Summary
Nær-infrarød fotoimmunoterapi (NIR-PIT) er en fremvoksende kreftterapeutisk strategi som bruker en antistoff-fotoabsorber (IR700Dye) konjugat og NIR-lys for å ødelegge kreftceller. Her presenterer vi en metode for å evaluere antitumoreffekten av NIR-PIT i en musemodell av pleural spredt lungekreft og ondartet pleuralt mesothelioma ved hjelp av bioluminescensavbildning.
Abstract
Effekten av fotoimmunoterapi kan evalueres mer nøyaktig med en ortotopisk musemodell enn med en subkutan. En pleural formidlingsmodell kan brukes til evaluering av behandlingsmetoder for intrathoracic sykdommer som lungekreft eller ondartet pleural mesothelioma.
Nær-infrarød fotoimmunoterapi (NIR-PIT) er en nylig utviklet kreftbehandlingsstrategi som kombinerer spesifisiteten til tumormålrettende antistoffer med toksisitet forårsaket av en fotoabsorber (IR700Dye) etter eksponering for NIR-lys. Effekten av NIR-PIT er rapportert ved bruk av ulike antistoffer; Imidlertid har bare noen få rapporter vist den terapeutiske effekten av denne strategien i en ortotopisk modell. I den nåværende studien viser vi et eksempel på effektevaluering av den pleurale formidlings lungekreftmodellen, som ble behandlet ved hjelp av NIR-PIT.
Introduction
Kreft er fortsatt en av de ledende årsakene til dødelighet til tross for flere tiår med forskning. En grunn er at strålebehandling og kjemoterapi er svært invasive teknikker, noe som kan begrense deres terapeutiske fordeler. Cellulære eller molekylær-målrettede terapier, som er mindre invasive teknikker, får økt oppmerksomhet. Fotoimmunoterapi er en behandlingsmetode som synergistisk forbedrer den terapeutiske effekten ved å kombinere immunterapi og fototerapi. Immunterapi forbedrer tumorimmuniteten ved å øke immunogenisiteten til tumormikromiljøet og redusere immunregulatorisk undertrykkelse, noe som resulterer i ødeleggelse av svulster i kroppen. Fototerapi ødelegger primære svulster med en kombinasjon av fotosensibilisatorer og lysstråler, og tumorspesifikke antigener frigjort fra tumorcellene forbedrer tumorimmuniteten. Svulster kan behandles selektivt ved hjelp av fotosensibiliserere, da de er spesifikke og selektive for målcellene. Modaliteten til fototerapi inkluderer fotodynamisk terapi (PDT), fototermisk terapi (PTT) og fotokjemibaserte terapier1.
Nær-infrarød fotoimmunoterapi (NIR-PIT) er en nylig utviklet metode for antitumor fototerapi som kombinerer fotokjemisk basert terapi og immunterapi1,2. NIR-PIT er en molekylært målrettet terapi som retter seg mot spesifikke celleoverflatemolekyler gjennom konjugering av et nær-infrarødt silisium ftalacyaniinfargestoff, IRdye 700DX (IR700), til et monoklonalt antistoff (mAb). Cellemembranen til målcellen ødelegges ved bestråling med NIR-lys (690 nm)3.
Konseptet med å bruke målrettet lysterapi ved å kombinere konvensjonelle fotosensibiliserere og antistoffer eller målrettet PDT er over tre tiår gammel4,5. Tidligere studier har forsøkt å målrette konvensjonelle PDT-midler ved å mane dem til antistoffer. Det var imidlertid begrenset suksess fordi disse konjugatene var fanget i leveren, på grunn av fotosensibiliteten til fotosensibilisatorene6,7. Dessuten er mekanismen til NIR-PIT helt forskjellig fra den konvensjonelle PDT. Konvensjonelle fotosensibilisatorer genererer oksidativt stress som skyldes en energikonvertering som absorberer lysenergi, dislokerer til en spent tilstand, overganger til bakketilstanden og forårsaker apoptose. NIR-PIT forårsaker imidlertid rask nekrose ved å ødelegge cellemembranen direkte ved å samle fotosensibilisatorer på membranen gjennom en fotokjemisk reaksjon8. NIR-PIT er på mange måter bedre enn konvensjonell målrettet PDT. Konvensjonelle fotosensibilisatorer har koeffisienter med lav utryddelse, noe som krever vedlegg av et stort antall fotosensibilisatorer til et enkelt antistoffmolekyl, noe som potensielt reduserer bindende affinitet. De fleste konvensjonelle fotosensibilisatorer er hydrofobe, noe som gjør det vanskelig å binde fotosensibilisatorene til antistoffer uten å gå på kompromiss med immunoreaktivitet eller in vivo-målakkumulering. Konvensjonelle fotosensibiliserere absorberer vanligvis lys i det synlige området, noe som reduserer vevsinntrengning.
