Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61597
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston

Summary

In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.

Abstract

Bacteriële persistenten worden gedefinieerd als een kleine subpopulatie van fenotypische varianten met het vermogen om hoge concentraties antibiotica te tolereren. Ze zijn een belangrijk gezondheidsprobleem omdat ze zijn geassocieerd met terugkerende chronische infecties. Hoewel bekend is dat stochastische en deterministische dynamiek van stressgerelateerde mechanismen een belangrijke rol speelt bij persistentie, worden mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische switch van/naar de persistentietoestand niet volledig begrepen. Hoewel persistentiefactoren die worden veroorzaakt door omgevingssignalen (bijv. uitputting van koolstof-, stikstof- en zuurstofbronnen) uitgebreid zijn bestudeerd, moeten de effecten van osmolyten op persistentie nog worden bepaald. Met behulp van microarrays (d.w.z. 96 putplaten met verschillende chemicaliën) hebben we een aanpak ontworpen om de effecten van verschillende osmolyten op escherichia coli persistentie op een hoge doorvoer manier op te helderen. Deze aanpak is transformerend omdat het gemakkelijk kan worden aangepast voor andere screeningarrays, zoals medicijnpanels en gen knock-outbibliotheken.

Introduction

Bacteriële culturen bevatten een kleine subpopulatie van persistente cellen die tijdelijk tolerant zijn voor ongewoon hoge niveaus van antibiotica. Persistentiecellen zijn genetisch identiek aan hun antibioticagevoelige verwanten en hun overleving is toegeschreven aan voorbijgaande groeiremming1. Persistercellen werden voor het eerst ontdekt door Gladys Hobby2, maar de term werd voor het eerst gebruikt door Joseph Bigger toen hij ze identificeerde in met penicilline behandelde Staphylococcus pyogenesculturen 3. Een baanbrekende studie gepubliceerd door Balaban et al.4 ontdekte twee persistentietypen: type I-varianten die voornamelijk worden gevormd door passage door de stationaire fase, en type II-varianten die continu worden gegenereerd tijdens de exponentiële groei. Persistenten worden gedetecteerd door clonogene overlevingstesten, waarbij kweekmonsters met verschillende tussenpozen worden genomen tijdens antibioticabehandelingen, gewassen en geplateerd op een typisch groeimedium om de overlevende cellen te tellen die kunnen koloniseren bij afwezigheid van antibiotica. Het bestaan van persistenten in een celkweek wordt beoordeeld door een bifasische kill curve4,5 waarbij het initiële exponentiële verval wijst op de dood van antibioticagevoelige cellen. De moordtrend neemt echter in de loop van de tijd af, wat uiteindelijk leidt tot een plateaugebied dat de overlevende persistentiecellen vertegenwoordigt.

Persistercellen zijn geassocieerd met verschillende ziekten zoals tuberculose6, cystische fibrose7, candidiasis8 en urineweginfecties9. Bijna alle tot nu toe geteste micro-organismen bleken persistenterfenotypes te genereren, waaronder hoogpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 en Candida albicans8. Recente studies leveren ook bewijs voor de opkomst van multidrugresistente mutanten uit persistenter subpopulaties11,12. Uit aanzienlijke inspanningen op dit gebied is gebleken dat persistentiemechanismen zeer complex en divers zijn; van zowel stochastische als deterministische factoren geassocieerd met de SOS-respons13,14, reactieve zuurstofsoorten (ROS)15, toxine/antitoxine (TA) systemen16, autofagie of zelfvertering17 en ppGpp-gerelateerde strenge respons18 is bekend dat persistentievorming wordt vergemakkelijkt.

