizar para el modelo de diseminación abdominal, el modelo de tumor metastásico múltiple de pulmón y el tumor cerebral12,26,31, 32,33,34,35,36. Incluso se pueden observar pequeños focos tumorales metastásicos con BLI, y se puede realizar NIR-PIT11,12.
Describimos algunas partes del protocolo basándonos en experimentos preliminares. Primero, el tiempo desde la administración de APC hasta la irradiación NIR. La farmacocinética se evaluó previamente utilizando un modelo de tumor subcutáneo. PICOS de APC en el tumor 24 h después de la intervención a través de la vena de la cola usando mAb; La irradiación NIR se puede realizar 24 h después de la administración de APC9,10,11,12. En segundo lugar, la dosis de luz NIR requerida para matar las células tumorales en NIR-PIT difiere según el anticuerpo y las líneas celulares objetivo, que se predice utilizando los resultados in vitro.
Este estudio tiene algunas limitaciones. En primer lugar, los tumores estaban ampliamente distribuidos en la cavidad torácica, y la energía irradiada por NIR no se podía medir con precisión. La longitud de onda de la luz de excitación NIR (pico a 690 nm) permite la penetración de al menos 2-3 pulgadas en el tejido37. Por lo tanto, en el caso de los ratones, la luz NIR llega a la cavidad torácica incluso externamente. Actualmente, los dispositivos láser NIR se utilizan para el modelo de diseminación pleural delratón 9,10,11,12. Sin embargo, en el uso clínico real, tenemos la intención de utilizar fibra óptica precisa para irradiar toda la cavidad intratorácica a través del tubo de drenaje torácico34. En segundo lugar, la dosis de irradiación NIR es limitada dependiendo de la especificidad del mAb a los antígenos expresados en las células tumorales. La unión inespecífico de APC podría causar daños inesperados en los órganos.
En conclusión, presentamos un método para evaluar el efecto terapéutico de NIR-PIT con BLI en el modelo de diseminación pleural de MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L. Near-Infrared Photoimmunotherapy of Cancer. Accounts of Chemical Research. 52, 2332-2339 (2019).
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
