Summary
Nær-infrarød fotoimmunotherapy (NIR-PIT) er en spirende kræft terapeutisk strategi, der udnytter et antistof-photoabsorber (IR700Dye) konjugat og NIR lys til at ødelægge kræftceller. Her præsenterer vi en metode til at evaluere antitumoreffekten af NIR-PIT i en musemodel af pleuralformidlet lungekræft og ondartet lungehindekræft ved hjælp af bioluminescensbilleddannelse.
Abstract
Effekten af fotoimmunoterapi kan evalueres mere præcist med en ortotopisk musemodel end med en subkutan. En pleural formidlingsmodel kan anvendes til evaluering af behandlingsmetoder for intrathoraciske sygdomme som lungekræft eller ondartet lungehindekræft.
Nær-infrarød fotoimmunotherapy (NIR-PIT) er en nyligt udviklet kræftbehandling strategi, der kombinerer specificiteten af tumor-målretning antistoffer med toksicitet forårsaget af en photoabsorber (IR700Dye) efter eksponering for NIR lys. Effekten af NIR-PIT er blevet rapporteret ved hjælp af forskellige antistoffer; Men kun få rapporter har vist den terapeutiske virkning af denne strategi i en ortotopisk model. I denne undersøgelse viser vi et eksempel på effektevaluering af den pleuralformidlet lungekræftmodel, som blev behandlet ved hjælp af NIR-PIT.
Introduction
Kræft er fortsat en af de førende årsager til dødelighed på trods af årtiers forskning. En af grundene er, at strålebehandling og kemoterapi er meget invasive teknikker, som kan begrænse deres terapeutiske fordele. Cellulære- eller molekylære-målrettede behandlinger, som er mindre invasive teknikker, får øget opmærksomhed. Fotoimmunoterapi er en behandlingsmetode, der synergistisk forbedrer den terapeutiske virkning ved at kombinere immunterapi og lysbehandling. Immunterapi øger tumorimmunitet ved at øge immunogeniciteten af tumormikromiljøet og reducere immunreguleringsundertrykkelse, hvilket resulterer i ødelæggelse af tumorer i kroppen. Lysbehandling ødelægger primære tumorer med en kombination af photosensitizers og lysstråler, og tumor-specifikke antigener frigivet fra tumorceller øge tumor immunitet. Tumorer kan selektivt behandles ved hjælp af photosensitizers, da de er specifikke og selektive for målcellerne. Lysterapiens modalitet omfatter fotodynamisk terapi (PDT), fototermisk terapi (PTT) og fotokemibaserede behandlinger1.
Nær-infrarød fotoimmunoterapi (NIR-PIT) er en nyligt udviklet metode til antitumor lysbehandling, der kombinerer fotokemisk-baseret terapi og immunterapi1,2. NIR-PIT er en molekylært målrettet behandling, der er rettet mod specifikke celleoverflademolekyler gennem bøjning af et nær-infrarødt siliciumphthalocyaninfarvestof, IRdye 700DX (IR700), til et monoklonalt antistof (mAb). Målcellens cellemembran ødelægges ved bestråling med NIR-lys (690 nm)3.
