Summary
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、抗体光吸収体(IR700Dye)とNIR光を利用してがん細胞を破壊する新たながん治療戦略です。ここでは、生物発光イメージングを用いた胸膜播種肺癌および悪性胸膜中皮腫のマウスモデルにおけるNIR-PITの抗腫瘍効果を評価する方法を提示する。
Abstract
光線免疫療法の有効性は、皮下マウスモデルよりも正交性マウスモデルでより正確に評価することができる。胸膜普及モデルは、肺がんや悪性胸膜中皮腫などの胸部内疾患の治療方法の評価に使用できます。
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、NIR光への曝露後に光吸収体(IR700Dye)によって引き起こされる毒性と腫瘍標的性抗体の特異性を組み合わせた、最近開発されたがん治療戦略です。NIR-PITの有効性は、様々な抗体を使用して報告されています;しかし、この戦略の治療効果を正交性モデルで示した報告はごくわずかである。本研究では、NIR-PITを用いて治療した胸膜播種肺癌モデルの有効性評価の例を示す。
Introduction
がんは、何十年もの研究にもかかわらず、死亡率の主要な原因の1つです。その理由の一つは、放射線療法と化学療法が非常に侵襲的な技術であり、治療上の利点を制限する可能性があるということです。侵襲性の低い技術である細胞または分子標的療法は注目を集めています。光線免疫療法は、免疫療法と光線療法を組み合わせることで、治療効果を相乗的に高める治療法です。免疫療法は、腫瘍微小環境の免疫原性を高め、免疫調節抑制を低減することによって腫瘍免疫を高め、体内の腫瘍の破壊をもたらす。光線療法は、光増感剤と光線の組み合わせで原発性腫瘍を破壊し、腫瘍細胞から放出される腫瘍特異的抗原は腫瘍免疫を増強する。腫瘍は、標的細胞に特異的かつ選択的であるほど、感知剤を用いて選択的に治療することができる。光線療法のモダリティには、光力学療法(PDT)、光熱療法(PTT)、光化学ベースの治療法1が含まれる。
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、光化学系療法と免疫療法1,2を組み合わせた最近開発された抗腫瘍光線療法の方法である。NIR-PITは、近赤外シリコンフタロシアニン色素IRdye 700DX(IR700)をモノクローナル抗体(mAb)に結合させることにより、特定の細胞表面分子を標的とする分子標的療法です。標的細胞の細胞膜は、NIR光(690nm)3で照射すると破壊される。
従来の光化素子と抗体または標的PDTを組み合わせることによって標的光療法を使用するという概念は、30年以上前の4,5です。これまでの研究では、それらを抗体に結合させることによって、従来のPDT剤を標的にすることを試みてきた。しかし、これらのコンジュゲートは、フォトエンサイザー6、7の疎水性のために肝臓に閉じ込められたため、限られた成功がありました。また、NIR-PITのメカニズムは、従来のPDTとは全く異なります。従来の光化剤は、光エネルギーを吸収し、励起状態に脱臼し、地盤状態に移行し、アポトーシスを引き起こすエネルギー変換から生じる酸化ストレスを生成します。しかし、NIR-PITは光化学反応8を通じて膜上の光増感剤を凝集させることによって細胞膜を直接破壊することによって急速な壊死を引き起こす。NIR-PITは、多くの点で従来のターゲットPDTよりも優れています。従来の光増感剤は、低い消光係数を有し、単一の抗体分子に多数の光増感剤を付着させる必要があり、結合親和性を低下させる可能性がある。ほとんどの従来の感知剤は疎水性であり、免疫反応性や生体内標的蓄積を損なうことなく、抗体に対して感知剤を結合することは困難です。従来の光化剤は、通常、可視範囲で光を吸収し、組織の浸透を減少させる。
肺がんや悪性胸膜中皮腫(MPM)細胞などの胸部腫瘍を標的とするNIR-PITに関するいくつかの研究が報告されている9,10,11,12,13,14,15,16,17.しかし、胸膜普及MPMまたは肺癌モデル9、10、11、12におけるNIR-PITの有効性を説明した報告はごくわずかである。皮下腫瘍異種移植モデルは、標準的な腫瘍モデルであると考えられるが、現在、新しい治療法18の抗腫瘍効果を評価するために広く使用されている。しかしながら、皮下腫瘍微小環境は、真悪性表現型19、20、21、22を適切に再現する適切な組織構造や状態の発達に対して寛容ではない。理想的には、直交性疾患モデルは、抗腫瘍効果のより正確な評価のために確立されるべきである。