Ondanks aanzienlijke vooruitgang bij het begrijpen van het persistentiefenotype, zijn de effecten van osmolyten op bacteriële persistentie niet volledig begrepen. Aangezien het behoud van optimale osmotische druk een noodzaak is voor de groei, goede werking en overleving van cellen, kan een diepgaande studie van osmolyten leiden tot potentiële doelwitten voor anti-persisterstrategieën. Hoewel moeizame screening met hoge doorvoer een zeer effectieve benadering is voor het identificeren van metabolieten en andere chemische stoffen die een cruciale rol spelen in de persistentie fenotype19,20. In dit werk zullen we onze gepubliceerde methode19bespreken , waarbij we microarrays hebben gebruikt, d.w.z. 96 putplaten die verschillende osmolyten bevatten (bijv. natriumchloride, ureum, natriumnitriet, natriumnitraat, kaliumchloride), om osmolyten te identificeren die de persistentie van E. coli aanzienlijk beïnvloeden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van groeimedium, ofloxacineoplossing en E. coli-celvoorraden

  1. Normaal Luria-Bertani (LB) medium: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L natriumchloride (NaCl) en 5 g/L gistextract toe in gedeïoniseerd (DI) water. Steriliseer het medium door autoclaaf.
  2. LB agar platen: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 15 g/L agar toe aan DI water en steriliseer het medium door autoclaaf. Giet bij de gewenste temperatuur (~55 °C) ~30 ml agar medium in vierkante platen (10 x 10 cm). Droog de platen en bewaar ze op 4 °C.
  3. Gemodificeerd LB-medium: Voeg 10 g/L trypton en 5 g/L gistextract toe in DI-water. Steriliseer het medium door autoclaaf.
  4. Gemodificeerd LB-medium inclusief osmolyt: Meng 2x gemodificeerd LB-medium met een 2x osmolyte-oplossing in gelijke volumes. Om 2x gemodificeerd LB-medium te bereiden, voegt u 20 g/L trypton en 10 g/L gistextract toe in DI-water en steriliseert u door autoclaaf. Om de 2x osmolyte-oplossing te bereiden, lost u de osmolyt van belang (2x hoeveelheid) op in DI-water en filtert u de oplossing vervolgens.
    OPMERKING: Het osmolyt van belang en de concentraties ervan kunnen worden bepaald aan de hand van de fenotype microarray screeningstesten (zie Protocol 4). Het geteste osmolyt en de bijbehorende 2x concentratie kunnen echter worden aangepast afhankelijk van de aard van het onderzoek. Om bijvoorbeeld de impact van 1 mM natriumchloride te bestuderen, zou een 2x osmolyte-oplossing een natriumchlorideoplossing van 2 mM zijn.
  5. Ofloxacine stamoplossing (5 mg/ml): Voeg 5 mg ofloxacine (OFX) zout toe in 1 ml DI-water. Voeg 10 μL 10 M natriumhydroxide toe om de oplosbaarheid van OFX in water te verhogen en filtreer vervolgens de oplossing. Bereid aliquots voor en bewaar bij -20 °C.
    OPMERKING: Ofloxacine is een chinolonantibioticum dat veel wordt gebruikt voor zowel groeiende als niet-groeiende bacteriële cellen14,21. De minimale remmende concentratie (MIC) van OFX voor E. coli MG1655-cellen ligt binnen het bereik van 0,039–0,078 μg/ml19,20. Merk ook op dat andere antibiotica zoals ampicilline en kanamycine vaak worden gebruikt in persisteronderzoek. De keuze van antibiotica is afhankelijk van de aard van het onderzoek.
  6. E. Coli MG1655-celvoorraden: Ent 2 ml normaal LB-medium in met een enkele kolonie in een reageerbuis van 14 ml (snap-capped) en kweek de cellen in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C. Wanneer de cellen de stationaire fase bereiken, mengt u 500 μL van de celkweek met 500 μL 50% glycerol (steriel) in een cryogene flacon en bewaart u deze bij -80 °C.