Konceptet med at bruge målrettet lysterapi ved at kombinere konventionelle fotoensibilisatorer og antistoffer eller målrettet PDT er over tre årtier gammel4,5. Tidligere undersøgelser har forsøgt at målrette konventionelle PDT-midler ved at konjugatere dem til antistoffer. Der var dog begrænset succes, fordi disse konjugates blev fanget i leveren på grund af hydrofobicity af photosensitizers6,7. Desuden er NIR-PIT's mekanisme helt forskellig fra den konventionelle PDT's. Konventionelle photosensitizers generere oxidativ stress, der skyldes en energi konvertering, der absorberer lys energi, forvredes til en ophidset tilstand, overgange til jorden tilstand, og forårsager apoptose. Men NIR-PIT forårsager hurtig nekrose ved direkte at ødelægge cellemembranen ved at aggregere photosensitizers på membranen gennem en fotokemisk reaktion8. NIR-PIT er bedre end konventionelle målrettede PDT på mange måder. Konventionelle fotoensibilisatorer har lave udryddelseskoefficienter, der kræver fastgørelse af et stort antal photosensitizers til et enkelt antistofmolekyle, hvilket potentielt reducerer bindende affinitet. De fleste konventionelle fotoensibilisatorer er hydrofobiske, hvilket gør det vanskeligt at binde photosensitizers til antistoffer uden at kompromittere deres immunreaktivitet eller in vivo målakkumulering. Konventionelle fotoensibilisatorer absorberer typisk lys i det synlige område, hvilket reducerer vævspenetration.
Flere undersøgelser af NIR-PIT rettet mod intrathoraciske tumorer som lungekræft og maligne pleuralmesotheliomceller (MPM) er blevet rapporteret9,10,11,12,13,14,15,16,17. Det er dog kun nogle få rapporter , der har beskrevet effekten af NIR-PIT i pleuralformidlet MPM - eller lungekræftmodellerne9,10,11,12. Subkutane tumor xenograft modeller menes at være standard tumor modeller og er i øjeblikket meget udbredt til at evaluere antitumor virkninger af nye behandlinger18. Det subkutane tumormikromiljø er dog ikke eftergivende for udviklingen af en passende vævsstruktur eller en tilstand, der korrekt opsummerer en ægte ondartet fænotype19,20,21,22. Ideelt set bør ortotopiske sygdomsmodeller etableres for en mere præcis vurdering af antitumoreffekterne.
Her demonstrerer vi en metode til effektevaluering i en musemodel af pleuralformidlet lungekræft, som blev behandlet ved hjælp af NIR-PIT. En pleural formidling mus model genereres ved at injicere tumorceller i brysthulen og bekræftet ved hjælp af luciferase luminescens. Musen blev behandlet med en intravenøs injektion af mAb konjugeret med IR700 og NIR bestråling til brystet. Den terapeutiske virkning blev evalueret ved hjælp af luciferase luminescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo-eksperimenter blev udført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyrressourcer i Nagoya University Animal Care and Use Committee (godkendelse # 2017-29438, # 2018-30096, # 2019-31234, # 2020-20104). Seks uger gamle homozygote athymic nøgen mus blev købt og vedligeholdt på Animal Center of Nagoya University. Ved udførelse af proceduren hos mus blev de bedøvet med isofluran (indledning: 4-5%, vedligeholdelse 2-3%); poten blev presset med pincet for at bekræfte dybden af anæstesi.
1. Bøjning af IR700 med mAb
- Inkuber mAb (1 mg, 6,8 nmol) med IR700 NHS ester (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L i DMSO) i 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) ved 15-25 °C i 1 time.
- Rense blandingen ved hjælp af en kolonne (f.eks. Sephadex). Forbered og vask kolonnen med PBS. Derefter påføres blandingen på kolonnen og opsamle dråben, som indeholder det rensede IR700-konjugerede antistof. Dette IR700-konjugeret antistof kaldes antistoffotoensitizerkonjugat (APC).
- Mål protein- og IR700-koncentrationen i APC.
- Forbered kalibreringskurver for protein og IR700 ved hjælp af et spektrofotometer.
- Bland standardkoncentrationer af albumin med et protein assay kit efter kit protokollen (se Tabel af materialer, Coomassie Brilliant Blue (CBB) protein farvning). Mål absorbansen af albumin ved 595 nm bølgelængde, og plot kalibreringskurven (en lineær tilnærmelsesformel) for proteinet ved hjælp af følgende ligning: y = økse + b (x: koncentration, y: absorbans).
