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Medicine

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/61593
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Respiratory Medicine, Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Nagoya University Institute for Advanced Research, 3B3-Unit, Advanced Analytical and Diagnostic Imaging Center (AADIC)/Medical Engineering Unit (MEU), Nagoya University Institute for Advanced Research

Summary

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine aufstrebende krebstherapeutische Strategie, die ein Antikörper-Photoabsorber-Konjugat (IR700Dye) und NIR-Licht verwendet, um Krebszellen zu zerstören. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Antitumorwirkung von NIR-PIT in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs und malignes Pleuramesotheliom mittels Biolumineszenzbildgebung zu bewerten.

Abstract

Die Wirksamkeit der Photoimmuntherapie kann mit einem orthotopen Mausmodell genauer beurteilt werden als mit einem subkutanen. Ein Pleuraverbreitungsmodell kann zur Bewertung von Behandlungsmethoden für intrathorakische Erkrankungen wie Lungenkrebs oder malignes Pleuramesotheliom verwendet werden.

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine kürzlich entwickelte Krebsbehandlungsstrategie, die die Spezifität von tumoranvisierenden Antikörpern mit der Toxizität kombiniert, die durch einen Photoabsorber (IR700Dye) nach Exposition gegenüber NIR-Licht verursacht wird. Die Wirksamkeit von NIR-PIT wurde unter Verwendung verschiedener Antikörper berichtet; die therapeutische Wirkung dieser Strategie wurde jedoch nur in wenigen Berichten in einem orthotopischen Modell gezeigt. In der vorliegenden Studie zeigen wir ein Beispiel für die Wirksamkeitsbewertung des pleural disseminierten Lungenkrebsmodells, das mit NIR-PIT behandelt wurde.

Introduction

Krebs bleibt trotz jahrzehntelanger Forschung eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit. Ein Grund dafür ist, dass Strahlentherapie und Chemotherapie hochinvasive Techniken sind, die ihren therapeutischen Nutzen einschränken können. Zell- oder molekular-zielgerichtete Therapien, bei denen es sich um weniger invasive Techniken handelt, erhalten erhöhte Aufmerksamkeit. Die Photoimmuntherapie ist eine Behandlungsmethode, die die therapeutische Wirkung durch die Kombination von Immuntherapie und Phototherapie synergistisch verstärkt. Die Immuntherapie verbessert die Tumorimmunität, indem sie die Immunogenität der Tumormikroumgebung erhöht und die immunregulatorische Unterdrückung reduziert, was zur Zerstörung von Tumoren im Körper führt. Die Phototherapie zerstört Primärtumoren mit einer Kombination aus Photosensibilisatoren und Lichtstrahlen, und tumorspezifische Antigene, die aus den Tumorzellen freigesetzt werden, verbessern die Tumorimmunität. Tumore können selektiv mit Photosensibilisatoren behandelt werden, da sie spezifisch und selektiv für die Zielzellen sind. Die Modalität der Phototherapie umfasst photodynamische Therapie (PDT), photothermische Therapie (PTT) und photochemische Therapien1.

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine kürzlich entwickelte Methode der Antitumor-Phototherapie, die photochemisch basierte Therapie und Immuntherapiekombiniert 1,2. NIR-PIT ist eine molekular zielgerichtete Therapie, die auf spezifische Zelloberflächenmoleküle durch die Konjugation eines Nahinfrarot-Siliziumphthalocyaninfarbstoffs, IRdye 700DX (IR700), zu einem monoklonalen Antikörper (mAb) abzielt. Die Zellmembran der Zielzelle wird bei Bestrahlung mit NIR-Licht (690 nm)zerstört 3.

