Summary
I detta metoddokument presenterar vi en screeningstrategi med hög genomströmning för att identifiera kemiska föreningar, såsom osmolyter, som har en betydande inverkan på bakteriell persistens.
Abstract
Bakteriell persisters definieras som en liten subpopulation av fenotypiska varianter med förmågan att tolerera höga koncentrationer av antibiotika. De är ett viktigt hälsoproblem eftersom de har associerats med återkommande kroniska infektioner. Även om stokastisk och deterministisk dynamik av stress-relaterade mekanismer är kända för att spela en betydande roll i persistens, mekanismer som ligger till grund för fenotypiska övergången till/från persistens tillstånd är inte helt förstådda. Även om beständighetsfaktorer som utlöses av miljösignaler (t.ex. utarmning av kol-, kväve- och syrekällor) har studerats i stor utsträckning, har osmolytornas inverkan på persistens ännu inte fastställts. Med hjälp av mikroarrays (dvs. 96 brunnsplattor som innehåller olika kemikalier) har vi utformat ett tillvägagångssätt för att belysa effekterna av olika osmolyter på Escherichia coli persistens på ett högt genomströmningssätt. Detta tillvägagångssätt är omvälvande eftersom det lätt kan anpassas för andra screeningsystem, såsom läkemedelspaneler och gen knockout-bibliotek.
Introduction
Bakteriekulturer innehåller en liten subpopulation av persisterceller som tillfälligt är toleranta mot ovanligt höga nivåer av antibiotika. Persisterceller är genetiskt identiska med deras antibiotikakänsliga släktingar, och deras överlevnad har tillskrivits övergående tillväxthämning1. Persister celler upptäcktes först av Gladys Hobby2 men termen användes först av Joseph Bigger när han identifierade dem i penicillin-behandlade Staphylococcus pyogenes kulturer3. En seminal studie publicerad av Balaban et al.4 upptäckte två persistertyper: typ I-varianter som främst bildas genom passage genom den stationära fasen och typ II-varianter som kontinuerligt genereras under den exponentiella tillväxten. Persisters detekteras av clonogenic överlevnadsanalyser, där odlingsprover tas med olika intervall under antibiotikabehandlingar, tvättas och pläteras på ett typiskt tillväxtmedium för att räkna de överlevande cellerna som kan kolonisera i avsaknad av antibiotika. Förekomsten av persisters i en cellkultur bedöms av en bifasiskdödskurva 4,5 där det första exponentiella förfallet indikerar döden av antibiotikakänsliga celler. Men mördartrenden minskar med tiden, vilket så småningom leder till en platåregion som representerar de överlevande persistercellerna.
Persister celler har associerats med olika sjukdomar såsom tuberkulos6,cystisk fibros7,candidiasis8 och urinvägsinfektioner9. Nästan alla mikroorganismer som testats hittills konstaterades generera persister fenotyper, inklusive högpatogen Mycobacterium tuberkulos6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 och Candida albicans8. Nyligen genomförda studier ger också bevis för ökningen av multiresistenta mutanter från persister subpopulationer11,12. Betydande insatser på detta område har visat att uthållighetsmekanismerna är mycket komplexa och olika. Både stokastiska och deterministiska faktorer i samband med SOS svar13,14,reaktiva syre arter (ROS)15,toxin/antitoxin (TA) system16,autofagi eller självsmälta17 och ppGpp-relaterade strängasvar 18 är kända för att underlätta persister bildas.