Flere studier på NIR-PIT rettet mot intrathoracic svulster som lungekreft og ondartede pleural mesothelioma (MPM) celler har blitt rapportert9,10,11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har bare noen få rapporter beskrevet effekten av NIR-PIT i pleuralformidling MPM eller lungekreftmodeller9,10,11,12. Subkutan tumor xenograft modeller antas å være standard tumormodeller og er for tiden mye brukt til å evaluere antitumoreffektene av nye terapier18. Imidlertid er det subkutane tumormikromiljøet ikke tillatt for utvikling av en passende vevsstruktur eller en tilstand som riktig recapitulates en ekte ondartet fenotype19,20,21,22. Ideelt sett bør ortotopiske sykdomsmodeller etableres for en mer presis evaluering av antitumoreffektene.
Her demonstrerer vi en metode for effektevaluering i en musemodell av pleural spredt lungekreft, som ble behandlet ved hjelp av NIR-PIT. En pleural formidlingsmusmodell genereres ved å injisere tumorceller i thoracic hulrommet og bekreftet ved hjelp av luciferase luminescens. Musen ble behandlet med en intravenøs injeksjon av mAb konjugert med IR700 og NIR bestråling til brystet. Den terapeutiske effekten ble evaluert ved hjelp av luciferase luminescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo-eksperimenter ble utført i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animal resources of Nagoya University Animal Care and Use Committee (godkjenning #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Seks uker gamle homozygote athymiske nakenmus ble kjøpt og vedlikeholdt på Animal Center of Nagoya University. Når du utfører prosedyren hos mus, ble de bedøvet med isofluran (introduksjon: 4-5%, vedlikehold 2-3%); poten ble presset med pinsett for å bekrefte dybden av anestesi.
1. Konjugering av IR700 med mAb
- Inkuber mAb (1 mg, 6,8 nmol) med IR700 NHS ester (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/l i DMSO) i 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) ved 15-25 °C i 1 t.
- Rens blandingen ved hjelp av en kolonne (f.eks. Forbered og vask kolonnen med PBS. Påfør deretter blandingen på kolonnen og samle dråpen, som inneholder det rensede IR700-konjugede antistoffet. Dette IR700-konjugede antistoffet kalles antistoff photosensitizer conjugate (APC).
- Mål protein- og IR700-konsentrasjonen i APC.
- Klargjør kalibreringskurver for protein og IR700 ved hjelp av et spektrofotometer.
- Bland standardkonsentrasjoner av albumin med et proteinanalysesett etter kit-protokollen (se Tabell over materialer, Coomassie Brilliant Blue (CBB) proteinfarging). Mål absorbansen av albumin ved 595 nm bølgelengde, og plott kalibreringskurven (en lineær tilnærmingsformel) for proteinet ved hjelp av følgende ligning: y = øks + b (x: konsentrasjon, y: absorbans).
- Oppnå kalibreringskurver for IR700 med absorpsjon ved 690 nm ved hjelp av samme prosedyre. Standardkonsentrasjonen av IR700 anbefales ved 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/ml).
- Mål proteinkonsentrasjonen og IR700-konsentrasjonen i APC ved hjelp av en kalibreringskurve [x = (y-b)/a (x: konsentrasjon, y: absorbans)].
- Bestem antall IR700 fargestoffer bundet per mAb med resultatene av molarkonsentrasjonen.
MERK: Det er viktig å bestemme det optimale konjugeringsnummeret til IR700-molekyler per mAb-molekyl. Generelt vil omtrent tre IR700-molekyler bundet på et enkelt mAb-molekyl være effektive både in vitro og in vivo. Mange IR700 bundet per antistoff (f.eks. seks) gjør det lettere å bli fanget i leveren under in vivo-eksperimenter. Forholdet mellom antistoff bundet til IR700 var i området 1:2-1:4. Andelen IR700 ble redusert om nødvendig.
- Utfør natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) som en bekreftelse for dannelsen av en APC. Bilde gelen på 700 nm ved hjelp av en fluorescerende imager, og flekk proteinet i gelen ved hjelp av et proteinfargingssett etter kitprotokollen (se Tabell over materialer, CBB proteinfarging).