Das Konzept der gezielten Lichttherapie durch Kombination herkömmlicher Photosensibilisatoren und Antikörper oder gezielter PDT ist über drei Jahrzehnte alt4,5. Frühere Studien haben versucht, konventionelle PDT-Wirkstoffe anzusprechen, indem sie mit Antikörpern konjugiert wurden. Der Erfolg war jedoch begrenzt, da diese Konjugate aufgrund der Hydrophobie der Photosensibilisatoren in der Leber eingeschlossen waren6,7. Darüber hinaus unterscheidet sich der Mechanismus von NIR-PIT völlig von dem der herkömmlichen PDT. Herkömmliche Photosensibilisatoren erzeugen oxidativen Stress, der aus einer Energieumwandlung resultiert, die Lichtenergie absorbiert, in einen angeregten Zustand verrenkt, in den Grundzustand übergeht und Apoptose verursacht. NIR-PIT verursacht jedoch eine schnelle Nekrose, indem es die Zellmembran direkt zerstört, indem Es Photosensibilisatoren auf der Membran durch eine photochemische Reaktion aggregiert8. NIR-PIT ist der herkömmlichen zielgerichteten PDT in vielerlei Hinsicht überlegen. Herkömmliche Photosensibilisatoren haben niedrige Extinktionskoeffizienten, die die Bindung einer großen Anzahl von Photosensibilisatoren an ein einzelnes Antikörpermolekül erfordern, was möglicherweise die Bindungsaffinität verringert. Die meisten herkömmlichen Photosensibilisatoren sind hydrophob, was es schwierig macht, die Photosensibilisatoren an Antikörper zu binden, ohne ihre Immunreaktivität oder In-vivo-Zielakkumulation zu beeinträchtigen. Herkömmliche Photosensibilisatoren absorbieren typischerweise Licht im sichtbaren Bereich und reduzieren die Gewebepenetration.

Mehrere Studien zu NIR-PIT, die auf intrathorakische Tumoren wie Lungenkrebs und maligne Pleuramesotheliomzellen (MPM) abzielen, wurden berichtet9,10,11,12,13,14,15,16,17. Allerdings haben nur wenige Berichte die Wirksamkeit von NIR-PIT in pleural disseminierten MPM- oder Lungenkrebsmodellen9,10,11,12beschrieben. Subkutane Tumor-Xenograft-Modelle gelten als Standard-Tumormodelle und werden derzeit häufig verwendet, um die Antitumoreffekte neuer Therapien zu bewerten18. Die mikroumgebung des subkutanen Tumors ist jedoch nicht freizügig für die Entwicklung einer geeigneten Gewebestruktur oder eines Zustands, der einen echten malignen Phänotyp19, 20,21,22richtig rekapituliert . Idealerweise sollten orthotopische Krankheitsmodelle für eine genauere Beurteilung der Antitumorwirkungen erstellt werden.

Hier demonstrieren wir eine Methode zur Wirksamkeitsbewertung in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs, das mit NIR-PIT behandelt wurde. Ein Pleuraverbreitungsmausbau-Mausmodell wird durch Injektion von Tumorzellen in die Brusthöhle generiert und mittels Luciferase-Lumineszenz bestätigt. Die Maus wurde mit einer intravenösen Injektion von mAb behandelt, konjugiert mit IR700 und NIR-Bestrahlung in die Brust. Die therapeutische Wirkung wurde mittels Luciferase-Lumineszenz evaluiert.

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Protocol

Alle In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortierressourcen des Nagoya University Animal Care and Use Committee durchgeführt (Genehmigung #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Sechs Wochen alte homozygote athymische Nacktmäuse wurden im Animal Center der Nagoya University gekauft und gepflegt. Bei der Durchführung des Verfahrens an Mäusen wurden sie mit Isofluran betäubt (Einführung: 4-5%, Erhaltung 2-3%); die Pfote wurde mit einer Pinzette gedrückt, um die Tiefe der Anästhesie zu bestätigen.