ここでは、NIR-PITを用いて治療した胸膜播種肺癌のマウスモデルにおける有効性評価の方法を示す。胸膜流布マウスモデルは、胸腔に腫瘍細胞を注入することによって生成され、ルシファーゼ発光を用いて確認される。マウスを、胸部へのIR700およびNIR照射と共役したmAbの静脈内注射で治療した。治療効果を、ルシファーゼ発光を用いて評価した。
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Protocol
すべてのin vivo実験は、名古屋大学動物の世話と使用委員会の実験動物資源のケアと使用のためのガイド(承認#2017-29438、#2018-30096、#2019-31234、#2020-20104)に従って行われました。名古屋大学動物センターで、生後6週間のホモ接合性腺腺ヌードマウスを購入・維持した。マウスで処置を行う場合、イオブルラン(導入:4-5%、メンテナンス2-3%)で麻酔を行った。足は麻酔の深さを確認するためにピンセットで押された。
1. IR700とmAbの結合
- インキュベート mAb (1 mg, 6.8 nmol) IR700 NHSエステル (66.8 mg, 34.2 nmol, 5 mmol/L で DMSO) で 0.1 mol/L Na2HPO4 (pH 8.6) で 1 時間 15-25 °C.
- カラム(例えば、セパデックス)を使用して混合物を精製します。準備し、PBSで列を洗います。次に、この混合物をカラムに塗布し、精製されたIR700結合抗体を含むドロップを収集します。このIR700結合抗体は、抗体の増重化コンジュゲート(APC)と呼ばれる。
- APC中のタンパク質およびIR700濃度を測定する。
- 分光光度計を用いてタンパク質およびIR700の校正曲線を調製する。
- アルブミンの標準的な濃度を、キットプロトコルに従ってタンパク質アッセイキットと混合します(材料表、クマシーブリリアントブルー(CBB)タンパク質染色を参照)。595 nm波長のアルブミンの吸光度を測定し、y = ax + b (x: 濃度、y: 吸光度) を使用してタンパク質の較正曲線(線形近似式)をプロットします。
- 同じ手順で690 nmで吸収したIR700のキャリブレーションカーブを取得します。IR700の標準濃度は0.1-5 μM(0.1954-9.77 μg/mL)で推奨されます。
- APCのタンパク質濃度とIR700濃度を、較正曲線[x=(y-b)/a(x:濃度、y:吸光度)]を使用して測定します。
- モル濃度の結果を持つmAb当たりのIR700染料の数を決定する。
注: mAb分子当たりの IR700 分子の最適な結合数を決定することが重要です。一般に、1つのmAb分子に結合した約3つのIR700分子は、インビトロとインビボの両方に有効であろう。抗体当たり(例えば、6個)に結合したIR700の多くは、インビボ実験中に肝臓に閉じ込められるのが容易になる。IR700に結合した抗体の比率は1:2-1:4の範囲であった。IR700の割合は、必要に応じて減少した。
- APCの形成の確認として、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行います。蛍光画像を使用して700nmのゲルを画像化し、キットプロトコルに従うタンパク質染色キットを使用してゲル中のタンパク質を染色します(材料表、CBBタンパク質染色を参照)。
2.胸膜普及モデルの生成
- ルシファーゼ発現標的細胞を調製し、1.0×106個の標的細胞をリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の100μLで一時停止する
注:肺癌やMPMなどの胸部内がん細胞は、標的細胞として適しています。ルシファーゼ発現細胞をルシファーゼ遺伝子トランスフェクションで調製し、10個の細胞通路>後に高いルシファーゼーゼの発現を確認した。細胞は、10%のウシ胎児血清およびペニシリン(100 IU/mL)およびストレプトマイシン(100mg/mL)を添加した培地で培養した。細胞数は、腫瘍の増殖速度および治療の時間経過(1.0.×10 5-6.0×106細胞/体重)に従って調整した。 - 8-12週齢の雌のホモ接合性腺性ヌードマウスを調製し、好ましい体重は19〜21gである。