2. Generering av en pleural formidlingsmodell
- Klargjøre luciferase-uttrykkende målceller og suspendere 1,0 × 106 målceller i 100 μL fosfatbufret saltvann (PBS)
MERK: Intrathoracic kreftceller som lungekreft og MPM er egnet som målceller. Luciferase-uttrykkende celler ble fremstilt via luciferase gentransfeksjon, og høyt uttrykk for luciferase ble bekreftet etter > 10 cellepassasjer. Celler ble dyrket i et medium supplert med 10% føtal bovin serum og penicillin (100 IE / ml) og streptomycin (100 mg / ml). Antall celler ble justert i henhold til tumorvekstraten og behandlingsforløpet (1,0, × 105-6,0 × 106 celler/kroppsvekt). - Forbered 8-12 uker gamle kvinnelige homozygote athymiske nakenmus, med en foretrukket kroppsvekt på 19-21 g.
- Bedøv mus under prosedyren med isofluran (introduksjon: 4-5%, vedlikehold 2-3%); trykk på halen med pinsett for å bekrefte at det ikke er noen reaksjon.
- Lag en stopper med polystyrenskum og fest proppen til 30 G nålen slik at spissen forblir på 5 mm for å forhindre lungeskade. Bøy nålespissen med rene tang eller ved å trykke den mot en hard gjenstand som er rengjort med 70 % EtOH for å unngå pneumothorax (figur 1).
FORSIKTIG: Pass på at du ikke gjennomborer seg selv. Bruk tang til å bøye nålen. Ikke hold stopperen når du fester den til kanylen. Det er tryggere å stikke proppen før du fyller cellene i sprøyten. - Fyll en sprøyte (1 ml) med målceller, og fest en 30G nål med en stopper.
- Desinfiser dyrets bryst med 70% EtOH før prosedyren.
- Pierce en nål inn i brystet på musen gjennom intercostal plass. På grunn av motstanden mens du slo mot ribbeina på den tiden, beveget nålespissen seg opp og ned. Når du har passert intercostalrommet, trykker du sprøyten mot musen og injiserer 100 μL målceller (figur 2).
MERK: Musen puster dypt når nålen kommer ordentlig inn i brysthulen. Ved bøyning av nålespissen kan pneumothorax og upassende injeksjon av celler i lungen unngås.
MERK: Høyre brystvegg punktering anbefales for å unngå risikoen for hjertevegg punktering. - Rull musen 2-3 ganger for å spre cellene gjennom thoracic hulrommet.
- Returner musen til et rent og varmt bur og overvåk til ambulerende. Etter prosedyren vil musen våkne opp fra anestesi og oppføre seg normalt.
3. Måling av bioluminescens
MERK: Programvaren som brukes til datainnsamling er oppført i Materialfortegnelsen.
- For å bekrefte genereringen av pleural formidlingsmodellen, evaluer bioluminescensbildene hver dag etter å ha injisert cellene i thoraxhulen.
- Bedøv mus (trinn 2.3) og injiser intraperitonealt med D-luciferin (15 mg / ml, 200 μL).
- Sørg for at musen puster normalt før og etter bildebehandling. Bruk en varmeapparat om nødvendig for å forhindre hypotermi under anestesi.
- Ti minutter etter injeksjonen setter du musen i måleutstyret for bioluminescensavbildning (BLI). For bildeanskaffelse åpner du brukerstøtten for programvaren. Velg Luminescent, Fotografiog Overlegg (Figur 3).
- Angi eksponeringstid som Automatisk. Angi Binning som liten.
- Angi f/stopp som 1 for luminescerende og 8 for fotografi; f/stop kontrollerer mengden lys som mottas av den ladede enhetsdetektoren.
- Angi Synsfelt som C.
- Når museprøven er klar for avbildning, klikker du Hent for bildeinnsamling. Mus med tilstrekkelig luciferaseaktivitet ble valgt ut til videre studier.
MERK: En egnet pleural formidlingsmodell viser sterk luminescens på det diffuse stedet i brystet når den ses fra ventralsiden. Hvis BLI-bildene ikke er diffusert i thoraxen, og bare på injeksjonsstedet, kan svulsten transplanteres subkutant. - Når du har vist bildet, setter du visningsformatet til Radiance. Åpne verktøypalettpanelet (Figur 4A).
- Velg ROI-verktøy. Vi anbefaler at du bruker sirkelen til å variere det bioluminescerende området på bilder.