1. Konjugation von IR700 mit mAb

  1. Inkubieren Sie mAb (1 mg, 6,8 nmol) mit IR700 NHS-Ester (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L in DMSO) in 0,1 mol/LNa2HPO4 (pH 8,6) bei 15-25 °C für 1 h.
  2. Reinigen Sie die Mischung mit einer Säule (z. B. Sephadex). Bereiten Sie die Säule vor und waschen Sie sie mit PBS. Tragen Sie dann die Mischung auf die Säule auf und sammeln Sie den Tropfen, der den gereinigten IR700-konjugierten Antikörper enthält. Dieser IR700-konjugierte Antikörper wird als Antikörper-Photosensibilisator-Konjugat (APC) bezeichnet.
  3. Messen Sie die Protein- und IR700-Konzentration im APC.
    1. Erstellen Sie Kalibrierkurven für Protein und IR700 mit einem Spektralphotometer.
    2. Mischen Sie Standardkonzentrationen von Albumin mit einem Protein-Assay-Kit nach dem Kit-Protokoll (siehe Materialtabelle,Coomassie Brilliant Blue (CBB) Proteinfärbung). Messen Sie die Absorption von Albumin bei einer Wellenlänge von 595 nm und zeichnen Sie die Kalibrierkurve (eine lineare Näherungsformel) für das Protein mit der folgenden Gleichung: y = ax + b (x: Konzentration, y: Absorption).
    3. Erhalten Sie Kalibrierkurven für IR700 mit Absorption bei 690 nm mit dem gleichen Verfahren. Die Standardkonzentration von IR700 wird bei 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/ml) empfohlen.
    4. Messen Sie die Proteinkonzentration und die IR700-Konzentration im APC mit einer Kalibrierkurve [x = (y-b)/a (x: Konzentration, y: Absorption)].
    5. Bestimmen Sie die Anzahl der pro mAb gebundenen IR700-Farbstoffe mit den Ergebnissen der molaren Konzentration.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die optimale Konjugationszahl von IR700-Molekülen pro mAb-Molekül zu bestimmen. Im Allgemeinen wären etwa drei IR700-Moleküle, die an ein einzelnes mAb-Molekül gebunden sind, sowohl in vitro als auch in vivowirksam. Viele IR700, die pro Antikörper gebunden sind (z. B. sechs), erleichtern es, während in vivo-Experimenten in der Leber gefangen zu werden. Das Verhältnis der an IR700 gebundenen Antikörper lag im Bereich von 1:2-1:4. Der Anteil an IR700 wurde bei Bedarf reduziert.
  4. Führen Sie eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) als Bestätigung für die Bildung eines APC durch. Stellen Sie das Gel bei 700 nm mit einem fluoreszierenden Imager ab und färben Sie das Protein im Gel mit einem Proteinfärbekit nach dem Kit-Protokoll (siehe Materialtabelle,CBB-Proteinfärbung).

2. Generierung eines Pleura-Verbreitungsmodells

  1. Herstellung von Luciferase-exprimierenden Zielzellen und Suspendierung von 1,0 × 106 Zielzellen in 100 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
    HINWEIS: Intrathorakische Krebszellen wie Lungenkrebs und MPM eignen sich als Zielzellen. Luciferase-exprimierende Zellen wurden über die Luciferase-Gentransfektion hergestellt, und eine hohe Expression von Luciferase wurde nach > 10 Zellpassagen bestätigt. Die Zellen wurden in einem Medium kultiviert, das mit 10% fetalem Rinderserum und Penicillin (100 IE / ml) und Streptomycin (100 mg / ml) ergänzt wurde. Die Anzahl der Zellen wurde entsprechend der Tumorwachstumsrate und dem zeitlichen Verlauf der Behandlung angepasst (1,0. × 105-6,0 × 106 Zellen/Körpergewicht).
  2. Bereiten Sie 8-12 Wochen alte weibliche homozygote athymische Nacktmäuse mit einem bevorzugten Körpergewicht von 19-21 g vor.
  3. Anästhesie von Mäusen während des Eingriffs mit Isofluran (Einführung: 4-5%, Erhaltung 2-3%); Drücken Sie den Schwanz mit einer Pinzette, um zu bestätigen, dass keine Reaktion vorliegt.
  4. Machen Sie einen Stopfen mit Polystyrolschaum und befestigen Sie den Stopfen an der 30 G-Nadel, so dass die Spitze bei 5 mm bleibt, um Lungenverletzungen zu vermeiden. Biegen Sie die Nadelspitze mit einer sauberen Zange oder drücken Sie sie gegen einen harten Gegenstand, der mit 70% EtOH gereinigt wurde, um Pneumothorax zu vermeiden (Abbildung 1).
    ACHTUNG: Achten Sie darauf, sich nicht selbst zu durchbohren. Verwenden Sie eine Zette, um die Nadel zu biegen. Halten Sie den Stopfen nicht gedrückt, wenn Sie ihn an der Nadel befestigen. Es ist sicherer, den Stopfen zu kleben, bevor Sie die Zellen in die Spritze füllen.
  5. Füllen Sie eine Spritze (1 ml) mit Zielzellen und befestigen Sie eine 30G-Nadel mit einem Stopfen.
  6. Desinfizieren Sie die Brust des Tieres vor dem Eingriff mit 70% EtOH.
  7. Stechen Sie eine Nadel durch den Interkostalraum in die Brust der Maus. Aufgrund des Widerstands beim Damaligen Schlagen gegen die Rippen bewegte sich die Nadelspitze auf und ab. Drücken Sie nach dem Passieren des Interkostalraums die Spritze gegen die Maus und injizieren Sie 100 μL Zielzellen (Abbildung 2).
    HINWEIS: Die Maus atmet tief ein, wenn die Nadel richtig in die Brusthöhle eintritt. Mit dem Biegen der Nadelspitze konnten Pneumothorax und eine unsachgemäße Injektion von Zellen in die Lunge vermieden werden.
    HINWEIS: Die Punktion der rechten Brustwand wird empfohlen, um das Risiko einer Herzwandpunktion zu vermeiden.
  8. Rollen Sie die Maus 2-3 mal, um die Zellen in der Brusthöhle zu verteilen.
  9. Bringen Sie die Maus in einen sauberen und warmen Käfig zurück und überwachen Sie bis zum Ambulanz. Nach dem Eingriff wacht die Maus aus der Anästhesie auf und verhält sich normal.