- イオブルラン(導入:4-5%、メンテナンス2-3%)で処置中にマウスを麻酔する。反応がないことを確認するためにピンセットで尾を押してください。
- ポリスチレンフォームでストッパーを作り、先端が肺の損傷を防ぐために5 mmに残るように30 G針にストッパーを取り付けます。きれいな鉗子で針先を曲げるか、気胸を避けるために70%EtOHで洗浄された硬い物体に押し付けることによって(図1)。
注意:自分を突き刺さないように注意してください。針を曲げるために鉗子を使用してください。針にストッパーを取り付ける際は、止めを持ち込まないでください。細胞を注射器に充填する前にストッパーを付ける方が安全です。 - 注射器(1mL)をターゲット細胞で満たし、30Gの針にストッパーを取り付けます。
- 処置の前に70%のEtOHで動物の胸部を消毒する。
- 肋間腔を通して、針をマウスの胸に突き刺します。その時の肋骨に当たって抵抗が起き、針先が上下に動いた。肋間空間を通過した後、マウスに対して注射器を押し付け、100 μLの標的細胞を注入する(図2)。
メモ:針が胸腔に正しく入ると、マウスは深く呼吸します。針先の曲がりにより、気胸や肺への細胞の不適切な注入を避けることができる。
注意:右胸壁穿刺は、心臓壁穿刺のリスクを回避するために推奨されます。 - マウスを2~3回ロールし、胸腔全体に細胞を広げます。
- マウスを清潔で暖かいケージに戻し、外来まで監視します。処置後、マウスは麻酔から目を覚まし、正常に動作します。
3.生物発光の測定
メモ: データ収集に使用するソフトウェアは、資料一覧に記載されています。
- 胸膜普及モデルの生成を確認するために、細胞を胸腔に注入した後、毎日生物発光画像を評価する。
- マウスを麻酔し(ステップ2.3)、D-ルシフェリン(15mg/mL、200 μL)で腹腔内注射する。
- マウスが画像撮影の前後に正常に呼吸していることを確認します。麻酔中の低体温症を防ぐために必要に応じてヒーターを使用してください。
- 注射後10分、マウスを生物発光イメージング(BLI)測定装置にセットする。画像取得の場合は、ソフトウェアの取得コントロールパネルを開きます。[ルミネセント]、[写真]、および[オーバーレイ] (図 3)を選択します。
- 露出時間を自動に設定します。ビニングを小さく設定します。
- f/ストップは、発光の場合は1、写真には8に設定します。f/stop は、充電された結合デバイス検出器が受け取る光の量を制御します。
- [ビューのフィールド] を[C]に設定します。
- マウスサンプルのイメージングの準備ができたら、[取得]をクリックしてイメージングを取得します。十分なルシファーゼ活性を有するマウスは、さらなる研究のために選択された。
注:適切な胸膜普及モデルは、腹側から見ると胸部の拡散部位に強い発光を示す。BLI画像が胸郭で拡散せず、注射部位でのみ拡散する場合、腫瘍は皮下に移植される可能性がある。 - 画像を表示した後、表示形式を「輝度」に設定します。ツールパレットパネル(図4A)を開きます。
- [ROI ツール] を選択します。画像上の生物発光領域の範囲を指定するには、Circleを使用することをお勧めします。
- [ROI を測定]をクリックして、表面の生物発光強度を測定します(図4B)。
- ROI 測定パネルの左隅にある[測定を設定]を使用して、必要な値/情報を選択します。このデータ テーブルを.csv ファイルとしてエクスポートします (図 4C)。
- .csv ファイルでの生物発光強度の定量として、総磁束 (p/s) の値を使用します。
4.拡散発光イメージング断層撮影(DLIT)
メモ: データ収集に使用するソフトウェアは、資料一覧に記載されています。
- X線の武装ボタンをオンにします。
- マウスを麻酔し(ステップ2.3)、D-ルシフェリン(15mg/mL、200 μL)をマウスに腹腔内注入します。DLIT を 3.2 から 3.7 まで連続的に撮影するには、この手順をスキップします。
- 射出後10分、BLI装置にマウスをセットします。