Trots betydande framsteg i förståelsen av den envishet fenotyp, effekterna av osmolyter på bakteriell persistens har inte förståtts fullt ut. Eftersom upprätthållandet av optimalt osmotiskt tryck är en nödvändighet för cellernas tillväxt, funktion och överlevnad, kan en djupgående studie av osmolyter leda till potentiella mål för anti-persister strategier. Även om mödosam screening med hög genomströmning är ett mycket effektivt tillvägagångssätt för att identifiera metaboliter och andra kemikalier som spelar en avgörande roll i den envisa fenotyp19,20. I detta arbete kommer vi att diskutera vår publicerade metod19, där vi har använt mikroarrays, dvs 96 brunnsplattor som innehåller olika osmolyter (t.ex. natriumklorid, urea, natriumnitrit, natriumnitrat, kaliumklorid), för att identifiera osmolyter som väsentligt påverkar E. coli persistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av tillväxtmedium, avloxacinlösning och E. coli-celllager
- Vanligt Luria-Bertani -medium ( LB): Tillsätt 10 g/L tryptone, 10 g/L natriumklorid (NaCl) och 5 g/L jästextrakt i avjoniserat (DI) vatten. Sterilisera mediet genom autoklavering.
- LB agarplattor: Tillsätt 10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g/L jästextrakt och 15 g/L agar i DI-vatten och sterilisera mediet genom autoklavering. Vid önskad temperatur (~55 °C), häll ~30 ml agarmedium i fyrkantiga plattor (10 x 10 cm). Torka plattorna och förvara vid 4 °C.
- Modifierat LB-medium: Tillsätt 10 g/L tryptone och 5 g/L jästextrakt i DI-vatten. Sterilisera mediet genom autoklavering.
- Modifierat LB-medium inklusive osmolyt: Blanda 2x modifierat LB-medium med en 2x osmolytlösning i lika stora volymer. För att förbereda 2x modifierat LB-medium, tillsätt 20 g/L tryptone och 10 g/L jästextrakt i DI-vatten och sterilisera genom autoklavering. För att förbereda 2x osmolytlösningen, lös upp osmolyten av intresse (2x mängd) i DI-vatten och filtrera sedan sterilisera lösningen.
OBS: Osmolyten av intresse och dess koncentrationer kan bestämmas från fenotyp Microarray screening analyser (se protokoll 4). Den testade osmolyten och den tillhörande 2x-koncentrationen kan dock justeras beroende på forskningens natur. För att studera effekten av 1 mM natriumklorid skulle till exempel en 2x osmolytlösning vara en 2 mM natriumkloridlösning. - Ofloxacin stamlösning (5 mg/ml): Tillsätt 5 mg ofloxacinsalt (OFX) i 1 ml DI-vatten. Tillsätt 10 μL natriumhydroxid på 10 M för att öka lösligheten hos OFX i vatten och filtrera sedan sterilisera lösningen. Förbered alikvoter och förvara vid -20 °C.
OBS: Ofloxacin är ett kinolalonantibiotikum som har använts i stor utsträckning för både växande och icke-växande bakterieceller14,21. Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) av OFX för E. coli MG1655-celler ligger inom intervallet 0,039–0,078 μg/ml19,20. Observera också att andra antibiotika som ampicillin och kanamycin ofta används i persister forskning. Valet av antibiotika beror på studiens natur. - E. coli (E. coli) MG1655-celllager: Inokulera 2 ml vanligt LB-medium med en enda koloni i ett 14 ml-provrör (snäppskyddat) och odla cellerna i en orbital shaker vid 250 varv/min och 37 °C. När cellerna når den stationära fasen, blanda 500 μL av cellkulturen med 500 μL 50% glycerol (steril) i en kryogen injektionsflaska och förvara vid -80 °C.
2. Förökning av celler för att eliminera befintliga persisters
- För att förbereda en över natten kultur, skrapa en liten mängd celler från en frusen cell lager med en steril pipettspets (tina inte glycerolcellsbeståndet) och inokulera cellerna i 2 ml modifierat LB-medium i ett 14 mL snap-capped provrör. Odla cellerna i en orbital shaker vid 250 varv/min och 37 °C i 12 timmar.
- Första förökningen
- Efter 12 timmar överför du 250 μL över natten kultur till 25 ml färskt modifierat LB-medium i en 250 ml baffelkolv täckt med en steril aluminiumfolie.
- Odla cellkulturen i en orbital shaker vid 250 varv/min och 37 °C tills cellerna når den mellersta exponentiella fasen (OD600 = 0,5).
- Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600)med hjälp av en mikroplatta var 30:e minut.
- Andra förökningen
- Vid OD600 = 0,5, späd 250 μL cellkultur från den första kolven till 25 ml färsk modifierat LB-medium i en 250 ml baffelkolv.
- Odla den andra cellkulturen i en orbital shaker vid 250 varv/min och 37 °C tills OD600=0,5.
- Mät den optiska densiteten var 30:e minut.
OBS: En över natten kultur kan ha en betydande mängd persister celler4,5,22. Utspädnings-/tillväxtcykelmetoden5 som beskrivs ovan kan användas för att eliminera dessa befintliga persisters innan cellerna överförs till mikroarrayer. Deras eliminering kan valideras genom att kvantifiera persisternivåer av kulturer över natten med den analys som beskrivs i protokoll 3. Denna metod har redan validerats i en tidigare studie19.
3. Validera eliminering av befintliga persisterceller
- Efter den andra förökningen (se steg 2.3) späd 250 μL av cellkulturen (OD600 = 0,5) i 25 ml färsk modifierat LB-medium i en 250 ml förbryllad kolv.
OBS: För manöverorgan, späd 250 μL över nattens kultur (se steg 2.1) i 25 ml färsk modifierat LB-medium i en 250 ml baffelkolv. Innan cellerna överförs till kolven bör celltätheten i nattkulturen justeras i färskt modifierat LB-medium för att erhålla OD600 = 0,5. - Tillsätt 25 μL OFX-stamlösning (5 mg/ml) i cellfjädringen och skaka kolven försiktigt för att göra analyskulturen homogen. Den slutliga koncentrationen av OFX är 5 μg/ml i analyskulturen.
- Inkubera analyskulturen i en orbital shaker vid 250 varv/min och 37 °C.
- Vid varje timme under behandlingen (inklusive 0 timmar, tidspunkten innan OFX tillsätts i analyskulturen) överför du 1 ml av analyskulturen från kolven till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera analyskulturen i mikrocentrifugröret vid 17 000 x g i 3 minuter.
- Ta försiktigt bort 950 μL av supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Tillsätt 950 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i mikrocentrifugröret.
- Upprepa tvättstegen 3,5-3,7 för totalt 3x tills antibiotikakoncentrationen är lägre än den lägsta hämmande koncentrationen (MIC).
- Efter den slutliga tvätten, återanvänd cellpelleten i 100 μL PBS-lösning, vilket resulterade i ett 10x koncentrerat prov.
- Ta 10 μL av cellfjädringen och späd sex gånger i 90 μL PBS-lösning med en 96 väl rund bottenplatta.
- Spot 10 μL utspädda cellupphängningar på antibiotikafria färska agarplattor. För att öka detektionsgränsen, plätera återstående 90 μL cellfjädring på en färsk agarplatta.
- Inkubera agarplattorna vid 37 °C i 16 timmar och räkna sedan kolonibildande enheter (CFUs). Redovisa utspädningshastigheterna vid beräkning av det totala antalet cfus i 1 ml analyskultur. Kill kurvor genereras genom plottning av logaritmic CFU värden med avseende på varaktigheten av antibiotikabehandling.
OBS: En 6 h OFX-behandling är tillräcklig för att erhålla en bifasisk killkurva för E. coli-celler 19,20. Persisternivån för förökade celler (mätt med CFU-räkningar vid 6 h) bör vara betydligt lägre än för nattkulturen. De procedurer som beskrivs i protokoll 2 och 3 kan utföras med vanlig LB beroende på forskningsdesignen.
4. Mikroarrayplatta screenings
- Förbereda mikroarraycellskulturer
- Överför 250 μL exponentiella fasceller till 25 ml färskt modifierat LB-medium i ett 50 ml centrifugeringsrör. Blanda försiktigt cellfjädringen för att göra den homogen.
OBS: De exponentiella fascellerna (OD600 = 0,5) erhålls från det andra spridningssteget (se steg 2.3). - Överför den utspädda cellupphängningen till en steril 50 ml-reservoar.
- Använd en flerkanalspipett och överför 150 μL av cellfjädringen till varje brunn i en mikroarray, dvs.
OBS: Brunnar som inte har osmolyter fungerar som kontroller. - Täck mikroarrayen med ett gaspermeabelt tätningsmembran.
- Inkubera plattan i en orbital shaker vid 37 °C och 250 varv/min i 24 timmar.
OBS: I dessa experiment användes kommersiellt tillgängliga plattor, såsom Fenotyp Microarrays (PM-9 och PM-10) som inkluderar ett brett spektrum av osmolyter, pH-buffertar och andra kemikalier i torkat tillstånd vid olika koncentrationer. Dessa mikroarrays är i halvområde 96 brunn plåtformat. Odlingsvolymerna bör justeras beroende på vilken typ av plattor som används. Mikroarrays kan också genereras manuellt (se nedan).
- Överför 250 μL exponentiella fasceller till 25 ml färskt modifierat LB-medium i ett 50 ml centrifugeringsrör. Blanda försiktigt cellfjädringen för att göra den homogen.
- Manuell beredning av mikroarrayplattor
- Överför 75 μL 2x osmolytelösningar till brunnarna på en halv yta 96 brunnsplatta.
- Överför 500 μL exponentiella fasceller till 25 ml 2x modifierat LB-medium i ett 50 ml centrifugeringsrör. Blanda försiktigt cellfjädringen för att göra den homogen.
OBS: Vaccinationshastigheten justerades för att överensstämma med det mikroarrayscreeningsprotokoll som beskrivs i 4.1. - Tillsätt 75 μL av cellfjädringen i varje brunn på halvområdet 96 brunnsplatta som innehåller 2x osmolytelösningar.
- Inkubera plattan i en orbital shaker vid 37 °C och 250 varv/min i 24 timmar.
- Förbereda persisteranalysplattor
- Förbered 25 ml modifierat LB-medium som innehåller 5 μg/ml OFX i ett 50 ml centrifugeringsrör och överför detta medium till en steril behållare.
- Överför 190 μL modifierat LB-medium med OFX från behållaren till varje brunn på en generisk plattbottnad 96 brunnsplatta (persister-analysplatta) med en flerkanalspipett.
- Ta bort mikroarrayen från skakapparaten (efter odling i 24 timmar) och överför 10 μL cellkulturer från mikroarrayen till brunnarna på persister-analysplattan, som innehåller modifierat LB-medium med OFX.
- Ta 10 μL cellupphängningar från persister-analysplattan och späd tre gånger i 290 μL PBS-lösning med en rund botten 96 brunnsplatta och en flerkanalspipett.
- Efter seriell utspädning, punkt 10 μL av alla seriellt utspädda cellupphängningar på antibiotikafria färska agarplattor med en flerkanalspipett.
- Inkubera persister-analysplattan (beredd i steg 4.3.3) i en orbital shaker vid 37 °C och 250 varv/min i 6 timmar efter att ha täckt plattan med ett gaspermeabelt tätningsmembran.
- Efter 6 h inkubation i en skakapparat, ta ut persister-analysplattan och upprepa stegen 4.3.4-4.3.5.
- Inkubera agarplattorna i 16 h vid 37 °C och räkna sedan CFUs. CFU nivåer före och 6 h efter antibiotiska behandling gör det möjligt att beräkna persister fraktion i varje brunn. CFU räknas före OFX-behandlingen hjälper också till att bedöma effekterna av osmolyter och på E. coli livskraft.
5. Validera de identifierade villkoren
- Överföring av 250 μL av de exponentiella fascellerna från steg 2,3 till 25 ml färskt modifierat LB-medium som innehåller osmolyten som identifierats från mikroarrayscreeningen (se protokoll 4).
- Inkubera kolven i en orbital shaker vid 250 varv/min och 37 °C i 24 timmar.
- Efter 24 timmar, ta bort kolven från skakapparaten och överför 250 μL av cellkulturen till 25 ml färsk modifierat LB-medium i en 250 ml baffelkolv.
- Tillsätt 25 μL OFX-stamlösning (5 mg/ml) i cellfjädringen och skaka kolven försiktigt för att göra analyskulturen homogen. Inkubera kolven i en skakapparat vid 37 °C och 250 varv/min.
- Överför varje timme under behandlingen 1 ml av analyskulturen från kolven till ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml.
- Centrifugera analyskulturen i mikrocentrifugröret vid 17 000 x g i 3 minuter.
- Ta bort 950 μL supernatant och tillsätt 950 μL PBS.
- Upprepa tvättstegen 5.6 och 5.7 för 3x.
- Efter den slutliga tvätten, återanvänd cellpelleten i 100 μL PBS-lösning.
- Ta 10 μL av cellfjädringen och späd 6x i 90 μL PBS-lösning med en 96 väl rund bottenplatta.
- Punkt 10 μL av de utspädda cellupphängningarna på en antibiotikafri färsk agarplatta. För att öka detektionsgränsen, plätera återstående 90 μL cellfjädring på en färsk agarplatta.
- Inkubera agarplattan vid 37 °C i 16 timmar och räkna sedan CFUs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 beskriver vårt experimentella protokoll. Utspädnings-/tillväxtcykelexperimenten (se protokoll 2) anpassades från en studie utförd av Keren et al.5 för att eliminera persisters som härrör från över natten kulturer. Figur 2A är en representativ bild av agarplattor som används för att bestämma CFU-nivåerna av cellkulturer före och efter OFX-behandling. I dessa experiment odlades celler i modifierat LB medium med osmolyter i halvområde 96 brunn plattor som beskrivs i steg 4.2. Efter att ha inkuberat plattan i en orbital shaker i 24 h utfördes persisteranalysen med en generisk platt botten 96 brunnsplatta (se steg 4.3). Osmolyterna och koncentrationen som testas här valdes baserat på vår tidigare studie19, där vi utförde steg 4.1 och 4.3 med PM-9-plattan som innehåller olika osmolyter vid olika koncentrationer (natriumklorid, kaliumklorid, natriumsulfat, etylenglykol, natriumformat, urea, natriumlaktat, natriumfosfat, natriumbensoat, ammoniumsulfat, natriumnitrit och natriumnitrat). Den första kolumnen i figur 2A visar CFU-antalet i kontrollgruppen. Den andra kolumnen representerar ett tillstånd där celler odlades i 100 mM natriumnitrat; detta tillstånd konstaterades tidigare öka persister nivåer19något . Den tredje kolumnen representerar ett tillstånd där celler odlades i 60 mM natriumnitrid, och detta tillstånd konstaterades tidigare avsevärt minska persisternivåerna jämfört med kontroller19. Figur 2B är en grafisk representation av CFU-data från agarplattorna. Figur 2C visar de persisterfraktioner av cellkulturerna som testats i 96 brunnsplattor. För att beräkna fraktionerna normaliserades persisterantalet till de cellantal som erhållits före antibiotikabehandlingarna. Figur 3 visar de bifasiska killkurvorna respektive de bestående fraktionerna för de analyskulturer som utförs i förbryllade flaskor. I dessa experiment odlades cellerna först i 25 ml modifierat LB-medium med de angivna osmolyterna i 250 ml förbryllade kolvar i 24 timmar, och sedan överfördes cellerna till persister-assay-flaskor för persister uppräkning enligt beskrivningen i protokoll 5.
Figur 1: Försöksförfarandet. Celler från ett fryst cellbestånd odlades över natten (12 h) i färskt LB-medium. Vid 12 h späddes övernattningskulturen (1:100) i 25 ml modifierat LB-medium och odlades till OD600=0,5. Detta spridningssteg upprepades två gånger. Efter det slutliga förökningssteget späddes de exponentiella fascellerna (vid OD600=0,5) ut (1:100) i färskt modifierat LB-medium i en 250 ml baffelkolv respektive ett 50 ml centrifugrör. Cellupphängningen i den 250 ml förbryllade kolven behandlades med 5 μg/ml OFX för att kvantifiera persisters. Cell suspension i 50 mL centrifuge röret överfördes till microarrays och inkuberades i 24 h i en orbital shaker vid 250 rpm och 37 °C. Cellerna från mikroarrays överfördes sedan till persister-assay plattor för att kvantifiera persisters. Den här siffran skapades med biorender.com. Denna siffra har ändrats från vår tidigare publikation19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Mikroarrayexperiment. A)Cellerna odlades först i modifierat LB-medium med eller utan angivna osmolyter i en halvarena 96 brunnsplatta i 24 timmar. Cellerna överfördes sedan till en generisk plattbottnad 96 brunnsplatta och behandlades med 5 μg/ml OFX i 6 timmar. Före och efter 6 h behandling, celler var serially späds i PBS, pläteras på agar plattor och inkuberas vid 37 °C för 16 h. Varje villkor har 8 tekniska replikat. B)CFU-mätningar utfördes för att bedöma osmolyternas effekter på cellens livskraft respektive persistens. Den raka linjen anger detektionsgränsen (600 CFUs). (C) Diagrammet representerar de kvarhållande fraktionerna av cellkulturerna, beräknade genom att ta förhållandet mellan CFU-räkningarna efter och före OFX-behandlingen. Den persister fraktion av cellkulturen som har 60 mM natriumnitrid beräknades inte eftersom dess persister nivå ligger under detektionsgränsen. Varje datapunkt betecknades med medelvärde för ± standardavvikelse, beräknad från 8 tekniska replikat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Valideringsexperiment. A)Exponentiella fasceller överfördes till 25 ml färsk modifierat LB-medium med angivna osmolyter i 250 ml bafflade flaskor och odlades i 24 timmar. Sedan späddes cellerna ut (1:100) i 250 ml förbryllade flaskor som innehöll 25 ml modifierat LB-medium och behandlades med 5 μg/ml OFX i 6 timmar. CFU-räkningarna i analyskulturerna övervakades varje timme för att generera bifasiska dödskurvor. * indikerar det tillstånd som väsentligt påverkar OFX-persisternivåerna jämfört med osmolytkontroller utan osmolyt (tvåsidiga ojämna varians t-test, p<0,05). (B) Diagrammet representerar de kvarhållande fraktionerna av kulturerna. Varje datapunkt betecknades med medelvärde för ± standardavvikelse, beräknad från 3 biologiska replikat. Denna siffra har ändrats från vår tidigare publikation19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den höga genomströmning persister analys beskrivs här utvecklades för att klargöra effekterna av olika kemikalier på E. coli persistens. Förutom kommersiella PM-plattor kan mikroarrayer konstrueras manuellt enligt beskrivningen i steg 4.2. Dessutom är protokollet som presenteras här flexibelt och kan användas för att screena andra mikroarrays, såsom läkemedelspaneler och cellbibliotek, som finns i 96 brunnsplåtformat. Försöksförhållandena inklusive tillväxtfasen, vaccinationshastigheten och mediet kan justeras för att testa dessa bibliotek. Till exempel, om man vill screena ett mobilbibliotek, till exempel Keio E. coli knockout samling23, kan de först överföra stammarna från biblioteket till 96 brunnsplattor som innehåller färska medier, med hjälp av en flerkanalspipett. När cellerna når önskad tillväxtfas (t.ex. exponentiell eller stationär fas) överförs cellerna sedan till persister-assay-plattor enligt beskrivningen i steg 4.3 för att räkna upp de persisteriska nivåerna av knockout-stammarna. På samma sätt kan denna strategi användas för att screena E. coli Promoter-samlingen 24 (ett bibliotek med fluorescerande reporterstammar i 96 brunnsplåtformat) för att identifiera promotors som aktiveras av antibiotika. Dessa promotors kan lätt detekteras genom att mäta fluorescenssignalerna av stammar i persister-analysplattor under antibiotikabehandlingen.
I våra experiment använde vi en modifierad LB (saknar NaCl) för att undvika ytterligare effekt som kan uppstå från NaCl, med tanke på att mikroarrayerna redan har olika osmolyter. Även om NaCl i vanligt LB medium är känt för att vara bra för att bevara cellernas membranintegritet, har det rapporterats att NaCl vid 0-1% intervall har en minimal effekt på celltillväxt25. Dessutom har resultat från propidium iodid (PI) färgning och persisters analyser i vår tidigare studie visat att frånvaron av NaCl inte väsentligt påverkar membranets integritet och persistensen av E. coli celler19. Denna ändring gjordes specifikt för att ta itu med problemen i vår studie och kan ändras baserat på forskningens natur.
Vi har också anpassat en metod utvecklad av Keren et al.5 för att eliminera befintliga persisters i våra cellkulturer före inokulering i mikroarrayerna. Typ I-persisters är kända för att genereras under den stationära fasen; Därför skulle den direkta inokuleringen av cellerna från över natten kulturer till mikroarrayplattor överföra ett betydande antal persisters, vilket kan hindra effekterna av osmolyter. Med utspädnings-/tillväxtcykelexperimenten (se protokoll 2) kunde vi avsevärt minska dessa befintliga persisters som härrör från övernattningskulturerna19. Vi noterar att vi har odlat cellerna i mikroarrayplattor i 24 h för att kunna räkna alla persisters, inklusive typ I-varianter som bildas under den stationära fasen i närvaro av osmolyter. Dessa anpassade tekniker kan dock alltid modifieras beroende på studiens natur.
Vi behandlade cellerna i mikroarrays med 5 μg/mL OFX för att räkna upp persisters. Eftersom tvättproceduren för att ta bort antibiotikumet från 96 prover skulle vara mycket arbetsintensiv, späddes celler efter behandlingen seriellt i PBS utan tvätt (se steg 4. 2). Detta förfarande spädde ut OFX-koncentrationen mer än 30 gånger. De utspädda cellupphängningar pläterades sedan på antibiotikafria agarplattor där OFX spreds ytterligare. Våra preliminära studier där vi upprepade dessa experiment med och utan tvätt har verifierat att denna seriell utspädningsmetod inte påverkade persisternivåerna19.
Under flerkanalsrörningen i 96 brunnsplattor bör man noggrant blanda cellupphängningen för att upprätthålla en homogen cellfördelning. För att göra detta, beroende på arbetsvolymen, skulle det vara fördelaktigt att notera det minsta antalet pipetting som behövs för att göra lösningen homogen. För detta ändamål genomförde vi ett enkelt kontrollexperiment där vi övervakade pipetting (upp och ner) genom att sprida en färgmolekyl i PBS och medium under de förhållanden som studerades här. Dessutom, om du arbetar med mer komplexa miljöer som pH-buffertar, föreslår vi att man mäter cellkulturens pH före och under inkubationen i en shaker eftersom cellkulturen tenderar att vara mycket alkalisk (pH ≈ 8) över tid. Detta kan ge en uppfattning om kvaliteten samt pH-intervallet för den buffert som används. För att erhålla räknebara CFUs på agarplattor från höggenomströmningsanalyserna bör dessutom vissa villkor, såsom cellookuleringshastighet, kulturålder och seriell utspädningsparametrar (PBS-volym, utspädningshastigheter och antalet utspädningssteg etc.) optimeras innan mikroarrayerna testas. Slutligen bör de resultat som erhålls från mikroarrayerna valideras ytterligare i kolvar, eftersom volymen av odling, yta och luftning i en 96 brunnsplatta kan få ytterligare effekter på de observerade resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Orman Lab för deras värdefulla insatser under denna studie. Denna studie finansierades av NIH/ NIAID K22AI125468 karriärövergångsutmärkelse och ett university of Houston startup-bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
- Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
- Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
- Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
- Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
- Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
- Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
- Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
- Gerdes, K., Maisonneuve, E.
- Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
- Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
- Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
- Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
- Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
- Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
- Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
- Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).