2. Voortplanting van cellen om reeds bestaande persistenten te elimineren

  1. Om een nachtkweek voor te bereiden, schraapt u een kleine hoeveelheid cellen uit een bevroren celvoorraad met een steriele pipetpunt (ontdooi de glycerolcelvoorraad niet) en en ent u de cellen in 2 ml gemodificeerd LB-medium in een snap-capped reageerbuis van 14 ml. Kweek de cellen in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C gedurende 12 uur.
  2. Eerste vermeerdering
    1. Breng na 12 uur 250 μL nachtkweek over naar 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml bedekt met een steriele aluminiumfolie.
    2. Kweek de celkweek in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C totdat cellen de midden-exponentiële fase bereiken (OD600 = 0,5).
    3. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) met behulp van een microplaatlezer om de 30 minuten.
  3. Tweede vermeerdering
    1. Verdun bij OD600 = 0,5 250 μL celkweek uit de eerste kolf tot 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml.
    2. Kweek de tweede celkweek in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C tot OD600=0,5.
    3. Meet de optische dichtheid elke 30 minuten.
      OPMERKING: Een nachtcultuur kan een aanzienlijke hoeveelheid persistentiecellen4,5,22bevatten . De hierboven beschreven verdunnings-/groeicyclusmethode5 kan worden gebruikt om deze reeds bestaande persistenten te elimineren voordat de cellen naar microarrays worden overgebracht. Hun eliminatie kan worden gevalideerd door persistenterniveaus van overnight-culturen te kwantificeren met de in Protocol 3 beschreven test. Deze methode is reeds gevalideerd in een eerdere studie19.

3. Valideren van de eliminatie van reeds bestaande persistentercellen

  1. Verdun na de tweede vermeerdering (zie stap 2.3) 250 μL van de celkweek (OD600 = 0,5) in 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml.
    OPMERKING: Verdun voor de controles 250 μL nachtkweek (zie stap 2.1) in 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml. Alvorens de cellen in de kolf over te brengen, moet de celdichtheid van de nachtkweek worden aangepast in vers gemodificeerd LB-medium om OD600 = 0,5 te verkrijgen.
  2. Voeg 25 μL OFX-stamoplossing (5 mg/ml) toe aan de celsuspensie en schud de kolf voorzichtig om de testcultuur homogeen te maken. De uiteindelijke concentratie OFX is 5 μg/ml in de testcultuur.
  3. Incubeer de testcultuur in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C.
  4. Breng elk uur tijdens de behandeling (inclusief 0 uur, het tijdstip voordat OFX in de testcultuur wordt toegevoegd) 1 ml van de testcultuur over van de kolf naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  5. Centrifugeer de testcultuur in de microcentrifugebuis gedurende 3 min op 17.000 x g.
  6. Verwijder voorzichtig 950 μL van het supernatant zonder de celkorrel te verstoren.
  7. Voeg 950 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de microcentrifugebuis.
  8. Herhaal de wasstappen 3,5-3,7 gedurende in totaal 3x totdat de antibioticaconcentratie onder de minimale remmende concentratie (MIC) ligt.
  9. Na de laatste wasbeurt de celkorrel opnieuw in 100 μL PBS-oplossing, wat resulteert in een 10x geconcentreerd monster.
  10. Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun zes keer in 90 μL PBS-oplossing met behulp van een 96 goed ronde bodemplaat.
  11. Spot 10 μL verdunde celsuspensussingen op antibioticavrije verse agarplaten. Om de detectielimiet te verhogen, plaat de resterende 90 μL celsuspensie op een verse agarplaat.
  12. Incubeer de agarplaten gedurende 16 uur bij 37 °C en tel vervolgens de kolonievormende eenheden (CFUs). Houd rekening met de verdunningspercentages bij de berekening van het totale aantal CFUs in 1 ml testcultuur. Kill curves worden gegenereerd door het plotten van de logaritmische CFU-waarden met betrekking tot de duur van de antibioticabehandeling.
    OPMERKING: Een 6 uur OFX-behandeling is voldoende om een bifasische kill curve te verkrijgen voor E. coli cellen19,20. Het persistentieniveau van de gepropageerd cellen (gemeten aan de hand van CFU-tellingen van 6 uur) moet aanzienlijk lager zijn dan dat van de nachtcultuur. De procedures beschreven in Protocol 2 en 3 kunnen worden uitgevoerd met regelmatige LB, afhankelijk van het onderzoeksontwerp.