- Klikk Mål ROIer for å måle overflatens bioluminescerende intensitet (Figur 4B).
- Bruk Konfigurer måling i venstre hjørne av ROMI-målepanelet for å velge de nødvendige verdiene/informasjonen. Eksporter denne datatabellen som en .csv fil (Figur 4C).
- Bruk verdiene for Total Flux (p/s) som bioluminescent intensitet kvantifisering i .csv filen.
4. Diffus luminescensavbildningstomografi (DLIT)
MERK: Programvaren som brukes til datainnsamling er oppført i Materialfortegnelsen.
- Slå på røntgenbevæpnet knapp.
- Bedøv musene (trinn 2.3) og injiser deretter D-luciferin (15 mg/ml, 200 μL) intraperitonealt i musene. For å skyte DLIT kontinuerlig fra 3.2 til 3.7, hopp over dette trinnet.
- Ti minutter etter injeksjon, sett musen i BLI-utstyret.
- Åpne Brukeranskaffelse i Kontrollpanel for programvaren. Velg Lystetthet, Fotografi, CT, Standard-én-musog Overlegg. Andre innstillinger var de samme som i 3.4-3.6 (Figur 5A).
- Velg Imaging-veiviseren i Kontrollpanel for anskaffelse.
- Velg Bioluminescens og deretter DLIT (Figur 5B).
- Velg Firefly som bølgelengde som skal måles (Figur 5C).
- Angi bildemotivet som mus, eksponeringsparametere som Automatiske innstillinger, Synsfelt som C-13,4 cmog Motivhøyde som 1,5 cm ( Figur5D).
- Trykk på røntgenstrålene vil bli produsert når de er strømførende. Skaff deg.
- Åpne ct sekvensielle bildedata.
- Åpne Overflatetopografi på verktøypaletten. Velg Vis (Figur 6A).
- Juster terskelen slik lilla display bare viser kroppsoverflaten (Figur 6B). Deretter merker du Motivet Naken mus og klikker Generer overflate. Kontroller at omrisset av musen er nøyaktig tegnet (Figur 6C).
- Åpne kategorien Egenskaper for verktøypalett, DLIT 3D-rekonstruksjon . Deretter åpner du Analyser-fanen og bekrefter dataene for hver valgte bølgelengdedata. Til slutt klikker du Rekonstruer -knappen (Figur 6E).
- Bekreft tilstedeværelsen av BLI i brysthulen i det konfigurerte DLIT-bildet.
5. NIR-PIT for in vivo pleural formidlingsmodell
- Mål lysdosen på 690 nm bølgelengde (NIR) laser med en kraftmåler, og juster utgangen til 100 mW/cm2.
MERK: Laserlyset er sammenhengende med en presis spolestørrelse; Dermed endres den lette energien knapt uavhengig av avstanden innen 50 cm. Hvis det er mange uønskede hendelser, for eksempel brannskader, reduser utgangen innenfor området 40 mW / cm2. - Rengjør halen med 70% EtOH og injiser intravenøst APC (100 μg) via halevenen 24 timer før NIR-bestråling. Påfør trykk på injeksjonsstedet for å kontrollere blødning.
MERK: Juster volumet på APC til 50-200 μL for injeksjon. - Bedøv musene (trinn 2.3), og legg dem på ryggen. For å unngå NIR-bestråling til ikke-målstedet, beskytt andre steder med aluminiumsfolie (figur 7A). Bestråle med NIR-lys med en laser på 100 J/cm2; Hvis svulsten spres tilbake til magen, kan NIR-lysbestrålingsdosen deles i flere retninger (figur 7B).
MERK: Juster dosen ved 30-150 J/cm2 avhengig av in vitro-resultatene og bivirkninger som brannskader. - Når NIR-bestrålingen er fullført og musen er våken, returner den til buret.
- Vær oppmerksom på BLI og mål avkastningen over tid (hver dag) (Se 3.2-3.12).
- For ex vivo-avbildning, euthanize mus med karbondioksid 24 timer etter APC-injeksjonen, umiddelbart før NIR-bestrålingen.
- For å observere innsiden av musens bryst, fjern thoraxen og kutt ribbenene og brystbenet. Ta fluorescensbildet (700 nm) ved siden av kontrollen uten APC-administrasjon. Påfør deretter D-luciferin (150 μg/ml) over den eksponerte thoraxen, og BLI ble tatt (se 3.2-3.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-podoplanin antistoff NZ-1 ble konjugert med IR700 for å generere NZ-1-IR700. Vi bekreftet bindingen av NZ-1 og IR700 på en SDS-PAGE (Figur 8). Luciferase-uttrykkende H2373 (H2373-luc) ble utarbeidet ved å transfekte ondartede mesothelioma celler (H2373) med et luciferase gen10.