- Opnå kalibreringskurver for IR700 med absorption ved 690 nm ved hjælp af samme procedure. Standardkoncentrationen af IR700 anbefales ved 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/mL).
- Proteinkoncentrationen og koncentrationen af IR700 i APC ved hjælp af en kalibreringskurve [x = (y-b)/a (x: koncentration, y: absorbans)].
- Bestem antallet af IR700 farvestoffer bundet pr mAb med resultaterne af molarkoncentrationen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bestemme det optimale bøjningsantal af IR700-molekyler pr. mAb-molekyle. Generelt ville ca. tre IR700 molekyler bundet på et enkelt mAb-molekyle være effektive både in vitro og in vivo. Mange IR700 bundet pr antistof (f.eks seks) gør det lettere at blive fanget i leveren under in vivo eksperimenter. Forholdet mellem antistof bundet til IR700 var i intervallet 1:2-1:4. Andelen af IR700 blev om nødvendigt reduceret.
- Udfør natrium dodecyl sulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) som en bekræftelse for dannelsen af en APC. Billede gelen ved 700 nm ved hjælp af en fluorescerende imager, og plette proteinet i gelen ved hjælp af et protein farvning kit efter kit protokollen (se Tabel over materialer, CBB protein farvning).
2. Generering af en pleural formidlingsmodel
- Forberede luciferase-udtrykke målceller og suspendere 1,0 × 106 målceller i 100 μL af fosfat-buffered saltvand (PBS)
BEMÆRK: Intrathoracic kræftceller såsom lungekræft og MPM er egnede som målceller. Luciferase-udtrykkende celler blev udarbejdet via luciferase gentransfection, og højt udtryk for luciferase blev bekræftet efter > 10 celle passager. Cellerne blev kultiveret i et medium suppleret med 10 % føtalt kvægserum og penicillin (100 IE/mL) og streptomycin (100 mg/mL). Antallet af celler blev justeret i henhold til tumorvækstraten og behandlingsforløbet (1,0. × 105-6,0 × 106 celler /kropsvægt). - Forbered 8-12 uger gamle kvindelige homozygote athymiske nøgenmus med en at foretrække kropsvægt på 19-21 g.
- Bedøve mus under proceduren med isofluran (indledning: 4-5%, vedligeholdelse 2-3%); tryk på halen med pincet for at bekræfte, at der ikke er nogen reaktion.
- Lav en prop med polystyren skum og fastgør proppen til 30 G nål, så spidsen forbliver på 5 mm for at forhindre lungeskader. Bøj nålespidsen med rene sammenkædning eller ved at trykke den mod en hård genstand, der rengøres med 70 % EtOH for at undgå pneumothorax (Figur 1).
FORSIGTIG: Pas på ikke at gennembore sig selv. Brug sammentak til at bøje nålen. Hold ikke proppen, når den fastgøres til nålen. Det er sikrere at holde proppen, før du fylder cellerne i sprøjten. - Fyld en sprøjte (1 mL) med målceller, og fastgør en 30G nål med en prop.
- Desinficer dyrets bryst med 70% EtOH før proceduren.
- Pierce en nål ind i brystet af musen gennem intercostal rummet. På grund af modstanden, mens han ramte mod ribbenene på det tidspunkt, bevægede nålespidsen sig op og ned. Når du har passeret gennem det interkostalale rum, skal du trykke sprøjten mod musen og injicere 100 μL målceller (Figur 2).
BEMÆRK: Musen trækker vejret dybt, når nålen kommer ordentligt ind i brysthulen. Ved bøjning af nålespidsen kan pneumothorax og uhensigtsmæssig injektion af celler i lungen undgås.
BEMÆRK: Det anbefales at punktere højre brystvæg for at undgå risikoen for punktering af hjertevæggen. - Rul musen 2-3 gange for at sprede cellerne i hele brysthulen.
- Returner musen til et rent og varmt bur og overvåge indtil ambulant. Efter proceduren vil musen vågne op fra anæstesi og opføre sig normalt.