3. Messung der Biolumineszenz

HINWEIS: Die für die Datenerfassung verwendete Software ist in der Materialtabelleaufgeführt.

  1. Um die Generierung des Pleuraverbreitungsmodells zu bestätigen, werten Sie die Biolumineszenzbilder jeden Tag nach der Injektion der Zellen in die Brusthöhle aus.
  2. Mäuse betäuben (Schritt 2.3) und intraperitoneal mit D-Luciferin injizieren (15 mg/ml, 200 μL).
  3. Stellen Sie sicher, dass die Maus vor und nach der Bildgebung normal atmet. Verwenden Sie bei Bedarf eine Heizung, um eine Hypothermie während der Anästhesie zu verhindern.
  4. Zehn Minuten nach der Injektion stellen Sie die Maus in das Biolumineszenz-Bildgebungsgerät (BLI) ein. Für die Bilderfassung öffnen Sie die Erfassungssteuerung der Software. Wählen Sie Luminescent, Photographund Overlay(Abbildung 3) aus.
  5. Stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein. Legen Sie Binning als klein fest.
  6. Stellen Sie f / stop als 1 für Lumineszenz und 8 für Foto ein; f/stop steuert die Lichtmenge, die vom Detektor des geladenen gekoppelten Geräts empfangen wird.
  7. Legen Sie das Sichtfeld auf C fest.
  8. Sobald die Mausprobe für die Bildgebung bereit ist, klicken Sie auf Zur Bilderfassung erfassen. Mäuse mit ausreichender Luciferase-Aktivität wurden für weitere Studien ausgewählt.
    HINWEIS: Ein geeignetes Pleuraverbreitungsmodell zeigt eine starke Lumineszenz an der diffusen Stelle in der Brust, wenn es von der ventralen Seite betrachtet wird. Wenn die BLI-Bilder nicht im Thorax und nur an der Injektionsstelle diffundiert sind, kann der Tumor subkutan transplantiert werden.
  9. Nachdem Sie das Bild angezeigt haben, stellen Sie das Anzeigeformat auf Radianceein. Öffnen Sie das Werkzeugpalettenbedienfeld (Abbildung 4A).
  10. Wählen Sie ROI-Tools. Wir empfehlen, den Kreis zu verwenden, um den biolumineszierenden Bereich auf Bildern zu bereichen.
  11. Klicken Sie auf ROIs messen, um die Biolumineszenzintensität der Oberfläche zu messen (Abbildung 4B).
  12. Verwenden Sie Messung konfigurieren in der linken Ecke des ROI-Messfelds, um die erforderlichen Werte/Informationen auszuwählen. Exportieren Sie diese Datentabelle als .csv Datei (Abbildung 4C).
  13. Verwenden Sie die Werte des Gesamtflusses (p/s) als Quantifizierung der biolumineszierenden Intensität in der .csv Datei.

4. Diffuse Lumineszenz-Bildgebungstomographie (DLIT)

HINWEIS: Die für die Datenerfassung verwendete Software ist in der Materialtabelleaufgeführt.