4. Microarray plaat screenings

  1. Microarray-celculturen voorbereiden
    1. Breng 250 μL exponentiële fasecellen over naar 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een centrifugebuis van 50 ml. Meng de celsuspensie voorzichtig om deze homogeen te maken.
      OPMERKING: De exponentiële fasecellen (OD600 = 0,5) worden verkregen uit de tweede propagatiestap (zie stap 2.3).
    2. Breng de verdunde celsuspensie over in een steriel reservoir van 50 ml.
    3. Breng met behulp van een meerkanaals pipet 150 μL van de celsuspensie over naar elke put van een microarray, d.w.z. een plaat van 96 put die verschillende osmolyten bevat.
      OPMERKING: Putten zonder osmolyten dienen als besturingselementen.
    4. Bedek de microarray met een gasdoorlatend afdichtingsmembraan.
    5. Incubeer de plaat in een orbitale shaker bij 37 °C en 250 tpm gedurende 24 uur.
      OPMERKING: In deze experimenten werden in de handel verkrijgbare platen gebruikt, zoals Phenotype Microarrays (PM-9 en PM-10) die een breed scala aan osmolyten, pH-buffers en andere chemicaliën in gedroogde toestand bij verschillende concentraties omvatten. Deze microarrays zijn in half-gebied 96 goed plaatformaten. De kweekvolumes moeten worden aangepast afhankelijk van het type platen dat wordt gebruikt. Microarrays kunnen ook handmatig worden gegenereerd (zie hieronder).
  2. Handmatige bereiding van microarray platen
    1. Breng 75 μL 2x osmolyte-oplossingen over in de putten van een 96-putplaat met een half oppervlak.
    2. Breng 500 μL exponentiële fasecellen over naar 25 ml 2x gemodificeerd LB-medium in een centrifugebuis van 50 ml. Meng de celsuspensie voorzichtig om deze homogeen te maken.
      OPMERKING: De inentingssnelheid werd aangepast om consistent te zijn met het microarray screening protocol beschreven in 4.1.
    3. Voeg 75 μL van de celsuspensie toe aan elke put van de 96-putplaat met 2x osmolyte-oplossingen.
    4. Incubeer de plaat in een orbitale shaker bij 37 °C en 250 tpm gedurende 24 uur.
  3. Het voorbereiden van persistenter assay platen
    1. Bereid 25 ml gemodificeerd LB-medium met 5 μg/ml OFX in een centrifugebuis van 50 ml en breng dit medium over in een steriel reservoir.
    2. Breng 190 μL gemodificeerd LB-medium met OFX uit het reservoir over in elke put van een generieke flat-bottom 96 putplaat (persister-assay plate) met behulp van een meerkanaals pipet.
    3. Verwijder de microarray uit de shaker (na 24 uur cultiveren) en breng 10 μL celculturen over van de microarray naar de putten van de persister-assay plate, die gemodificeerd LB-medium met OFX bevatten.
    4. Neem 10 μL celsuspensingen uit de persistenter-assay plaat en verdun driemaal in 290 μL PBS-oplossing met behulp van een 96-putplaat met ronde bodem en een meerkanaals pipet.
    5. Na de seriële verdunning spot 10 μL van alle serieel verdunde celsuspensusingen op antibioticavrije verse agarplaten met behulp van een meerkanaalspipet.
    6. Incubeer de persister-assay plaat (bereid in stap 4.3.3) in een orbitale shaker bij 37 °C en 250 tpm gedurende 6 uur na het bedekken van de plaat met een gasdoorlatend afdichtingsmembraan.
    7. Neem na 6 uur incubatie in een shaker de persister-assay plate eruit en herhaal de stappen 4.3.4-4.3.5.
    8. Incubeer de agarplaten gedurende 16 uur bij 37 °C en tel vervolgens CFUs. De CFU-niveaus vóór en 6 uur na de antibioticabehandeling maken het mogelijk om de persistentiefractie in elke put te berekenen. De CFU telt voordat de OFX-behandeling ook helpt bij het beoordelen van de effecten van osmolyten en op de levensvatbaarheid van E. coli.