3. Måling af bioluminescens
BEMÆRK: Den software, der bruges til dataindsamling, er angivet i materialetabellen.
- For at bekræfte dannelsen af pleural formidlingsmodellen skal du evaluere bioluminescensbillederne hver dag efter injektion af cellerne i brysthulen.
- Bedøve mus (trin 2.3) og injicere intraperitonealt med D-luciferin (15 mg/mL, 200 μL).
- Sørg for, at musen trækker vejret normalt før og efter billeddannelse. Brug en varmelegeme, hvis det er nødvendigt for at forhindre hypotermi under anæstesi.
- Ti minutter efter injektionen skal du indstille musen i BLI-måleudstyret (bioluminescensbilleddannelse). Hvis du vil have afbildninger, skal du åbne softwarens anskaffelsespanel. Vælg Selvlysende, Fotografiog Overlejring (Figur 3).
- Angiv eksponeringstiden som Automatisk. Angiv placering som lille.
- Sæt f/stop som 1 for selvlysende og 8 til fotografering; f/stop styrer mængden af lys, som den ladede enhedsdetektor modtager.
- Angiv feltet for visning som C.
- Når museeksemplet er klar til billedbehandling, skal du klikke på Hent til billedbehandling. Mus med tilstrækkelig luciferaseaktivitet blev udvalgt til yderligere undersøgelser.
BEMÆRK: En egnet pleural formidlingsmodel viser stærk luminescens på det diffuse sted i brystet, når den ses fra ventralsiden. Hvis BLI-billederne ikke spredes i brystkassen, og kun på injektionsstedet, tumoren kan transplanteres subkutant. - Når du har vist billedet, skal du indstille visningsformatet til Radiance. Åbn panelet Værktøjspalette (Figur 4A).
- Vælg INVESTERINGSAFKASTværktøjer. Vi anbefaler, at du bruger Circle til at rangere det bioluminescerende område på billeder.
- Klik på Mål ROI'er for at måle overfladens bioluminescerende intensitet (Figur 4B).
- Brug Konfigurer måling i venstre hjørne af investeringsafkastepanelet til at vælge de nødvendige værdier/oplysninger. Eksporter denne datatabel som en .csv fil (Figur 4C).
- Brug værdierne i Total Flux (p/s) som den bioluminescerende intensitet kvantificering i .csv-filen.
4. Diffus luminescensbilleddannelsestomografi (DLIT)
BEMÆRK: Den software, der bruges til dataindsamling, er angivet i materialetabellen.
- Tænd knappen X-ray Armed.
- Bedøve musene (trin 2.3) og derefter injicere D-luciferin (15 mg/mL, 200 μL) intraperitoneally i musene. Hvis du vil skyde DLIT kontinuerligt fra 3,2 til 3,7, skal du springe dette trin over.
- Ti minutter efter injektionen skal musen indstilles i BLI-udstyret.
- Åbn softwarens anskaffelses kontrolpanel. Vælg Selvlysende, Fotografi, CT, Standard-One Mouseog Overlay. Andre indstillinger var de samme som i 3,4-3,6 (figur 5A).
- Vælg guiden Imaging i Kontrolpanel til anskaffelse.
- Vælg Bioluminescens og derefter DLIT (Figur 5B).
- Vælg Firefly som bølgelængde til måling (Figur 5C).
- Angiv billedmotivet som mus, Eksponeringsparametresom automatiske indstillinger , Visningsfelt som C-13,4 cmog Emnehøjde som 1,5 cm ( Figur5D).
- Tryk på røntgenstrålerne vil blive produceret, når energi. Hent.
- Åbn CT-sekventielle billeddata.
- Åbn Surface-topografi på værktøjspaletten. Vælg Vis (Figur 6A).