  1. Aktivieren Sie die Taste X-ray Armed.
  2. Betäuben Sie die Mäuse (Schritt 2.3) und injizieren Sie dann D-Luciferin (15 mg/ml, 200 μL) intraperitoneal in die Mäuse. Um DLIT kontinuierlich von 3.2 bis 3.7 aufzunehmen, überspringen Sie diesen Schritt.
  3. Zehn Minuten nach der Injektion setzen Sie die Maus in das BLI-Gerät.
  4. Öffnen Sie die Erfassungssteuerung der Software. Wählen Sie Luminescent, Photograph, CT, Standard-One Mouseund Overlay. Andere Einstellungen waren die gleichen wie in 3.4-3.6 (Abbildung 5A).
  5. Wählen Sie den Imaging-Assistenten in der Erfassungssteuerung aus.
  6. Wählen Sie Biolumineszenz und dann DLIT (Abbildung 5B).
  7. Wählen Sie Firefly als zu messende Wellenlänge aus (Abbildung 5C).
  8. Stellen Sie das Bildmotiv als Maus, die Belichtungsparameter als Autoeinstellungen, das Sichtfeld als C-13,4 cmund die Motivhöhe auf 1,5 cm ein ( Abbildung5D).
  9. Drücken Sie die Röntgenstrahlen, die erzeugt werden, wenn sie mit Energie versorgt werden. Erwerben.
  10. Öffnen Sie die ct-sequenziellen Bilddaten.
  11. Öffnen Sie Flächentopografie in der Werkzeugpalette. Wählen Sie Anzeigen aus (Abbildung 6A).
  12. Passen Sie den Schwellenwert so an, dass die violette Anzeige nur die Körperoberfläche anzeigt (Abbildung 6B). Wählen Sie dann die Betreffnackmaus aus, und klicken Sie auf Fläche generieren. Stellen Sie sicher, dass der Umriss der Maus genau gezeichnet ist (Abbildung 6C).
  13. Öffnen Sie die Registerkarte Werkzeugpalette, Eigenschaften der DLIT-3D-Rekonstruktion. Wählen Sie Gewebeeigenschaften als Mausgewebe und Quellspektrum als Glühwürmche aus (Abbildung 6D). Öffnen Sie als Nächstes die Registerkarte Analysieren und bestätigen Sie die Daten für jede ausgewählte Wellenlängendaten. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Rekonstruieren (Abbildung 6E).
  14. Bestätigen Sie das Vorhandensein von BLI in der Brusthöhle im konfigurierten DLIT-Bild.

5. NIR-PIT für in vivo Pleuraverbreitungsmodell

  1. Messen Sie die Lichtdosis des NIR-Lasers (690 nm Wellenlänge) mit einem Leistungsmesser und stellen Sie die Leistung auf 100 mW/cm2ein.
    HINWEIS: Das Laserlicht ist kohärent mit einer genauen Spulengröße; somit ändert sich die Lichtenergie kaum unabhängig von der Entfernung innerhalb von 50 cm. Wenn es viele unerwünschte Ereignisse wie Verbrennungen gibt, reduzieren Sie die Leistungim Bereich von 40 mW/cm2 .
  2. Reinigen Sie den Schwanz mit 70% EtOH und injizieren Sie APC (100 μg) intravenös über die Schwanzvene 24 h vor der NIR-Bestrahlung. Drücken Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, um die Blutung zu kontrollieren.
    HINWEIS: Stellen Sie das Volumen des APC für die Injektion auf 50-200 μL ein.
  3. Betäuben Sie die Mäuse (Schritt 2.3) und legen Sie sie auf den Rücken. Um eine NIR-Bestrahlung der Nichtzielstelle zu vermeiden, schirmen Sie andere Stellen mit Aluminiumfolie ab (Abbildung 7A). Bestrahlung mit NIR-Licht mit einem Laser von 100 J/cm2; Wenn der Tumor zurück in den Bauch verteilt wird, könnte die NIR-Lichtbestrahlungsdosis in mehrere Richtungen aufgeteilt werden (Abbildung 7B).
    HINWEIS: Stellen Sie die Dosis auf 30-150 J / cm2 in Abhängigkeit von den In-vitro-Ergebnissen und unerwünschten Ereignissen wie Verbrennungen ein.
  4. Wenn die NIR-Bestrahlung abgeschlossen ist und die Maus wach ist, bringen Sie sie in den Käfig zurück.
  5. Beobachten Sie den BLI und messen Sie den ROI im Zeitverlauf (jeden Tag) (siehe 3.2-3.12).
  6. Für die Ex-vivo-Bildgebung euthanasieren Sie Mäuse mit Kohlendioxid 24 h nach der APC-Injektion, unmittelbar vor der NIR-Bestrahlung.
    1. Um das Innere der Brust der Maus zu beobachten, entfernen Sie den Thorax und schneiden Sie die Rippen und das Brustbein. Erfassen Sie das Fluoreszenzbild (700 nm) zusammen mit der Kontrolle ohne APC-Verabreichung. Dann D-Luciferin (150 μg/ml) über den exponierten Thorax auftragen, und das BLI wurde entnommen (siehe 3.2-3.7).