- ソフトウェアの取得コントロールパネルを開きます。[ルミネセント]、[写真]、[CT]、[スタンダードワンマウス]、[オーバーレイ]を選択します。その他の設定は、3.4-3.6 と同じでした (図 5A)。
- 取得コントロール パネルの[イメージング ウィザード] を選択します。
- [生物発光]を選択し、DLITを選択します(図5B)。
- 測定する波長としてホタルを選択します (図5C)。
- [イメージング対象] を[マウス] に設定し、露出パラメータを自動設定、視野をC-13.4 cmに設定し、件名の高さを1.5 cmに設定します (図5D)。
- X線を押すと通電します。を取得します。
- CTの順次画像データを開きます。
- ツール パレットでサーフェス の地形を開きます。[表示] (図 6A) を選択します。
- 紫色の表示がボディサーフェスのみを表示するので、しきい値を調整します(図6B)。次に、件名のヌード マウスを選択し、サーフェスの生成をクリックします。マウスの輪郭が正確に描画されていることを確認します(図6C)。
- ツールパレット、DLIT 3D 再構築プロパティタブを開きます。 次に、[解析]タブを開き、選択した各波長データのデータを確認します。最後に、[再構築] ボタンをクリックします (図 6E)。
- 設定された DLIT イメージの胸腔内に BLI が存在するかどうか確認します。
5. 生体内胸膜普及モデル用NIR-PIT
- パワーメーターで690 nm波長(NIR)レーザーの光量を測定し、出力を100 mW/cm2に調整します。
注:レーザー光は正確なコイルサイズと一貫性があります。したがって、光エネルギーは50cm以内の距離に関係なくほとんど変化しない。火傷など、有害事象が多い場合は、出力を 40 mW/cm2の範囲内で減らします。 - 70%のEtOHで尾部をきれいにし、NIR照射の前に24時間尾静脈を介してAPC(100 μg)を静脈内に注入する。注射部位に圧力をかけて出血をコントロールする。
メモ:射出用にAPCのボリュームを50~200μLに調整します。 - マウスを麻酔し(ステップ2.3)、仰向けに置きます。非標的部位へのNIR照射を避けるために、他の部位をアルミ箔で遮蔽する(図7A)。100 J/cm2のレーザーでNIR光を照射;腫瘍が腹に戻って播種されれば、NIR光照射線量は複数方向に分けられる(図7B)。
注:インビトロの結果や火傷などの有害事象に応じて、30-150 J /cm2で用量を調整してください。 - NIRの照射が完了し、マウスが目を覚ますと、ケージに戻します。
- BLIを観察し、時間の経過とともにROIを測定します(3.2-3.12参照)。
- エキビボイメージングの場合、APC注入後24時間、NIR照射の直前に、二酸化炭素を有するマウスを安楽死させる。
- マウスの胸の内側を観察するには、胸郭を取り除き、肋骨と胸骨を切断します。APC投与なしでコントロールと一緒に蛍光画像(700 nm)をキャプチャします。その後、露出した胸郭にD-ルシフェリン(150 μg/mL)を塗布し、BLIを取り出します(3.2-3.7参照)。
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Representative Results
抗ポドプラニン抗体NZ-1をIR700と共役にして、NZ-1-IR700を生成した。SDS-PAGEでNZ-1とIR700の結合を確認した(図8)。ルシファーゼ発現H2373(H2373-luc)は、ルシファーゼ遺伝子10で悪性中皮腫細胞(H2373)をトランスフェクトすることにより調製した。
生後8~12週齢の雌ホモ接合性腺腺ヌードマウスを麻酔し、1×105 H2373-luc細胞を胸腔に注入した。マウスへの腫瘍細胞の注射の日は1日目と示された。
4日目に、BLIおよびDLITを、D-ルシフェリン(15mg/mL、200 μL)を腹腔内に注射した後に行い、胸腔内で十分なルシメラーゼ活性を有するマウスを更なる研究のために選択した(図9)。NZ-1-IR700(100 μL)の百マイクログラムを、尾静脈を介して静脈内注射した。コントロール群にPBS(100μL)を注入した。