- Juster tærsklen, da den lilla skærm kun viser kroppens overflade (Figur 6B). Vælg derefter den nøgne emnemus, og klik på Generer Surface. Sørg for, at musens kontur er nøjagtigt tegnet (Figur 6C).
- Åbn fanen Værktøjspalette, DLIT 3D-rekonstruktionsegenskaber. Vælg vævsegenskaber som musevæv og kildespektrum som firefly (figur 6D). Åbn derefter fanen Analyser, og bekræft dataene for hver valgt bølgelængdedata. Klik til sidst på knappen Rekonstruer (Figur 6E).
- Bekræft tilstedeværelsen af BLI i brysthulen i det konfigurerede DLIT-billede.
5. NIR-PIT for in vivo pleural formidlingsmodel
- Mål lysdosis af 690 nm bølgelængde (NIR) laser med en effektmåler, og juster udgangen til 100 mW/cm2.
BEMÆRK: Laserlyset er i overensstemmelse med en præcis spolestørrelse; således ændrer lysenergien sig næppe uanset afstanden inden for 50 cm. Hvis der er mange bivirkninger, såsom forbrændinger, reducere produktionen inden for intervallet 40 mW/cm2. - Rengør halen med 70% EtOH og intravenøst injicere APC (100 μg) via halevenen 24 timer før NIR bestråling. Tryk på injektionsstedet for at kontrollere blødningen.
BEMÆRK: Juster lydstyrken på APC til 50-200 μL til injektion. - Bedøve musene (trin 2.3) og læg dem på ryggen. For at undgå NIR-bestråling til det ikke-målsted skal du beskytte andre steder med aluminiumsfolie (figur 7A). Bestråle med NIR-lys med en laser på 100 J/cm2; hvis tumoren spredes tilbage til maven, kan NIR-lys bestrålingsdosis opdeles i flere retninger (Figur 7B).
BEMÆRK: Juster dosis ved 30-150 J/cm2 afhængigt af in vitro-resultaterne og bivirkninger såsom forbrændinger. - Når NIR-bestrålingen er færdig, og musen er vågen, skal den returneres til buret.
- Overhold BLI og mål investeringsafkast over tid (hver dag) (se 3.2-3.12).
- Ved ex vivobilleddannelse aflives mus med kuldioxid 24 timer efter APC-injektionen umiddelbart før NIR-bestrålingen.
- For at observere indersiden af musens bryst, fjern brystkassen og skær ribbenene og brystbenet. Fang fluorescensbilledet (700 nm) ved siden af styringen uden APC-administration. Derefter påføres D-luciferin (150 μg/mL) over den eksponerede brystkasse, og BLI blev taget (se 3.2-3.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-podoplanin antistof NZ-1 blev konjugeret med IR700 til at generere NZ-1-IR700. Vi bekræftede bindingen af NZ-1 og IR700 på en SDS-PAGE (figur 8). Luciferase-udtrykke H2373 (H2373-luc) blev udarbejdet ved transfecting maligne lungehindekræft celler (H2373) med en luciferase gen10.
Vi bedøvede 8-12 uger gamle kvindelige homozygote athymiske nøgenmus og injicerede 1 × 105 H2373-luc celler i brysthulen. Dagen for injektion af tumorceller i musene blev angivet som dag 1.
På dag 4 blev BLI og DLIT udført, efter at D-luciferin (15 mg/mL, 200 μL) blev injiceret intraperitonealt, og mus med tilstrækkelig luciferaseaktivitet i brysthulen blev udvalgt til yderligere undersøgelser (Figur 9). Hundrede mikrogram NZ-1-IR700 (100 μL) blev intravenøst injiceret via halevenen. Kontrolgruppen blev injiceret med PBS (100 μL).
På dag 5 blev to mus ofret ved hjælp af kuldioxid kvælning til ex vivo. Den injicerede mus NZ-1-IR700 viste både høj IR700 fluorescens og luciferaseaktiviteter i thoraxtumorer, hvilket indikerer, at intravenøst injicerede NZ-1-IR700 nåede de formidlede pleuraltumorsteder (Figur 10).
Til evaluering af NIR-PIT's virkning i den pleuralformidlet musemodel blev NIR-lyset anvendt ved 15 J/cm2 fra to retninger (i alt 30 J/cm2) ved 40 mW/cm2 transkutant på dag 5 (NIR-lyset blev bestrålet eksternt), efterfulgt af seriel BLI. Kontrolgruppen blev ikke bestrålet med NIR-lys.
Efter behandling af mus med NIR-PIT viste den behandlede gruppe nedsat luciferaseaktivitet. Den relative lysenhed i kontrolgruppen viste imidlertid en gradvis stigning (*p < 0,05 i forhold til kontrol, t-test) (figur 11).
Figur 1: Nem håndlavet anordning til celletransplantation. Fastgør proppen lavet med polystyren skum til 30G nål, så spidsen forbliver på 5 mm. Spidsen af nålen skal bøjes for at undgå pneumothorax. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Injektion af målceller i brysthulen. Drej musen sidelæns og gennembore nålen i musen mod lungen. Da proppen og nålespidsen er bøjet, kommer nålen ind i brysthulen uden at klæbe til lungerne. Indsprøjt målceller, mens du trykker nålen mod musen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kontrolpanel for anskaffelse. Vælg Selvlysende, Fotografiog Overlejring. Angiv eksponeringstid som auto, binning som lille, f/stop som 1 for selvlysende og 8 til fotografi og synsfelt som C. Når museeksemplet er klar til billedbehandling, skal du klikke på Hent til billedbehandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Måling (BLI). (A) Værktøjspalettepanel. Vælg INVESTERINGSAFKASTværktøjer. Vi anbefaler Circle at rangere det bioluminescerende område på billeder. (B) BLI kvantificering. Når du har valgt investeringsafkast i hvert billede, skal du klikke på Måler investeringsafkast for at analysere. (C) Kvantificeringsoplysninger. Brug Konfigurer måling i venstre hjørne af panelet Investeringsafkast til at vælge de nødvendige værdier/oplysninger. Eksporter denne datatabel som .csv fil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Erhvervelse af DLIT. (A) Anskaffelses kontrolpanel til DLIT. Vælg Selvlysende, Fotografi, CT, Standard-One Mouseog Overlay. Andre indstillinger er de samme som 3,4-3,6 (Figur 3). (B) Guiden Billedbehandling. Vælg Bioluminescensog DLIT. (C) Vælg målebølgelængde. Vælg bølgelængden som ildflue. (D) Angiv billedemnet som mus, eksponeringsparametre som automatiske indstillinger, visningsfelt som C-13,4 cmog Emnehøjde som 1,5 cm. Klik derefter på røntgenbillederne vil blive produceret, når energi. Erhverve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Rekonstruktion af DLIT. (A) Værktøjspalettepanel. Åbn Surface-topografi på værktøjspaletten. Vælg Vis. (B) Justering af museoverfladegenkendelse. Juster tærsklen, da den lilla skærm kun viser kroppens overflade. Vælg emnet Nøgen mus, og klik derefter på Generer Surface. Sørg for, at musens kontur er nøjagtigt tegnet. (C) Værktøjspalette. Åbn fanen DLIT 3D-rekonstruktionsegenskaber, vælg Vævsegenskaber som musevæv og kildespektrum som Firefly. (D) Åbn fanen Analyser , og vælg dataene for hver bølgelængdedata. (E) Klik på knappen Rekonstruer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: NIR bestråling. (A) Beskyt maven med aluminiumsfolie for at forhindre NIR bestråling til mave. (B) Irradiate NIR-lys ved hjælp af laser, hvor BLI er stærk I nogle tilfælde er NIR laser opdelt i flere retninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: SDS-PAGE. Vellykket bekræftelse af konjugeret NZ-1-IR700 på en SDS-PAGE gel (venstre, kolloid blå farvning, højre, fluorescens ved 700 nm kanal). Fortyndet NZ-1 tjente som kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: DLIT. Bekræftelse af de luciferase-udtrykkende tumorceller i brysthulen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Ex vivobilleddannelse. Karakterisering af pleuralformidlet MPM model 24 timer efter NZ-1-IR700 injektion med BLI. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Nir-PIT's antitumoreffekt på pleuralformidlet model. (A) Det podoplanin-målrettede NIR-PIT-regime vises i en linje. Podoplanin-målrettet NIR-PIT med NZ-1-IR700 på pleural formidlet model med H2373-luc tumorer. BLI af pleural formidles model er vist. (B) Mens luciferase aktiviteter målt med BLI ikke steg i NIR-PIT-gruppen, kontrolgruppen viste en gradvis stigning sammen med tumorvækst. (n ≥ 3 i begge grupper, t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse demonstrerede vi en metode til måling af NIR-PIT's terapeutiske virkning på den pleurale formidlingsmodel af MPM. Meget selektiv celledrab blev udført med NIR-PIT; således blev det normale væv næppe beskadiget23,24,25. Med denne type selektiv celleaflivning blev NIR-PIT påvist at være sikker i formidlede modeller9,26. Alternative metoder er dog mulige i nogle trin. Der er rapporteret om forskellige metoder til den pleurale formidlingsmodel27,28,29,30. Vi valgte injektionsmodellen, fordi det er en simpel procedure, der er mindst byrdefuld for mus. Vi brugte BLI til at måle den terapeutiske virkning af NIR-PIT, fordi vi kan evaluere kvantitativt med levende mus. For eksempel, positron emission tomografi / computertomografi (PET / CT)27 kunne være en alternativ måde at evaluere tumor volumen af pleural formidling model. NIR-PIT med BLI i andre ortotopiske modeller er blevet rapporteret; NIR-PIT kan bruges til abdominal formidling model, lunge flere metastatiske tumor model, og hjernesvulst12,26,31,32,33,34,35,36. Selv små metastatiske tumor foci kan observeres med BLI, og NIR-PIT kan udføres11,12.
Vi beskrev nogle dele af protokollen baseret på indledende eksperimenter. For det første tiden fra APC-administration til NIR-bestråling. De farmakokinetik blev evalueret på forhånd ved hjælp af en subkutan tumor model. APC toppe i tumoren 24 timer efter intervention via hale venen ved hjælp af mAb; NIR-bestråling kan udføres 24 timer efter APC-administrationen9,10,11,12. For det andet adskiller NIR-lysdosis, der kræves til aflivning af tumorceller i NIR-PIT, afhængigt af antistoffet og målcellelinjerne, som forudsiges ved hjælp af in vitro-resultaterne.
Denne undersøgelse har et par begrænsninger. For det første blev tumorer udbredt i brysthulen, og NIR-bestrålet energi kunne ikke måles præcist. Bølgelængden af NIR excitation lys (peak ved 690 nm) tillader penetration af mindst 2-3 inches i vævet37. Derfor når NIR-lys i tilfælde af mus brysthulen selv eksternt. I øjeblikket er NIR laser enheder bruges til musen pleural formidling model9,10,11,12. Men i faktisk klinisk brug har vi til hensigt at bruge præcis fiberoptik til at bestråle hele intrathoracic hulrum via thorax drænrøret34. For det andet er NIR-bestrålingsdosis begrænset afhængigt af mAb'ens specificitet for antigener udtrykt på tumorceller. Ikke-specifik binding af APC kan forårsage uventede organskader.
Afslutningsvis præsenterede vi en metode til at evaluere NIR-PIT's terapeutiske virkning med BLI i den pleurale formidlingsmodel af MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L.
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