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Representative Results

Der Anti-Podoplanin-Antikörper NZ-1 wurde mit IR700 konjugiert, um NZ-1-IR700 zu erzeugen. Wir haben die Bindung von NZ-1 und IR700 auf einer SDS-PAGE bestätigt (Abbildung 8). Luciferase-exprimierendes H2373 (H2373-luc) wurde hergestellt, indem maligne Mesotheliomzellen (H2373) mit einem Luciferase-Gen10transfiziert wurden.

Wir betäubten 8-12 Wochen alte weibliche homozygote athymische Nacktmäuse und injizierten 1 × 105 H2373-luc Zellen in die Brusthöhle. Der Tag der Injektion von Tumorzellen in die Mäuse wurde als Tag 1 angegeben.

An Tag 4 wurden BLI und DLIT durchgeführt, nachdem D-Luciferin (15 mg/ml, 200 μL) intraperitoneal injiziert wurde und Mäuse mit ausreichender Luciferase-Aktivität in der Brusthöhle für weitere Studien ausgewählt wurden (Abbildung 9). Hundert Mikrogramm NZ-1-IR700 (100 μL) wurden intravenös über die Schwanzvene injiziert. Der Kontrollgruppe wurde PBS (100 μL) injiziert.

An Tag 5 wurden zwei Mäuse mit Kohlendioxid-Erstickung für ex vivogeopfert. Die NZ-1-IR700 injizierte Maus zeigte sowohl hohe IR700-Fluoreszenz- als auch Luciferase-Aktivitäten in thorakalen Tumoren, was darauf hindeutet, dass intravenös injiziertes NZ-1-IR700 die disseminierten Pleuratumorstellen erreichte (Abbildung 10).

Zur Auswertung der Wirkung von NIR-PIT im pleural disseminierten Mausmodell wurde das NIR-Licht bei 15J/cm2 aus zwei Richtungen (insgesamt 30 J/cm2)bei 40 mW/cm2 transkutan am Tag 5 (das NIR-Licht wurde extern bestrahlt) aufgebracht, gefolgt von seriellem BLI. Die Kontrollgruppe wurde nicht mit NIR-Licht bestrahlt.

Nach der Behandlung von Mäusen mit NIR-PIT zeigte die behandelte Gruppe eine verminderte Luciferase-Aktivität. Die relative Lichteinheit in der Kontrollgruppe zeigte jedoch einen allmählichen Anstieg (*p < 0,05 versus Kontrolle, t-Test)(Abbildung 11).