5. Valideren van de vastgestelde voorwaarden

  1. Breng 250 μL van de exponentiële fasecellen over van stap 2.3 naar 25 ml vers gemodificeerd LB-medium dat het osmolyt bevat dat is geïdentificeerd uit de microarrayscreening (zie Protocol 4).
  2. Incubeer de kolf in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C gedurende 24 uur.
  3. Verwijder na 24 uur de kolf uit de shaker en breng 250 μL van de celkweek over op 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml.
  4. Voeg 25 μL OFX-stamoplossing (5 mg/ml) toe aan de celsuspensie en schud de kolf voorzichtig om de testcultuur homogeen te maken. Incubeer de kolf in een shaker bij 37 °C en 250 tpm.
  5. Breng elk uur tijdens de behandeling 1 ml van de testcultuur over van de kolf naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  6. Centrifugeer de testcultuur in de microcentrifugebuis gedurende 3 min op 17.000 x g.
  7. Verwijder 950 μL supernatant en voeg 950 μL PBS toe.
  8. Herhaal de wasstappen 5.6 en 5.7 gedurende 3x.
  9. Na de laatste wasbeurt de celkorrel opnieuw in 100 μL PBS-oplossing.
  10. Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun 6x in 90 μL PBS-oplossing met een 96 goed ronde bodemplaat.
  11. Spot 10 μL van de verdunde celsuspensussingen op een antibioticavrije verse agarplaat. Om de detectielimiet te verhogen, plaat de resterende 90 μL celsuspensie op een verse agarplaat.
  12. Incubeer de agarplaat gedurende 16 uur bij 37 °C en tel vervolgens CFUs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 beschrijft ons experimentele protocol. De verdunnings-/groeicyclusexperimenten (zie Protocol 2) werden aangepast aan een studie uitgevoerd door Keren et al.5 om de persistenten afkomstig van de nachtelijke culturen te elimineren. Figuur 2A is een representatief beeld van agarplaten die worden gebruikt om CFU-niveaus van celculturen voor en na OFX-behandeling te bepalen. In deze experimenten werden cellen gekweekt in gemodificeerd LB-medium met osmolyten in 96 putplaten van het halve gebied zoals beschreven in stap 4.2. Na het incuberen van de plaat in een orbitale shaker gedurende 24 uur, werd de persistertest uitgevoerd met behulp van een generieke vlakke bodem 96 putplaat (zie stap 4.3). De osmolyten en de concentratie die hier wordt getest, zijn gekozen op basis van onze vorige studie19, waar we stap 4.1 en 4.3 hebben uitgevoerd met behulp van de PM-9-plaat die verschillende osmolyten in verschillende concentraties bevat (natriumchloride, kaliumchloride, natriumsulfaat, ethyleenglycol, natriumformate, ureum, natriumlactaat, natriumfosfaat, natriumbenzoaat, ammoniumsulfaat, natriumnitriet). De eerste kolom in figuur 2A toont de CFU-tellingen van de controlegroep. De tweede kolom vertegenwoordigt een toestand waarbij cellen werden gekweekt in 100 mM natriumnitraat; deze toestand bleek eerder de persistentieniveaus19enigszins te verhogen . De derde kolom vertegenwoordigt een aandoening waarbij cellen werden gekweekt in 60 mM natriumnitriet, en deze aandoening bleek eerder de persistentieniveaus aanzienlijk te verlagen in vergelijking met controles19. Figuur 2B is een grafische weergave van de CFU-gegevens verkregen uit de agarplaten. Figuur 2C toont de persistente fracties van de celculturen getest in 96 putplaten. Om de fracties te berekenen, werden persistentertellingen genormaliseerd tot de celtellingen verkregen vóór de antibioticabehandelingen. Figuur 3 toont respectievelijk de bifasische kill curven en de persistenterfracties voor de testculturen die in verbijsterde kolven worden uitgevoerd. In deze experimenten werden cellen eerst gekweekt in 25 ml gemodificeerd LB-medium met de aangegeven osmolyten in verbijsterde kolven van 250 ml gedurende 24 uur, waarna de cellen werden overgebracht naar persistenter-assay kolven voor persistenter-inventarisatie zoals beschreven in Protocol 5.