5日目には、2匹のマウスをex vivoに対する二酸化炭素窒息を用いて屠殺した。NZ-1-IR700注射マウスは、胸部腫瘍における高いIR700蛍光およびルシフェラーゼの両方の活動を示し、静脈内注射されたNZ-1-IR700が播種した胸膜腫瘍部位に達したことを示す(図10)。
胸膜透過マウスモデルにおけるNIR-PITの効果を評価するために、NIRライトは5日目に経皮的に2方向(合計30 J/cm2)から15J/cm2(合計30 J/cm2)で適用され(NIR光は外部に照射され、続いてシリアルBLI)対照群はNIR光を照射しなかった。
NIR-PITでマウスを治療した後、治療された群はルシファーゼ活性の低下を示した。しかし、対照群の相対光部は緩やかな増加を示した(*p<0.05対対照、t検定)(図11)。
図1: 細胞移植用の手作り装置 30G針にポリスチレンフォームで作られたストッパーを取り付け、先端が5mmに保たるようにします。気胸を避けるために針の先端を曲げるべきです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胸腔への標的細胞の注入 マウスを横に回し、針をマウスに突き刺して肺に向かって突き刺します。ストッパーと針先が曲がっているので、針は肺に付着することなく胸腔に入る。マウスに針を押しながらターゲット細胞を注入します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:取得コントロールパネル[ルミネセント]、[写真]、[オーバーレイ]を選択します。露光時間を自動、ビニングを小さく、f/ストップをルミネセントの場合は 1、写真の場合は 8、視野をCとして設定します。マウスサンプルのイメージングの準備ができたら、[取得]をクリックしてイメージングを取得します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:測定(BLI)(A)ツールパレットパネル。ROI ツールを選択します。画像上の生物発光領域の範囲を指定するサークルをお勧めします。(B) BLI 定量化。各画像の ROI を選択した後、[分析する ROI を測定] をクリックします。(C) 定量化情報。ROI 測定パネルの左隅にある[測定を設定]を使用して、必要な値/情報を選択します。このデータ テーブルをファイルとしてエクスポート.csv。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: DLITの取得 (A) DLIT の取得コントロール パネル [ルミネセント]、[写真]、[CT]、[スタンダードワンマウス]、および [オーバーレイ]を選択します。その他の設定は 3.4-3.6 と同じです (図 3)。(B) イメージング ウィザード パネル [ 生物発光] および [ DLIT] を選択します。(C)測定波長を選択します。ホ タルとして波長を選択します。(D) 画像の対象を マウスとして設定し、露出パラメータを 自動設定、視野を C-13.4 cm、件名の高さを 1.5 cmに設定します。次に、X線をクリックすると 通電時に生成されます。取得する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: DLITの再構築(A)ツールパレットパネルツール パレットでサーフェス の地形を開きます。[表示 ] を選択します。(B)マウス表面認識の調整紫色の表示がボディ サーフェスのみを表示するので、[しきい値]を調整します。サブジェクトのヌード マウスを選択し、[サーフェスを生成] をクリックします。マウスの輪郭が正確に描画されていることを確認します。(C) ツール パレット[DLIT 3D 再構成プロパティ]タブを開き、[組織プロパティ] をマウス組織として、ソーススペクトルをホタルとして選択します。(D) [解析]タブを開き、各波長データのデータを選択します。(E)再構築ボタンをクリックします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:NIR照射( A)は、腹にNIRを照射することを防ぐために、アルミ箔で腹を保護します。(B) BLIが強いレーザーを用いてNIR光を照射する。NIRレーザーが複数の方向に分割される場合もあります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: SDS-ページ SDS-PAGEゲル上の共役NZ-1-IR700の確認に成功しました(左、コロイドブルー染色、右、700 nmチャネルで蛍光)。