Figure 1
Abbildung 1: Einfaches handgefertigtes Gerät zur Zelltransplantation. Befestigen Sie den Stopfen aus Polystyrolschaum an der 30G-Nadel, so dass die Spitze bei 5 mm bleibt. Die Spitze der Nadel sollte gebogen werden, um Pneumothorax zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Injektion von Zielzellen in die Brusthöhle. Drehen Sie die Maus zur Seite und stechen Sie die Nadel in die Maus in Richtung Lunge. Da der Stopper und die Nadelspitze gebogen sind, gelangt die Nadel in die Brusthöhle, ohne an der Lunge zu haften. Injizieren Sie Zielzellen, während Sie die Nadel gegen die Maus drücken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3:Bedienfeld für die Erfassung. Wählen Sie Luminescent, Photographund Overlay. Stellen Sie die Belichtungszeit als Auto,Binning als Small,f/stop als 1 für Lumineszenz und 8 für Das Foto und das Sichtfeld als C ein. Sobald die Mausprobe für die Bildgebung bereit ist, klicken Sie auf Zur Bilderfassung erfassen.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Messung (BLI). (A) Werkzeugpalettenbedienfeld. Wählen Sie ROI-Tools aus. Wir empfehlen den Circle, um den biolumineszierenden Bereich auf Bildern zu bereichen. B)BLI-Quantifizierung. Nachdem Sie den ROI in jedem Bild ausgewählt haben, klicken Sie auf Zu analysierende ROIs messen. C)Quantifizierungsinformationen. Verwenden Sie Messung konfigurieren in der linken Ecke des Bedienfelds ROI-Messungen, um die erforderlichen Werte/Informationen auszuwählen. Exportieren Sie diese Datentabelle als .csv Datei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Erwerb von DLIT. (A) Erfassungssteuerungsfeld für DLIT. Wählen Sie Luminescent, Photograph, CT, Standard-One Mouseund Overlayaus. Andere Einstellungen sind die gleichen wie 3.4-3.6 (Abbildung 3). (B) Bedienfeld "Imaging-Assistent". Wählen Sie Biolumineszenzund DLITaus. (C) Wählen Sie die Messwellenlänge. Wählen Sie die Wellenlänge als Glühwürmch . (D) Stellen Sie das Bildmotiv als Maus,die Belichtungsparameter als automatische Einstellungen,das Sichtfeld als C-13,4 cmund die Motivhöhe als 1,5 cm ein. Dann klicken Sie auf die Röntgenstrahlen, die erzeugt werden, wenn sie mit Strom versorgt werden. Erwerben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 6
Abbildung 6: Rekonstruktion von DLIT. (A) Werkzeugpalettenbedienfeld. Öffnen Sie Flächentopografie in der Werkzeugpalette. Wählen Sie Show( (B) Anpassen der Mausoberflächenerkennung. Passen Sie den Schwellenwert so an, dass die violette Anzeige nur die Körperoberfläche anzeigt. Wählen Sie das Betreff Nacktmaus aus,und klicken Sie dann auf Fläche generieren. Stellen Sie sicher, dass der Umriss der Maus genau gezeichnet ist. (C) Werkzeugpalette. Öffnen Sie die Registerkarte Eigenschaften der DLIT-3D-Rekonstruktion, und wählen Sie Gewebeeigenschaften als Mausgewebe und Quellspektrum als Glühwürmcheaus. (D) Öffnen Sie die Registerkarte Analysieren und wählen Sie die Daten für jede Wellenlängendaten aus. (E) Klicken Sie auf die Schaltfläche Rekonstruieren.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7:NIR-Bestrahlung. (A) Schirmen Sie den Bauch mit Aluminiumfolie ab, um eine NIR-Bestrahlung des Bauches zu verhindern. (B) NIR-Licht mit Laser bestrahlen, wenn BLI stark ist; In einigen Fällen ist der NIR-Laser in mehrere Richtungen unterteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: SDS-PAGE. Erfolgreiche Bestätigung des konjugierten NZ-1-IR700 auf einem SDS-PAGE Gel (links, kolloidale blaue Färbung; rechts, Fluoreszenz am 700 nm Kanal). Verdünntes NZ-1 diente als Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: DLIT. Bestätigung der Luciferase-exprimierenden Tumorzellen in der Brusthöhle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: Ex-vivo-Bildgebung. Charakterisierung des pleural disseminierten MPM-Modells 24 h nach NZ-1-IR700 Injektion mit BLI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 11
Abbildung 11: Antitumorwirkung von NIR-PIT auf das pleural disseminierte Modell. (A) Das auf Podoplanin ausgerichtete NIR-PIT-Regime ist in einer Linie dargestellt. Podoplanin-gerichtetes NIR-PIT mit NZ-1-IR700 am pleural disseminierten Modell mit H2373-luc-Tumoren. BLI des pleural disseminierten Modells wird gezeigt. (B) Während die mit BLI gemessenen Luciferase-Aktivitäten in der NIR-PIT-Gruppe nicht zunahmen, zeigte die Kontrollgruppe einen allmählichen Anstieg zusammen mit dem Tumorwachstum. (n ≥ 3 in beiden Gruppen, t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

In dieser Studie demonstrierten wir eine Methode zur Messung der therapeutischen Wirkung von NIR-PIT auf das Pleuraverbreitungsmodell von MPM. Hochselektive Zelltötung wurde mit NIR-PIT durchgeführt; so wurde das normale Gewebe kaum geschädigt23,24,25. Bei dieser Art der selektiven Zelltötung erwies sich NIR-PIT in disseminierten Modellen9,26als sicher. In einigen Schritten sind jedoch alternative Methoden möglich. Für das Pleuraverbreitungsmodell27 , 28,29,30wurden verschiedene Methoden berichtet. Wir haben uns für das Injektionsmodell auserwählen, weil es sich um ein einfaches Verfahren handelt, das für Mäuse am wenigsten belastend ist. Wir haben BLI verwendet, um die therapeutische Wirkung von NIR-PIT zu messen, da wir mit lebenden Mäusen quantitativ bewerten können. Zum Beispiel könnte die Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie (PET/CT)27 eine alternative Möglichkeit sein, das Tumorvolumen des Pleura-Verbreitungsmodells zu bewerten. NIR-PIT mit BLI in anderen orthotopischen Modellen wurde berichtet; NIR-PIT kann für das abdominale Verbreitungsmodell, das Modell des multiplen metastasierten Tumors der Lunge und den Hirntumor12,26,31,32,33,34,35,36verwendet werden. Selbst kleine metastatische Tumorherde können mit BLI beobachtet werden, und NIR-PIT kann durchgeführt werden11,12.