Figure 1
Figuur 1: De experimentele procedure. Cellen uit een bevroren celvoorraad werden 's nachts (12 uur) gekweekt in vers LB-medium. Om 12 uur werd de nachtcultuur verdund (1:100) in 25 ml gemodificeerd LB-medium en gekweekt tot OD600=0,5. Deze propagatiestap werd twee keer herhaald. Na de laatste vermeerderingsstap werden de exponentiële fasecellen (bij OD600=0,5) verdund (1:100) in vers gemodificeerd LB-medium in respectievelijk een verbijsterde kolf van 250 ml en een centrifugebuis van 50 ml. De celsuspensie in de verbijsterde kolf van 250 ml werd behandeld met 5 μg/ml OFX om persistenten te kwantificeren. De celsuspensie in de centrifugebuis van 50 ml werd overgebracht naar microarrays en gedurende 24 uur geïncubeerd in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C. De cellen van de microarrays werden vervolgens overgebracht naar persistenter-assay platen om persistenten te kwantificeren. Dit cijfer is gemaakt met behulp van biorender.com. Dit cijfer is gewijzigd in onze vorige publicatie19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Microarray experimenten. (A) Cellen werden voor het eerst gekweekt in gemodificeerd LB-medium met of zonder aangegeven osmolyten in een half-gebied 96 putplaat gedurende 24 uur. De cellen werden vervolgens overgebracht naar een generieke flat-bottom 96 putplaat en behandeld met 5 μg/ml OFX gedurende 6 uur. Voor en na de behandeling van 6 uur werden de cellen serieel verdund in PBS, geplateerd op agarplaten en gedurende 16 uur geïncubeerd bij 37 °C. Elke voorwaarde heeft 8 technische replica's. (B) CFU-metingen werden uitgevoerd om respectievelijk de effecten van osmolyten op de levensvatbaarheid en persistentie van cellen te beoordelen. De rechte lijn geeft de detectielimiet (600 CFUs) aan. (C) De grafiek geeft de persistenterfracties van de celculturen weer, berekend door de verhouding van de CFU-tellingen na en vóór ofx-behandeling te nemen. De persistentiefractie van de celkweek met 60 mM natriumnitriet werd niet berekend omdat het persistentieniveau onder de detectiegrens ligt. Elk gegevenspunt werd aangeduid met gemiddelde waarde ± standaardafwijking, berekend op basis van 8 technische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Validatie experimenten. (A) Exponentiële fasecellen werden overgebracht naar 25 ml vers gemodificeerd LB-medium met geïndiceerde osmolyten in verbijsterde kolven van 250 ml en gedurende 24 uur gekweekt. Vervolgens werden de cellen verdund (1:100) in verbijsterde kolven van 250 ml met 25 ml gemodificeerd LB-medium en gedurende 6 uur behandeld met 5 μg/ml OFX. De CFU-tellingen in de testculturen werden elk uur gecontroleerd om bifasische kill curven te genereren. * geeft de toestand aan die de OFX-persistentieniveaus aanzienlijk beïnvloedt in vergelijking met no-osmolyte-controles (tweezijdige ongelijke variantie t-test, p<0.05). (B) De grafiek geeft de persistente fracties van de culturen weer. Elk gegevenspunt werd aangeduid met gemiddelde waarde ± standaardafwijking, berekend op basis van 3 biologische replica's. Dit cijfer is gewijzigd in onze vorige publicatie19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven persistentietest met hoge doorvoer is ontwikkeld om de effecten van verschillende chemicaliën op de persistentie van E. coli te verduidelijken. Naast commerciële PM-platen kunnen microarrays handmatig worden geconstrueerd zoals beschreven in stap 4.2. Bovendien is het hier gepresenteerde protocol flexibel en kan het worden gebruikt om andere microarrays te screenen, zoals medicijnpanelen en celbibliotheken, die in 96 putplaatformaten zijn. De experimentele omstandigheden, waaronder de groeifase, de inentingssnelheid en het medium, kunnen worden aangepast om deze bibliotheken te testen. Als men bijvoorbeeld een celbibliotheek wil screenen, zoals Keio E. coli knockout collection23,kunnen ze eerst de stammen van de bibliotheek overbrengen naar 96 putplaten met verse media, met behulp van een meerkanaals pipet. Zodra de cellen de gewenste groeifase (bijv. exponentiële of stationaire fase) hebben bereikt, worden de cellen vervolgens overgebracht naar persistenter-assay-platen zoals beschreven in stap 4.3 om de persistentieniveaus van de knock-outstammen op te sommen. Op dezelfde manier kan deze strategie worden gebruikt om de E. coli Promoter-collectie 24 (een bibliotheek van fluorescerende reporterstammen in 96 putplaatformaten) te screenen om promotors te identificeren die worden geactiveerd door antibiotica. Deze promotors kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door de fluorescentiesignalen van stammen in persistenter-assay-platen tijdens de antibioticabehandeling te meten.