Vi bedøvet 8-12 uker gamle kvinnelige homozygote athymiske nakenmus og injiserte 1 × 105 H2373-luc celler i thoracic hulrommet. Injeksjonsdagen for tumorceller i musene ble indikert som dag 1.
På dag 4 ble BLI og DLIT utført etter at D-luciferin (15 mg/ml, 200 μL) ble injisert intraperitonealt, og mus med tilstrekkelig luciferaseaktivitet i brysthulen ble valgt for videre studier (figur 9). Hundre mikrogram NZ-1-IR700 (100 μL) ble intravenøst injisert via halevenen. Kontrollgruppen ble injisert med PBS (100 μL).
På dag 5 ble to mus ofret ved hjelp av karbondioksid kvælning for ex vivo. NZ-1-IR700 injisert mus viste både høy IR700 fluorescens og luciferase aktiviteter i thoracic svulster, noe som indikerer at intravenøst injisert NZ-1-IR700 nådde de spredte pleural tumor steder (Figur 10).
For evalueringen av effekten av NIR-PIT i den pleurale spredte musemodellen ble NIR-lyset påført ved 15 J/cm2 fra to retninger (totalt 30 J/cm2) ved 40 mW/cm2 transkutant på dag 5 (NIR-lyset ble bestrålet eksternt), etterfulgt av seriell BLI. Kontrollgruppen ble ikke bestrålet med NIR-lys.
Etter behandling av mus med NIR-PIT viste den behandlede gruppen redusert luciferaseaktivitet. Den relative lysenheten i kontrollgruppen viste imidlertid en gradvis økning (*p < 0,05 versus kontroll, t-test) (figur 11).
Figur 1: Enkel håndlaget enhet for celletransplantasjon. Fest proppen laget med polystyrenskum til 30G-nålen slik at spissen forblir på 5 mm. Spissen av nålen skal bøyes for å unngå pneumothorax. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Injeksjon av målceller i thoraxhulen. Vri musen sidelengs og pierce nålen inn i musen mot lungen. Siden stopperen og nålespissen er bøyd, kommer nålen inn i thoraxhulen uten å holde seg til lungene. Injiser målceller mens du trykker nålen mot musen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kontrollpanel for anskaffelse. Velg Lystetthet, Fotografiog Overlegg. Angi Eksponeringstid som Automatisk, Binning som Liten, f/stopp som 1 for lystetthet og 8 for fotografi og Synsfelt som C. Når museprøven er klar for avbildning, klikker du Hent for bildeinnsamling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Måling (BLI). (A) Verktøypalettpanel. Velg ROI-verktøy. Vi anbefaler sirkelen for å variere det bioluminescerende området på bilder. (B) BLI-kvantifisering. Når du har valgt avkastningen i hvert bilde, klikker du på Mål ROIer for å analysere. (C) Kvantifiseringsinformasjon. Bruk Konfigurer måling i venstre hjørne av ROI-målepanelet for å velge de nødvendige verdiene/informasjonen. Eksporter denne datatabellen som .csv fil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Anskaffelse av DLIT. (A) Kontrollpanel for anskaffelse for DLIT. Velg Luminescent, Photograph, CT, Standard-One Mouseog Overlay. Andre innstillinger er de samme som 3,4-3,6 (figur 3). (B) Bildeveiviserpanel. Velg Bioluminescensog DLIT. (C) Velg målingsbølgelengde. Velg bølgelengden som firefly. (D) Angi bildemotivet som mus, eksponeringsparametere som Automatiske innstillinger, Synsfelt som C-13,4 cmog Motivhøyde som 1,5 cm. Deretter klikker du på røntgenbildene vil bli produsert når de er strømførende. Erverve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Rekonstruksjon av DLIT. (A) Verktøypalettpanel. Åpne Overflatetopografi på verktøypaletten. Velg Vis. (B) Justere gjenkjenning av museoverflate. Juster terskelverdien slik den lilla skjermen bare viser kroppsoverflaten. Velg emnet Nude Mouse, og klikk deretter Generer overflate. Kontroller at omrisset av musen er nøyaktig tegnet. (C) Verktøypalett. Åpne kategorien Egenskaper for DLIT 3D-rekonstruksjon , velg Vevsegenskaper som Musevev og Kildespektrum som Firefly. (D) Åpne kategorien Analyser , og velg dataene for hver bølgelengdedata. (E) Klikk rekonstruer -knappen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: NIR bestråling. (A) Beskytt magen med aluminiumsfolie for å forhindre NIR-bestråling i magen. (B) Bestråle NIR-lys ved hjelp av laser der BLI er sterk; I noen tilfeller er NIR-laser delt i flere retninger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: SDS-PAGE. Vellykket bekreftelse av konjugert NZ-1-IR700 på en SDS-PAGE gel (venstre, kolloidal blå farging; høyre, fluorescens ved 700 nm kanal). Fortynnet NZ-1 fungerte som kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: DLIT. Bekreftelse av de luciferase-uttrykkende tumorcellene i thoraxhulen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Ex vivo-avbildning. Karakterisering av den pleurale formidlingen MPM-modellen 24 timer etter NZ-1-IR700 injeksjon med BLI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Antitumoreffekt av NIR-PIT på pleuralspredningsmodell. (A) Det podoplaninrettede NIR-PIT-regimet er vist i en linje. Podoplanin-målrettet NIR-PIT med NZ-1-IR700 på pleural spredt modell med H2373-luc svulster. BLI av den pleurale formidlingsmodellen vises. (B) Selv om luciferaseaktivitetene målt med BLI ikke økte i NIR-PIT-gruppen, viste kontrollgruppen en gradvis økning sammen med tumorvekst. (n ≥ 3 i begge gruppene, t-test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien demonstrerte vi en metode for å måle den terapeutiske effekten av NIR-PIT på den pleurale formidlingsmodellen til MPM. Svært selektiv celledrap ble utført med NIR-PIT; Dermed ble det normale vevet knapt skadet23,24,25. Med denne typen selektiv celledrap ble NIR-PIT vist å være trygg i spredte modeller9,26. Alternative metoder er imidlertid mulig i noen trinn. Det er rapportert ulike metoder for pleural formidlingsmodell27,28,29,30. Vi valgte injeksjonsmodellen fordi det er en enkel prosedyre som er minst tyngende for mus. Vi brukte BLI til å måle den terapeutiske effekten av NIR-PIT fordi vi kan evaluere kvantitativt med levende mus. For eksempel kan positronutslippstomografi/beregnet tomografi (PET/CT)27 være en alternativ måte å evaluere tumorvolumet til pleural formidlingsmodellen på. NIR-PIT med BLI i andre ortotopiske modeller er rapportert; NIR-PIT kan brukes til abdominal formidling modell, lunge flere metastatiske tumor modell, og hjernesvulst12,26,31,32,33,34,35,36. Selv små metastatiske tumorfoci kan observeres med BLI, og NIR-PIT kan utføres11,12.
Vi beskrev deler av protokollen basert på foreløpige eksperimenter. For det første tiden fra APC-administrasjon til NIR-bestråling. Farmakokinetikken ble evaluert på forhånd ved hjelp av en subkutan tumormodell. APC topper i svulsten 24 timer etter inngrep via halevenen ved hjelp av mAb; NIR-bestråling kan utføres 24 timer etter APC-administrasjon9,10,11,12. For det andre varierer NIR-lysdosen som kreves for å drepe tumorceller i NIR-PIT avhengig av antistoff- og målcellelinjene, som forutses ved hjelp av in vitro-resultatene.
Denne studien har noen begrensninger. For det første ble svulster utbredt i thoraxhulen, og NIR-bestrålet energi kunne ikke måles nøyaktig. Bølgelengden til NIR eksitasjonslyset (topp på 690 nm) tillater penetrasjon av minst 2-3 tommer inn i vevet37. Derfor, når det gjelder mus, når NIR-lyset thoraxhulen selv eksternt. For tiden brukes NIR-laserenheter til musens pleural formidlingsmodell9,10,11,12. Men i faktisk klinisk bruk har vi tenkt å bruke presis fiberoptikk for å bestråle hele det intrathoracic hulrommet via thoracic dreneringsrøret34. For det andre er NIR-bestrålingsdosen begrenset avhengig av mAbs spesifisitet til antigener uttrykt på tumorceller. Ikke-spesifikk binding av APC kan forårsake uventet organskade.
Til slutt presenterte vi en metode for å evaluere den terapeutiske effekten av NIR-PIT med BLI i den pleurale formidlingsmodellen til MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L.
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