Wir haben einige Teile des Protokolls basierend auf vorläufigen Experimenten beschrieben. Erstens, die Zeit von der APC-Verabreichung bis zur NIR-Bestrahlung. Die Pharmakokinetik wurde im Vorfeld anhand eines subkutanen Tumormodells evaluiert. APC-Peaks im Tumor 24 h nach Intervention über die Schwanzvene mit mAb; Die NIR-Bestrahlung kann 24 h nach der APC-Verabreichung durchgeführt werden9,10,11,12. Zweitens unterscheidet sich die NIR-Lichtdosis, die für die Abtötung von Tumorzellen in NIR-PIT erforderlich ist, je nach Antikörper- und Zielzelllinien, was anhand der In-vitro-Ergebnisse vorhergesagt wird.

Diese Studie hat einige Einschränkungen. Erstens waren Tumore in der Brusthöhle weit verteilt, und NIR-bestrahlte Energie konnte nicht genau gemessen werden. Die Wellenlänge des NIR-Anregungslichts (Peak bei 690 nm) ermöglicht das Eindringen von mindestens 2-3 Zoll in das Gewebe37. Daher erreicht NIR-Licht bei Mäusen die Brusthöhle auch äußerlich. Derzeit werden NIR-Lasergeräte für die Maus Pleuraverbreitungsmodell9,10,11,12verwendet. Im klinischen Einsatz beabsichtigen wir jedoch, mit präziser Faseroptik die gesamte intrathorakale Höhle über das Thoraxdrainagerohr34zu bestrahlen. Zweitens ist die NIR-Bestrahlungsdosis in Abhängigkeit von der Spezifität des mAb auf Antigene, die auf Tumorzellen exprimiert werden, begrenzt. Eine unspezifische Bindung von APC kann zu unerwarteten Organschäden führen.

Abschließend stellten wir eine Methode zur Bewertung der therapeutischen Wirkung von NIR-PIT mit BLI im Pleuraverbreitungsmodell von MPM vor.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Nichts

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red Wako 209-016941 for cell culture
1mL syringe TERUMO SS-01T for mice experiment
30G needle Nipro 1907613 for mice experiment
BALB/cSlc-nu/nu Japan SLC
Collidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025 use for gel protein staining
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200 for measuring the APC concentration
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Wako 043-07216 use for conjugation of IR700
D-Luciferin (potassium salt) Cayman Chemical 14681 for bioluminescence imaging and DLIT
GraphPad Prism7 GraphPad software for statistical analysis
Image Studio Li-Cor Biosciences for analyzing 700 nm fluorescent image
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
isoflurane Wako 095-06573 for mice anesthesia
IVIS Spectrum CT PerkinElmer for capturing bioluminescent image and DLIT
Living Image PerkinElmer for analyzing bioluminescent image and DLIT
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763 use for conjugation of IR700
NIR Laser Changchun New Industries Optoelectronics Technology MRL-III-690R for NIR irradiation
Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well Invitrogen XP04202BOX use for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) Invitrogen NP0007 use for SDS-PAGE
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100 for measuring the output of the NIR laser 
PBS(-) Wako 166-23555
Pearl Trilogy imaging system Li-Cor Biosciences for capturing 700 nm fluorecent image
Penicilin-Streptomycin Solution (x100) Wako 168-23191 for cell culture
Puromycin Dihydrochloride ThermoFisher A1113803 for luciferase transfection
RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles PerkinElmer CLS960002 for luciferase transfection
RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red Wako 189-02025 for cell culture
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01 use for conjugation of IR700
UV-1900i Shimadzu for measuring the APC concentration

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References

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Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung
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Yasui, H., Nishinaga, Y., Taki, S.,… More

Yasui, H., Nishinaga, Y., Taki, S., Takahashi, K., Isobe, Y., Sato, K. Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination. J. Vis. Exp. (168), e61593, doi:10.3791/61593 (2021).

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