In onze experimenten gebruikten we een gemodificeerde LB (zonder NaCl) om elk extra effect te voorkomen dat zou kunnen voortvloeien uit NaCl, gezien het feit dat de microarrays al verschillende osmolyten hebben. Hoewel nacl in regulier LB-medium bekend staat als goed voor het behoud van de membraanintegriteit van cellen, is gemeld dat NaCl met een bereik van 0-1% een minimaal effect heeft op de celgroei25. Bovendien hebben de resultaten van propidiumjodide (PI) kleuring en persistentietesten in onze vorige studie aangetoond dat de afwezigheid van NaCl de membraanintegriteit en de persistentie van E. coli-cellen niet significant beïnvloedt19. Deze wijziging is specifiek aangebracht om tegemoet te komen aan de zorgen in ons onderzoek en kan worden gewijzigd op basis van de aard van het onderzoek.

We hebben ook een methode aangepast die is ontwikkeld door Keren et al.5 om reeds bestaande persistenten in onze celculturen te elimineren voorafgaand aan inenting in de microarrays. Van persistenten van type I is bekend dat ze worden gegenereerd tijdens de stationaire fase; daarom zou de directe inenting van de cellen uit nachtelijke culturen in microarrayplaten een aanzienlijk aantal persistenten overbrengen, wat de effecten van osmolyten kan belemmeren. Met de experimenten met de verdunnings-/groeicyclus (zie Protocol 2) konden we deze reeds bestaande persistenten die voortkomen uit de overnight-culturen aanzienlijk verminderen19. We merken op dat we de cellen gedurende 24 uur in microarrayplaten hebben gekweekt om alle persistenten te kunnen tellen, inclusief type I-varianten die tijdens de stationaire fase worden gevormd in aanwezigheid van osmolyten. Deze aangepaste technieken kunnen echter altijd worden aangepast, afhankelijk van de aard van het onderzoek.