希釈されたNZ-1が対照として役立った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9: DLIT 胸腔におけるルシファーゼ発現腫瘍細胞の確認この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10: Ex vivoイメージング BLIによるNZ-1-IR700注入後の胸膜普及MPMモデル24時間の特徴付け。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11:胸膜播種モデルに対するNIR-PITの抗腫瘍効果(A)ポドプラニン標的NIR-PITレジメンを線で示す。H2373-luc腫瘍を有する胸膜上のNZ-1-IR700を有するポドプラニン標的NIR-PIT。胸膜普及モデルのBLIが示されている。(B) BLIで測定したルシベーアの活動はNIR-PIT群では増加しなかったが、対照群は腫瘍の増殖とともに緩やかな増加を示した。(n ≥両方のグループで3、t検定)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、MPMの胸膜普及モデルに対するNIR-PITの治療効果を測定する方法を実証した。非常に選択的な細胞の殺しはNIR-PITで行われた;したがって、正常組織はほとんど損傷を受けていなかった23,24,25.この種の選択的細胞殺死により、NIR-PITは普及したモデル9,26において安全であることが実証された。ただし、いくつかの手順で別の方法が可能です。胸膜普及モデル27,28,29,30に対して種々の方法が報告されている。注射モデルは、マウスに対する負担が最も少ない簡単な手順であるため、選択しました。生きたマウスで定量的に評価できるため、NIR-PITの治療効果を測定するためにBLIを使用しました。例えば、陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)27は、胸膜播種モデルの腫瘍容積を評価する代替方法であり得る。他の異方体モデルにおけるBLIを伴うNIR-PITが報告されている。NIR-PITは、腹部流出型モデル、肺多転移性腫瘍モデル、および脳腫瘍12、26、31、32、33、34、35、36に使用することができる。小さな転移性腫瘍病巣でもBLIで観察することができ、NIR-PITは11,12を行うことができる。
我々は、予備的な実験に基づいて、プロトコルのいくつかの部分を説明した。まず、APC投与からNIR照射までの時間。薬物動態は皮下腫瘍モデルを用いて事前に評価した。APCは、mAbを使用して尾静脈を介して介入した後、腫瘍24時間でピーク;NIR照射は、APC投与9、10、11、12の後に24時間行うことができる。第二に、NIR-PITで腫瘍細胞を殺すために必要なNIR光用量は、インビトロの結果を用いて予測される抗体および標的細胞株によって異なる。
この研究には、いくつかの制限があります。まず、胸腔に腫瘍が広く分布し、NIR照射エネルギーを正確に測定できなかった。NIR励起光の波長(690 nmでピーク)は、組織37に少なくとも2〜3インチの浸透を可能にする。したがって、マウスの場合、NIR光は外部でも胸腔に到達する。現在、NIRレーザーデバイスは、マウス胸膜普及モデル9、10、11、12に使用されています。しかし、実際の臨床使用では、胸部排水管34を介して胸腔内腔全体を照射するために正確な光ファイバーを使用する予定である。第2に、NIR照射線量は、腫瘍細胞上で発現する抗原に対するmAbの特異性に応じて制限される。APCの非特異的結合は、予期せぬ臓器損傷を引き起こす可能性があります。
結論として、MPMの胸膜普及モデルにおけるBLIによるNIR-PITの治療効果を評価する方法を提示した。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
何一つ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
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