Summary
Nära infraröd fotoimmunoterapi (NIR-PIT) är en framväxande cancerterapeutisk strategi som använder en antikroppsfotoabsorber (IR700Dye) konjugat och NIR-ljus för att förstöra cancerceller. Här presenterar vi en metod för att utvärdera antitumöreffekten av NIR-PIT i en musmodell av pleura-spridd lungcancer och maligna pleura mesoteliom med hjälp av bioluminescens imaging.
Abstract
Effekten av fotoimmunoterapi kan utvärderas mer exakt med en ortopisk musmodell än med en subkutan. En pleura spridning modell kan användas för utvärdering av behandlingsmetoder för intrathoracic sjukdomar såsom lungcancer eller maligna pleura mesoteliom.
Nära infraröd fotoimmunoterapi (NIR-PIT) är en nyligen utvecklad cancerbehandlingsstrategi som kombinerar specificiteten hos tumörinriktade antikroppar med toxicitet orsakad av en fotoabsorber (IR700Dye) efter exponering för NIR-ljus. Effekten av NIR- PIT har rapporterats med hjälp av olika antikroppar; emellertid, endast några rapporter har visat den terapeutiska effekten av denna strategi i en ortopisk modell. I den aktuella studien visar vi ett exempel på effektutvärdering av den pleura-spridas lungcancer modellen, som behandlades med NIR-PIT.
Introduction
Cancer är fortfarande en av de främsta dödsorsakerna trots årtionden av forskning. En orsak är att strålbehandling och kemoterapi är mycket invasiva tekniker, vilket kan begränsa deras terapeutiska fördelar. Cellulära eller molekylärt riktade terapier, som är mindre invasiva tekniker, får ökad uppmärksamhet. Photoimmunotherapy är en behandlingsmetod som synergistiskt förbättrar den terapeutiska effekten genom att kombinera immunterapi och ljusterapi. Immunterapi förbättrar tumör immunitet genom att öka immunogeniciteten i tumör microenvironment och minska immunregulatoriska undertryckande, vilket resulterar i förstörelse av tumörer i kroppen. Fototerapi förstör primära tumörer med en kombination av ljuskänslighet och ljusstrålar, och tumörspecifika antigener som frigörs från tumörcellerna förbättrar tumörimmuniteten. Tumörer kan selektivt behandlas med hjälp av ljuskänslighetskrämer eftersom de är specifika och selektiva för målcellerna. Modaliteten i fototerapi inkluderar fotodynamisk terapi (PDT), fototermisk terapi (PTT) och fotokemibaserade terapier1.
Nära infraröd fotoimmunoterapi (NIR-PIT) är en nyligen utvecklad metod för antitumörfototerapi som kombinerar fotokemisk-baserad terapi och immunterapi1,2. NIR-PIT är en molekylärt riktad terapi som riktar sig mot specifika cellytemolekyler genom konjugation av ett nästan infrarött silikonftalocyaninfärgämne, IRdye 700DX (IR700), till en monoklonal antikropp (mAb). Målcellens cellmembran förstörs vid bestrålning med NIR-ljus (690 nm)3.
Konceptet att använda riktad ljusterapi genom att kombinera konventionella ljuskänslighets- och antikroppar eller riktad PDT är över tre decennier gammal4,5. Tidigare studier har försökt rikta konventionella PDT-medel genom att frammana dem till antikroppar. Det var dock begränsad framgång eftersom dessa konjugat fångades i levern, på grund av ljuskänslighet6,7. Dessutom skiljer sig nir-PIT-mekanismen helt från den konventionella PDT. Konventionella ljuskänslighetsfaktorer genererar oxidativ stress som är resultatet av en energiomvandling som absorberar ljusenergi, förskjuts till ett upphetsad tillstånd, övergår till marktillståndet och orsakar apoptos. NIR-PIT orsakar dock snabb nekros genom att direkt förstöra cellmembranet genom att aggregera ljussenitatorer på membranet genom en fotokemisk reaktion8. NIR-PIT är överlägsen konventionell riktad PDT på många sätt. Konventionella ljussenitizers har låg utrotningskoefficienter, vilket kräver fastsättning av ett stort antal ljuskänsliga medel till en enda antikroppsmolekyl, vilket potentiellt minskar bindningstillhörigheten. De flesta konventionella ljuskänslighetskrämer är hydrofobiska, vilket gör det svårt att binda ljussenitizers till antikroppar utan att kompromissa med deras immunoreaktivitet eller in vivo-målackumulering. Konventionella ljussenitizers absorberar vanligtvis ljus i det synliga området, vilket minskar vävnadspenetration.
Flera studier på NIR-PIT som riktar sig mot intrathoracic tumörer såsom lungcancer och maligna pleura mesoteliom (MPM) celler har rapporterats9,10,11,12,13,14,15,16,17. Endast ett fåtal rapporter har dock beskrivit effekten av NIR-PIT i pleura-spridas MPM eller lungcancer modeller9,10,11,12. Subkutan tumör xenograft modeller tros vara standard tumör modeller och används för närvarande i stor utsträckning för att utvärdera antitumör effekter av nya terapier18. Subkutan tumör microenvironment är dock inte tillåtande för utvecklingen av en lämplig vävnad struktur eller ett tillstånd som korrekt rekapitulerar en sann maligna fenotyp19,20,21,22. Helst bör ortopediska sjukdomsmodeller fastställas för en mer exakt utvärdering av antitumöreffekterna.
Här visar vi en metod för effektivitetsutvärdering i en musmodell av pleura-spridd lungcancer, som behandlades med NIR-PIT. En pleura spridning mus modell genereras genom att injicera tumör celler i brösthålan och bekräftas med luciferase luminescence. Musen behandlades med en intravenös injektion av mAb konjugerad med IR700 och NIR bestrålning till bröstet. Den terapeutiska effekten utvärderades med luciferase luminescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla in vivo-experiment utfördes i enlighet med vägledningen för vård och användning av laboratoriedjurresurser i Nagoya University Animal Care and Use Committee (godkännande #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Sex veckor gammal homozygote athymic naken möss köptes och underhålls vid Animal Center of Nagoya University. När de utförde proceduren hos möss bedövades de med isofluran (introduktion: 4-5%, underhåll 2-3%); tassen pressades med pincett för att bekräfta anestesidjupet.
1. Konjugation av IR700 med mAb
- Inkubera mAb (1 mg, 6,8 nmol) med IR700 NHS ester (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L i DMSO) i 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) vid 15-25 °C i 1 timme.
- Rena blandningen med en kolonn (t.ex. Sephadex). Förbered och tvätta kolonnen med PBS. Applicera sedan blandningen på kolonnen och samla droppen, som innehåller den renade IR700-konjugerade antikroppen. Denna IR700-konjugerade antikropp kallas antikroppsfotoensitizerkonjugat (APC).
- Mät protein- och IR700-koncentrationen i APC.
- Förbered kalibreringskurvor för protein och IR700 med hjälp av en spektrofotometer.
- Blanda standardkoncentrationer av albumin med ett proteintestkit enligt kitprotokollet (se Table of Materials, Coomassie Brilliant Blue (CBB) proteinfärgning). Mät inabsorbansen av albumin vid 595 nm våglängd och rita kalibreringskurvan (en linjär approximationsformel) för proteinet med hjälp av följande ekvation: y = ax + b (x: koncentration, y: absorbans).
- Få kalibreringskurvor för IR700 med absorption vid 690 nm med samma procedur. Standardkoncentrationen av IR700 rekommenderas vid 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/ml).
- Mät proteinkoncentrationen och IR700-koncentrationen i APC med hjälp av en kalibreringskurva [x = (y-b)/a (x: koncentration, y: absorbans)].
- Bestäm antalet IR700-färgämnen som är bundna per mAb med resultaten av molarkoncentrationen.
OBS: Det är viktigt att bestämma det optimala konjugationsnumret för IR700-molekyler per mAb-molekyl. I allmänhet skulle ungefär tre IR700-molekyler bundna på en enda mAb-molekyl vara effektiva både in vitro och in vivo. Många IR700 bundna per antikropp (t.ex. sex) gör det lättare att fastna i levern under in vivo-experiment. Förhållandet mellan antikroppar bundna till IR700 var i intervallet 1:2-1:4. Andelen IR700 minskade vid behov.
- Utför natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE) som en bekräftelse för bildandet av en APC. Avbilda gelén vid 700 nm med hjälp av en fluorescerande imager och färga proteinet i gelén med hjälp av ett proteinfärgningskit enligt kitprotokollet (se Materialförteckning, CBB-proteinfärgning).
2. Generering av en modell för spridning av pleura
- Förbered luciferas-uttryckande målceller och suspendera 1,0 × 106 målceller i 100 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
OBS: Intrathoracic cancerceller såsom lungcancer och MPM är lämpliga som målceller. Luciferase-uttrycker celler utarbetades via luciferase gen transfection, och höga uttryck för luciferase bekräftades efter > 10 cell passager. Cellerna odlades i ett medium kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum och penicillin (100 IE/mL) och streptomycin (100 mg/mL). Antalet celler justerades enligt tumörtillväxthastigheten och behandlingstiden (1,0. × 105-6,0 × 106 celler/kroppsvikt). - Förbered 8-12 veckor gammal kvinnlig homozygot athymic nakna möss, med en före föredravärd kroppsvikt på 19-21 g.
- Bedöva möss under proceduren med isofluran (introduktion: 4-5%, underhåll 2-3%); tryck på svansen med pincett för att bekräfta att det inte finns någon reaktion.
- Gör en propp med polystyrenskum och fäst proppen på 30 G-nålen så att spetsen förblir på 5 mm för att förhindra lungskada. Böj nålspetsen med rena tångar eller genom att trycka den mot ett hårt föremål som rengörs med 70 % EtOH för att undvika pneumothorax (figur 1).
VARNING: Var försiktig så att du inte genomborrar dig själv. Använd tång för att böja nålen. Håll inte proppen när du fäster den på nålen. Det är säkrare att sticka proppen innan du fyller cellerna i sprutan. - Fyll en spruta (1 ml) med målceller och fäst en 30G-nål med en propp.
- Desinficera djurets bröstkorg med 70% EtOH före proceduren.
- Genomborra en nål i musens bröst genom det interkostala utrymmet. På grund av motståndet när man slog mot revbenen vid den tiden rörde sig nålspetsen upp och ner. Efter att ha passerat genom interkostala utrymmet trycker du sprutan mot musen och injicerar 100 μL målceller (figur 2).
OBS: Musen andas djupt när nålen kommer in i brösthålan ordentligt. Med böjning av nålspetsen kan lungkollaps och olämplig injektion av celler i lungan undvikas.
OBS: Höger bröstväggspunktion rekommenderas för att undvika risken för punktering av hjärtväggen. - Rulla musen 2-3 gånger för att sprida cellerna över brösthålan.
- Sätt tillbaka musen i en ren och varm bur och övervaka tills den är ambulatorisk. Efter proceduren kommer musen att vakna upp från anestesi och bete sig normalt.
3. Mätning av bioluminescens
Obs: Programvaran som används för datainsamling listas i materialförteckningen.
- För att bekräfta genereringen av pleura spridnings modellen, utvärdera bioluminescens bilder varje dag efter injicera cellerna i brösthålan.
- Bedöva möss (steg 2.3) och injicera intraperitoneally med D-luciferin (15 mg/ml, 200 μL).
- Se till att musen andas normalt före och efter avbildning. Använd en värmare om det behövs för att förhindra hypotermi under narkos.
- Tio minuter efter injektionen ställer du in musen i mätutrustningen för bioluminescensavbildning (BLI). För bildförvärv öppnar du programvarans kontrollpanel för förvärv. Välj Luminescent, Fotografioch Överlägg (Bild 3).
- Ställ in exponeringstiden som Automatisk. Ställ in Binning som liten.
- Ställ in f/stop som 1 för självlysande och 8 för fotografi; f/stop styr mängden ljus som tas emot av den laddade kopplade enhetsdetektorn.
- Ange fältet Visa som C.
- När musprovet är klart för avbildning klickar du på Hämta för bildförvärv. Möss med tillräcklig luciferasaktivitet valdes ut för vidare studier.
OBS: En lämplig pleura-spridningsmodell visar stark ljusstyrka på det diffusa området i bröstet när den ses från ventralsidan. Om BLI-bilderna inte sprids i bröstkorgen, och endast på injektionsstället, kan tumören transplanteras subkutant. - När du har visat bilden ställer du in visningsformatet på Radiance. Öppna panelen Verktygspalett (Bild 4A).
- Välj ROI-verktyg. Vi rekommenderar att du använder Cirkeln för att variera det bioluminescerande området på bilder.
- Klicka på Mät ROIs för att mäta ytans bioluminescerande intensitet (Figur 4B).
- Använd Konfigurera mätning i det vänstra hörnet på ROI-mätpanelen för att välja de värden/den information som behövs. Exportera den här datatabellen som en .csv fil (figur 4C).
- Använd värdena för Totalt flöde (p/s) som den bioluminescerande intensitetsk kvantifieringen i .csv filen.
4. Diffus luminescence imaging tomografi (DLIT)
Obs: Programvaran som används för datainsamling listas i materialförteckningen.
- Slå på röntgenknappen.
- Bedöva mössen (steg 2.3) och injicera sedan D-luciferin (15 mg/ml, 200 μL) intraperitoneally i mössen. Hoppa över det här steget om du vill skjuta DLIT kontinuerligt från 3,2 till 3,7.
- Tio minuter efter injektionen ställer du in musen i BLI-utrustningen.
- Öppna programvarans kontrollpanel för förvärv. Välj Luminescent, Fotografi, CT, Standard-One Mouseoch Överlägg. Övriga inställningar var desamma som i 3,4-3,6 (figur 5A).
- Välj bildguiden på kontrollpanelen för förvärv.
- Välj Bioluminescens och sedan DLIT (Bild 5B).
- Välj Firefly som våglängd för att mäta (Bild 5C).
- Ställ in bildämnet som mus,exponeringsparametrar som automatiskainställningar , Synfält som C-13,4 cmoch Ämneshöjden som 1,5 cm ( Bild5D).
- Tryck på röntgenstrålarna när de är strömförande. Skaffa.
- Öppna CT-sekventiella bilddata.
- Öppna Surface Topography på verktygspaletten. Välj Visa (bild 6A).
- Justera tröskeln eftersom den lila displayen endast visar kroppsytan (figur 6B). Välj sedan ämnes naken musen och klicka på Generera yta. Kontrollera att musens kontur är korrekt ritad (bild 6C).
- Öppna verktygspaletten, fliken DLIT 3D-rekonstruktionsegenskaper. Välj vävnadsegenskaper som musvävnad och källspektrum som firefly (figur 6D). Öppna sedan fliken Analysera och bekräfta data för varje vald våglängdsdata. Klicka slutligen på knappen Rekonstruera ( bild 6E).
- Bekräfta förekomsten av BLI i brösthålan i den konfigurerade DLIT-bilden.
5. NIR-PIT för in vivo pleura spridning modell
- Mät ljusdosen på 690 nm våglängdslaser (NIR) med en effektmätare och justera utgången till 100 mW/cm2.
OBS: Laserljuset är förenligt med en exakt spolestorlek; Således förändras ljusenergin knappast oavsett avståndet inom 50 cm. Om det finns många biverkningar, såsom brännskador, minska effekten inom intervallet 40 mW/cm2. - Rengör svansen med 70% EtOH och injicera intravenöst APC (100 μg) via svansvenen 24 timmar före NIR-bestrålning. Tryck på injektionsstället för att kontrollera blödningen.
OBS: Justera volymen av APC till 50-200 μL för injektion. - Bedöva mössen (steg 2.3) och lägg dem på ryggen. För att undvika NIR-bestrålning till icke-målplatsen, skydda andra platser med aluminiumfolie (Figur 7A). Bestråla med NIR-ljus med en laser på 100 J/cm2; Om tumören sprids tillbaka till magen kan nir-ljus bestrålningsdosen delas i flera riktningar (figur 7B).
OBS: Justera dosen vid 30-150 J/cm2 beroende på in vitro-resultat och biverkningar såsom brännskador. - När NIR-bestrålningen är klar och musen är vaken, returnera den till buret.
- Observera BLI och mät AVKASTNINGEN över tid (varje dag) (se 3.2-3.12).
- För ex vivo imaging avlivar möss med koldioxid 24 timmar efter APC- injektionen, omedelbart före NIR-bestrålningen.
- För att observera insidan av musens bröstkorg, ta bort bröstkorgen och skär revbenen och bröstbenet. Fånga fluorescensbilden (700 nm) bredvid kontrollen utan APC-administration. Applicera sedan D-luciferin (150 μg/ml) över den exponerade bröstkorgen, och BLI togs (se 3, 2-3, 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-podoplanin antikropp NZ-1 konjugerades med IR700 för att generera NZ-1-IR700. Vi bekräftade bindningen av NZ-1 och IR700 på en SDS-SIDA (Figur 8). Luciferase-uttrycker H2373 (H2373-luc) utarbetades genom transfecting maligna mesoteliom celler (H2373) med en luciferase gen10.
Vi bedövade 8-12 veckor gammal kvinnliga homozygote athymic naken möss och injiceras 1 × 105 H2373-luc celler i brösthålan. Dagen för injektion av tumörceller i mössen angavs som dag 1.
Dag 4 injicerades BLI och DLIT efter att D-luciferin (15 mg/ml, 200 μL) injicerats intraperitoneally och möss med tillräcklig luciferasaktivitet i brösthålan valdes ut för ytterligare studier (figur 9). Hundra mikrogram NZ-1-IR700 (100 μL) injicerades intravenöst via svansvenen. Kontrollgruppen injicerades med PBS (100 μL).
På dag 5 offrades två möss med hjälp av koldioxid kvävning för ex vivo. Nz-1-IR700 injicerade musen visade både hög IR700 fluorescens och luciferase verksamhet i bröst tumörer, vilket indikerar att intravenöst injicerade NZ-1-IR700 nådde de spridas pleura tumör platser (Figur 10).
För utvärdering av effekten av NIR-PIT i den pleura-spridas mus modellen, NIR ljus tillämpades vid 15 J/cm2 från två riktningar (totalt 30 J/cm2) vid 40 mW/cm2 transkutan på dag 5 (NIR ljus bestrålades externt), följt av seriell BLI. Kontrollgruppen bestrålades inte med NIR-ljus.
Efter behandling av möss med NIR- PIT visade den behandlade gruppen minskad luciferasaktivitet. Den relativa ljusenheten i kontrollgruppen visade dock en gradvis ökning (*p < 0,05 jämfört med kontroll, t-test) (figur 11).
Bild 1:Enkel handgjord enhet för celltransplantation. Fäst proppen med polystyrenskum på 30G-nålen så att spetsen förblir 5 mm. Nålens spets ska böjas för att undvika pneumothorax. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Injektion av målceller i brösthålan. Vrid musen i sidled och genomborra nålen i musen mot lungan. Eftersom proppen och nålspetsen är böjda kommer nålen in i brösthålan utan att hålla fast vid lungorna. Injicera målcellerna medan du trycker nålen mot musen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Kontrollpanelen för förvärv. Välj Luminescent, Fotografioch Överlägg. Ställ in exponeringstiden som auto,binning som liten, f/stop som 1 för självlysande och 8 för fotografi och Synfält som C. När musprovet är klart för avbildning klickar du på Hämta för bildförvärv. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:Mätning (BLI). Välj ROI-verktyg. Vi rekommenderar Circle att variera det bioluminescerande området på bilder. B)BLI kvantifiering. När du har valt ROI i varje bild klickar du på Mät ROI för att analysera. C)Kvantifieringsinformation. Använd Konfigurera mätning i det vänstra hörnet på ROI-mätpanelen för att välja de värden/den information som behövs. Exportera den här datatabellen .csv filen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Förvärv av DLIT. (A) Kontrollpanel för förvärv för DLIT. Välj Luminescent, Fotografi, CT, Standard-One Mouseoch Överlägg. Andra inställningar är desamma som 3.4-3.6 (Bild 3). (B) Panelen Bildbehandlingsguiden. Välj Bioluminescensoch DLIT. (C) Välj mätvåglängd. Välj våglängden som firefly. (D) Ställ in bildämnet som mus,exponeringsparametrar som automatiskainställningar, synfält som C-13,4 cmoch ämneshöjden till 1,5 cm. Klicka sedan på röntgenstrålarna kommer att produceras när de är strömförande. Förvärva. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 6: Rekonstruktion av panelen DLIT. (A) Verktygspalett. Öppna Surface Topography på verktygspaletten. Välj Visa. B)Justering av musens ytigenkänning. Justera tröskelvärdet eftersom den lila displayen bara visar kroppsytan. Markera ämnet Naken mus ochklicka sedan på Generera yta. Kontrollera att musens kontur ritas korrekt. (C) Verktygspalett. Öppna fliken DLIT 3D-rekonstruktionsegenskaper, välj vävnadsegenskaper som musvävnad och källspektrum som Firefly. (D) Öppna fliken Analysera och välj data för varje våglängdsdata. (E) Klicka på knappen Rekonstruera. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 7:NIR bestrålning. (A) Skydda magen med aluminiumfolie för att förhindra NIR-bestrålning mot magen. B)Bestråla NIR-ljus med laser där BLI är starkt. I vissa fall är NIR-laser uppdelad i flera riktningar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 8: SDS-PAGE. Lyckad bekräftelse av konjugerad NZ-1-IR700 på en SDS-PAGE gel (vänster, kolloidal blå färgning; höger, fluorescens vid 700 nm kanal). Utspädd NZ-1 fungerade som kontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9: DLIT. Bekräftelse av luciferase-uttrycker tumör celler i brösthålan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 10:Ex vivo imaging. Karakterisering av pleura spridas MPM modell 24 h efter NZ-1-IR700 injektion med BLI. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 11: Antitumöreffekten av NIR-PIT på pleura-spridd modell. (A) Den podoplanininriktade NIR-PIT-regimen visas i en rad. Podoplanin-riktade NIR-PIT med NZ-1-IR700 på pleura spridas modell med H2373-luc tumörer. BLI av pleura spridas modell visas. B)Även om luciferasaktiviteter mätta med BLI inte ökade i NIR-PIT-gruppen, uppvisade kontrollgruppen en gradvis ökning tillsammans med tumörtillväxt. (n ≥ 3 i båda grupperna, t-test). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie visade vi en metod för att mäta den terapeutiska effekten av NIR-PIT på pleura spridningsmodellen för MPM. Mycket selektiv cell dödande utfördes med NIR-PIT; således skadades den normala vävnadenknappt 23,24,25. Med denna typ av selektiv cellmord visades NIR-PIT vara säker i spridade modeller9,26. Alternativa metoder är dock möjliga i vissa steg. Olika metoder har rapporterats för pleura spridning modell27,28,29,30. Vi valde injektionsmodellen eftersom det är ett enkelt förfarande som är minst betungande för möss. Vi använde BLI för att mäta den terapeutiska effekten av NIR-PIT eftersom vi kan utvärdera kvantitativt med levande möss. Till exempel kan positronutsläpp tomografi/datortomografi (PET/CT)27 vara ett alternativt sätt att utvärdera tumör volymen i pleura spridning modell. NIR-PIT med BLI i andra ortopiska modeller har rapporterats; NIR-PIT kan användas för buken spridning modell, lunga flera ögonbevarande tumör modell, och hjärntumör12,26,31,32,33,34,35,36. Även små ögonbevarande tumörfoci kan observeras med BLI, och NIR-PIT kan utföras11,12.
Vi beskrev vissa delar av protokollet baserat på preliminära experiment. För det första tiden från APC-administrering till NIR-bestrålning. Farmakokinetiken utvärderades i förväg med hjälp av en subkutan tumörmodell. APC toppar i tumör 24 h efter ingripande via svans venen med mAb; NIR bestrålning kan utföras 24 h efter APC administration9,10,11,12. För det andra skiljer sig NIR-ljusdosen som krävs för att döda tumörceller i NIR-PIT beroende på antikropps- och målcellslinjerna, vilket förutspås med hjälp av in vitro-resultaten.
Denna studie har några begränsningar. Först var tumörer utbredd i brösthålan, och NIR-bestrålade energi kunde inte mätas exakt. Våglängden hos NIR-excitationsljuset (topp vid 690 nm) möjliggör penetration av minst 2-3 tum ivävnaden 37. Därför når NIR-ljuset brösthålan även externt när det gäller möss. För närvarande används NIR-laserenheter för musens pleuraspridningsmodell9,10,11,12. Men vid faktisk klinisk användning avser vi att använda exakt fiberoptik för att bestråla hela intrathoracic håligheten via bröst dräneringsröret34. För det andra är NIR-bestrålningsdosen begränsad beroende på mAb: s specificitet till antigener uttryckta på tumörceller. Icke-specifik bindning av APC kan orsaka oväntade organskador.
Sammanfattningsvis presenterade vi en metod för att utvärdera den terapeutiska effekten av NIR-PIT med BLI i pleura spridningsmodellen av MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L.
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