We behandelden de cellen in microarrays met 5 μg/ml OFX om de persistenten op te sommen. Aangezien de wasprocedure om het antibioticum uit 96 monsters te verwijderen zeer arbeidsintensief zou zijn, werden cellen na de behandeling serieel verdund in PBS zonder te wassen (zie stap 4.2). Deze procedure verdund de OFX-concentratie meer dan 30 keer. De verdunde celsuspensies werden vervolgens geplateerd op antibioticavrije agarplaten waar de OFX verder werd verspreid. Onze voorstudies waarbij we deze experimenten met en zonder wassen herhaalden, hebben geverifieerd dat deze seriële verdunningsmethode geen invloed had op de persistentieniveaus19.

Tijdens het pipetten met meerdere kanalen in 96 putplaten moet men de celsuspensingen zorgvuldig mengen om een homogene celverdeling te behouden. Om dit te doen, afhankelijk van het werkvolume, zou het nuttig zijn om het minimale aantal pipetten op te merken dat nodig is om de oplossing homogeen te maken. Hiervoor voerden we een eenvoudig controle-experiment uit waarbij we de pipetten (op en neer) controleerden door een kleurstofmolecuul in PBS en medium te verspreiden onder de hier bestudeerde omstandigheden. Bovendien, als we werken met complexere omgevingen zoals pH-buffers, raden we aan om de pH van de celkweek voor en tijdens de incubatie in een shaker te meten, omdat de celcultuur na verloop van tijd meestal erg alkalisch is (pH ≈ 8). Dit kan een idee geven van de kwaliteit en het pH-bereik van de gebruikte buffer. Om telbare CFUs op agarplaten uit de tests met hoge doorvoer te verkrijgen, moeten bovendien bepaalde omstandigheden, zoals de celinentingssnelheid, leeftijd van culturen en seriële verdunningsparameters (PBS-volume, verdunningssnelheden en het aantal verdunningsstappen, enz.) worden geoptimaliseerd voordat de microarrays worden getest. Ten slotte moeten de resultaten van de microarrays verder worden gevalideerd in kolven, aangezien het volume van de cultuur, het oppervlak en de beluchting in een plaat van 96 putten extra effecten op de waargenomen resultaten kunnen hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

We willen de leden van Orman Lab bedanken voor hun waardevolle inbreng tijdens dit onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door de NIH/NIAID K22AI125468 career transition award en een University of Houston startup grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14-ml test tube Fisher Scientific 14-959-1B
E. coli strain MG1655 Princeton University Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-5161
Gas permeable sealing membrane VWR 102097-058 Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate VWR 82050-062
LB agar Fisher Scientific BP1425-2 Molecular genetics grade
Ofloxacin salt VWR 103466-232 HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) Biolog N/A PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-0161
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500 Certified ACS grade
Sodium nitrate Fisher Scientific AC424345000 ACS reagent grade
Sodium nitrite Fisher Scientific AAA186680B 98% purity
Square petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Tryptone Fisher Scientific BP1421-500 Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader Thermo Fisher Scientific VLBL00D0 Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-100 Molecular genetics grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
  2. Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
  3. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
  4. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  5. Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
  6. Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
  7. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  8. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  9. Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
  10. Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
  11. Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
  12. Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
  13. Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
  14. Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
  15. Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
  16. Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
  17. Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
  18. Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
  19. Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
  20. Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
  21. Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
  22. Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
  23. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
  24. Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
  25. Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).

Tags

Retractie persisters high-throughput screening fenotype microarrays pH osmolyten antibiotica
High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karki, P., Orman, M. A.… More

Karki, P., Orman, M. A. High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence. J. Vis. Exp. (168), e61597, doi:10.3791/61597 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter