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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

बैक्टीरियल हठ पर उनके प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए रासायनिक यौगिकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61597
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston

Summary

इस विधि पत्र में, हम ऑस्मोलाइट्स जैसे रासायनिक यौगिकों की पहचान करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग रणनीति प्रस्तुत करते हैं, जिसका बैक्टीरियल हठ पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।

Abstract

बैक्टीरियल स्ट्रॉटर्स को एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च सांद्रता को सहन करने की क्षमता के साथ फेनोटाइपिक वेरिएंट की एक छोटी उपजनसंख्या के रूप में परिभाषित किया जाता है। वे एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य चिंता का विषय है क्योंकि वे आवर्ती पुराने संक्रमणों से जुड़े हुए हैं। हालांकि तनाव से संबंधित तंत्र के stochastic और निर्धारक गतिशीलता हठ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है, के लिए निस्तेज राज्य से फेनोटाइपिक स्विच अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । जबकि पर्यावरण संकेतों (जैसे, कार्बन, नाइट्रोजन और ऑक्सीजन स्रोतों की कमी) द्वारा ट्रिगर हठ कारकों का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, दृढ़ता पर ओस्मोलाइट्स के प्रभावों का अभी निर्धारित किया जाना है । माइक्रोएरास (यानी, विभिन्न रसायनों से युक्त 96 अच्छी प्लेटों) का उपयोग करते हुए, हमने एस्चेरिचिया कोलाई हठ पर विभिन्न ओस्मोलाइट्स के प्रभावों को उच्च थ्रूपुट तरीके से स्पष्ट करने के लिए एक दृष्टिकोण तैयार किया है। यह दृष्टिकोण परिवर्तनकारी है क्योंकि इसे अन्य स्क्रीनिंग सरणी, जैसे दवा पैनलों और जीन नॉकआउट पुस्तकालयों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

बैक्टीरियल संस्कृतियों में कॉन्पॉर्सर कोशिकाओं की एक छोटी उपआबादी होती है जो एंटीबायोटिक दवाओं के असामान्य रूप से उच्च स्तर के लिए अस्थायी रूप से सहिष्णु होती है। सस्ट्रेटर कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से उनके एंटीबायोटिक-संवेदनशील किलों के समान हैं, और उनके अस्तित्व को क्षणिक विकास अवरोध1के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। सस्ट्रेटर कोशिकाओं को पहले ग्लैडिस हॉबी2 द्वारा खोजा गया था लेकिन इस शब्द का उपयोग पहली बार जोसेफ बड़ा द्वारा किया गया था जब उन्होंने उन्हें पेनिसिलिन-इलाज स्टेफिलोकोकस पायोजीन्स संस्कृतियों में पहचानाथा 3। बालबान एट अल द्वारा प्रकाशित एक मौलिक अध्ययन4 ने दो कंट्रास्टर प्रकारों की खोज की: प्रकार I वेरिएंट जो मुख्य रूप से स्थिर चरण के माध्यम से पारित होने से बनते हैं, और टाइप II वेरिएंट जो घातीय विकास के दौरान लगातार उत्पन्न होते हैं। काल्डर क्लोनोजेनिक अस्तित्व परख द्वारा पता लगाया जाता है, जिसमें एंटीबायोटिक उपचार के दौरान विभिन्न अंतरालों पर संस्कृति के नमूने लिए जाते हैं, धोए जाते हैं, और जीवित कोशिकाओं को गिनने के लिए एक विशिष्ट विकास माध्यम पर चढ़ाया जाता है जो एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव में उपनिवेश कर सकते हैं। कोशिका संस्कृति में बने रहने वालों के अस्तित्व का आकलन एक बिफेसिक किल कर्व4,5 द्वारा किया जाता है जहां प्रारंभिकघातीय क्षय एंटीबायोटिक-संवेदनशील कोशिकाओं की मौत को इंगित करता है। हालांकि, हत्या की प्रवृत्ति समय के साथ कम हो जाती है, अंततः एक पठार क्षेत्र है जो जीवित बनी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है के लिए अग्रणी ।

सस्ट्रेटर कोशिकाएं तपेदिक6, सिस्टिक फाइब्रोसिस7, कैंडिडियासिस8 और मूत्र पथ संक्रमण9जैसे विभिन्न रोगों से जुड़ी हुई हैं । अब तक परीक्षण किए गए लगभग सभी सूक्ष्मजीवों में अत्यधिक रोगजनक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक6, स्टेफिलोकोकस ऑरियस10, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा7 और कैंडिडा एल्बिकान8 शामिल हैं। हाल के अध्ययनों में भी11, 12 , 12तक बने रहने वाले उपजनसंख्या से बहु-प्रतिरोधी म्यूटेंट के उदय का प्रमाण प्रदान कियागयाहै । इस क्षेत्र में पर्याप्त प्रयासों से पता चला है कि हठ तंत्र अत्यधिक जटिल और विविध हैं; एसओएस प्रतिक्रिया13,14,प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)15,टॉक्सिन/एंटीटॉक्सिन (टीए) सिस्टम16,ऑटोफैगी या आत्म-पाचन 17 और पीपीजीपीपी से संबंधित कठोर प्रतिक्रिया18 से जुड़े स्टोचस्टिक और निर्धारक कारकों को संस्ट्रक गठन की सुविधा के लिए जानाजाता है।

हठ फेनोटाइप को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, बैक्टीरियल हठ पर ओस्मोलाइट्स के प्रभाव को पूरी तरह से समझ में नहीं आया है। चूंकि इष्टतम ऑस्मोटिक दबाव का रखरखाव कोशिकाओं के विकास, उचित कामकाज और अस्तित्व के लिए एक आवश्यकता है, इसलिए ऑस्मोलाइट्स का गहन अध्ययन विरोधी-संरक्षक रणनीतियों के लिए संभावित लक्ष्यों को जन्म दे सकता है। यद्यपि श्रमसाध्य, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग मेटाबोलाइट्स और अन्य रसायनों की पहचान करने के लिए एक बहुत प्रभावी दृष्टिकोण है जो हठ फेनोटाइप19,20में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस काम में, हम अपने प्रकाशित विधि19पर चर्चा करेंगे, जहां हमने माइक्रोरैयस का उपयोग किया है, यानी, विभिन्न ओस्मोलाइट्स (जैसे, सोडियम क्लोराइड, यूरिया, सोडियम नाइट्राइट, सोडियम नाइट्रेट, पोटेशियम क्लोराइड) युक्त 96 अच्छी प्लेटें, ओस्मोलाइट्स की पहचान करने के लिए जो ई कोलाई हठ को काफी प्रभावित करते हैं।

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Protocol

1. ग्रोथ मीडियम, ओलोक्सेसिन सॉल्यूशन और ई. कोलाई सेल स्टॉक्स की तैयारी

  1. नियमित लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम: ट्राइप्टोन के 10 ग्राम/एल, सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के 10 ग्राम/एल और डिओनाइज्ड (डीआई) पानी में खमीर निकालने के 5 ग्राम/एल जोड़ें । ऑटोक्लेविंग द्वारा माध्यम को स्टरलाइज करें।
  2. पौंड आगर प्लेटें: ट्राइप्टोन के 10 ग्राम/एल, एनएसीएल के 10 ग्राम/एल, खमीर निकालने के 5 ग्राम/एल और डीआई पानी में 15 ग्राम/एल एगर जोड़ें और ऑटोक्लेविंग द्वारा माध्यम को निष्फल करें । वांछित तापमान (~ 55 डिग्री सेल्सियस) पर, वर्ग प्लेटों (10 x 10 सेमी) में आगर माध्यम के ~ 30 एमएल डालें। प्लेटों को सुखाकर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. संशोधित पौंड माध्यम: डीआई पानी में 10 ग्राम/एल ट्राइप्टोन और 5 ग्राम/एल खमीर निकालने के जोड़ें । ऑटोक्लेविंग द्वारा माध्यम को स्टरलाइज करें।
  4. ऑस्मोलिट सहित संशोधित एलबी माध्यम: बराबर वॉल्यूम में 2x ऑस्मोलिटे समाधान के साथ 2x संशोधित एलबी माध्यम मिलाएं। 2x संशोधित पौंड माध्यम तैयार करने के लिए, डीआई पानी में 20 ग्राम/एल ट्राइप्टोन और 10 ग्राम/एल खमीर निकालने को जोड़ें और ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें । 2x ऑस्मोलिट समाधान तैयार करने के लिए, डीआई पानी में ब्याज (2x राशि) के ऑस्मोलिट को भंग करें, और फिर समाधान को फ़िल्टर करें।
    नोट: ब्याज और उसकी सांद्रता के ओस्मोलिट फेनोटाइप माइक्रोएरे स्क्रीनिंग परख से निर्धारित किया जा सकता है (प्रोटोकॉल 4 देखें) । हालांकि, परीक्षण ओस्मोलिटे और संबद्ध 2x एकाग्रता को शोध की प्रकृति के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 1 एमएमएम सोडियम क्लोराइड के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, 2x ओस्मोलिटे समाधान 2 एमएम सोडियम क्लोराइड समाधान होगा।
  5. ओलोक्सासिन स्टॉक सॉल्यूशन (5 मिलीग्राम/एमएल): डीआई पानी के 1 एमएल में 5 मिलीग्राम ओलोक्सासिन (ओएफएक्स) नमक डालें। पानी में ओएफएक्स की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए 10 मीटर सोडियम हाइड्रोक्साइड के 10 माइक्रोल जोड़ें, और फिर समाधान को फ़िल्टर करें। एलिकोट तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: Ofloxacin एक क्विनोलोन एंटीबायोटिक है जो व्यापक रूप से बढ़ती और गैर-बढ़ती जीवाणु कोशिकाओं14, 21दोनों के लिए उपयोग किया गया है। ई. कोलाई MG1655 कोशिकाओं के लिए ओएफएक्स की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) 0.039-0.078 μg/mL19,20के दायरे में है । यह भी ध्यान दें कि एम्पीसिलिन और कानमाइसिन जैसे अन्य एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग आमतौर पर क्रिस्ट्रेर रिसर्च में किया जाता है। एंटीबायोटिक दवाओं का चुनाव अध्ययन की प्रकृति पर निर्भर है।
  6. ई. कोलाई MG1655 सेल स्टॉक: 14 एमएल टेस्ट ट्यूब (स्नैप-कैप्ड) में एक कॉलोनी के साथ नियमित एलबी माध्यम के 2 एमएल का टीका करें और 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में कोशिकाओं को संस्कृति। जब कोशिकाएं स्थिर चरण तक पहुंचती हैं, तो क्रायोजेनिक शीशी में 50% ग्लाइसरोल (बाँझ) के 500 माइक्रोन के साथ सेल संस्कृति के 500 माइक्रोन को मिलाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पहले से मौजूद बने रहने वालों को खत्म करने के लिए कोशिकाओं का प्रचार

  1. एक रात की संस्कृति तैयार करने के लिए, एक बाँझ पिपेट टिप के साथ एक जमे हुए सेल स्टॉक से कोशिकाओं की एक छोटी राशि परिमार्जन (ग्लाइस्रोल सेल स्टॉक गल नहीं है), और एक 14 एमएल स्नैप-कैप्ड टेस्ट ट्यूब में संशोधित पौंड माध्यम के 2 एमएल में कोशिकाओं को टीका। संस्कृति 250 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर में कोशिकाओं और 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
  2. पहला प्रचार
    1. 12 घंटे के बाद, एक बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक २५० एमएल चकित फ्लास्क में ताजा संशोधित पौंड माध्यम के 25 एमएल के लिए रातोंरात संस्कृति के २५० μL हस्तांतरण ।
    2. 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में सेल संस्कृति को बढ़ाएं जब तक कि कोशिकाएं मध्य-घातीय चरण (ओडी600 = 0.5) तक न पहुंच जाएं।
    3. हर 30 मिनट में माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
  3. दूसरा प्रचार
    1. ओडी600 = 0.5 पर, 250 एमएल चकित फ्लास्क में ताजा संशोधित एलबी माध्यम के 25 एमएल में पहले फ्लास्क से सेल संस्कृति के 250 माइक्रोन को पतला करें।
    2. ओडी600= 0.5 तक 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में दूसरी सेल संस्कृति बढ़ाएं।
    3. हर 30 मिनट में ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
      नोट: रातोंरात संस्कृति में 4 ,5,22की काफी मात्रा में सलती कोशिकाएं हो सकती हैं . ऊपर वर्णित कमजोर पड़ने/विकास चक्र विधि5 कोशिकाओं को माइक्रोसरे में स्थानांतरित करने से पहले इन पूर्व-मौजूदा बने रहने वालों को समाप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उनके उन्मूलन को प्रोटोकॉल 3 में वर्णित परख के साथ रातोंरात संस्कृतियों के कायम रहने वाले स्तरों की मात्रा निर्धारित करके मान्य किया जा सकता है। इस विधि को पिछले अध्ययन19में पहले ही मान्य किया जा चुका है .

3. पहले से मौजूद प्रेस्टर कोशिकाओं के उन्मूलन को मान्य करना

  1. दूसरे प्रचार के बाद (चरण 2.3 देखें), 250 एमएल चकित फ्लास्क में ताजा संशोधित एलबी माध्यम के 25 एमएल में सेल संस्कृति (ओडी600 = 0.5) के 250 माइक्रोन को पतला करें।
    नोट: नियंत्रण के लिए, एक २५० मिलीएल चकित फ्लास्क में ताजा संशोधित पौंड माध्यम के 25 एमएल में रातोंरात संस्कृति के २५० μL पतला (चरण २.१ देखें) । कोशिकाओं को फ्लास्क में स्थानांतरित करने से पहले, रातोंरात संस्कृति के सेल घनत्व को ओडी600 = 0.5 प्राप्त करने के लिए ताजा संशोधित एलबी माध्यम में समायोजित किया जाना चाहिए।
  2. सेल सस्पेंशन में ओएफएक्स स्टॉक सॉल्यूशन (5 मिलीग्राम/एमएल) के 25 माइक्रोन जोड़ें और परख संस्कृति को सजातीय बनाने के लिए फ्लास्क को धीरे से हिलाएं। ओएफएक्स की अंतिम एकाग्रता परख संस्कृति में 5 μg/mL है ।
  3. 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में परख संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  4. उपचार के दौरान हर घंटे में (0 एच सहित, परख संस्कृति में OFX जोड़ने से पहले समय बिंदु), परख संस्कृति के 1 एमएल को फ्लास्क से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 3 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में परख संस्कृति को केंद्रित करें।
  6. सावधानी से सेल पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनेटेंट के 950 माइक्रोन को हटा दें।
  7. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) समाधान का 950 माइक्रोल जोड़ें।
  8. एंटीबायोटिक एकाग्रता न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) से नीचे होने तक कुल 3x के लिए धोने के चरण 3.5-3.7 दोहराएं।
  9. अंतिम धोने के बाद, पीबीएस समाधान के 100 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें, जिसके परिणामस्वरूप 10x केंद्रित नमूना होता है।
  10. सेल निलंबन के 10 μL ले लो और क्रमिक रूप से एक ९६ अच्छी तरह से गोल नीचे की थाली का उपयोग कर PBS समाधान के ९० μL में छह बार पतला ।
  11. एंटीबायोटिक मुक्त ताजा आगर प्लेटों पर पतला सेल निलंबन के 10 μL हाजिर । पता लगाने की सीमा बढ़ाने के लिए, एक ताजा आगर प्लेट पर सेल निलंबन के शेष 90 माइक्रोन प्लेट।
  12. 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और फिर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना करें। परख संस्कृति के 1 एमएल में सीएफयू की कुल संख्या की गणना करते समय कमजोर पड़ने की दरों का लेखा-जोखा। एंटीबायोटिक उपचार की अवधि के संबंध में लॉगरिथम सीएलयू मूल्यों की साजिश रचने से किल घटता उत्पन्न होता है।
    नोट: ई. कोलाई कोशिकाओं19,20के लिए एक बिफेसिक किल वक्र प्राप्त करने के लिए एक 6 एच ओएफएक्स उपचार पर्याप्त है । प्रचारित कोशिकाओं का सिक्वलर स्तर (जैसा कि सीएलयू द्वारा 6 एच पर मापा जाता है) रातोंरात संस्कृति की तुलना में काफी कम होना चाहिए। प्रोटोकॉल 2 और 3 में वर्णित प्रक्रियाओं को अनुसंधान डिजाइन के आधार पर नियमित रूप से पौंड के साथ किया जा सकता है।

4. माइक्रोएरे प्लेट स्क्रीनिंग

  1. माइक्रोएरे-सेल संस्कृतियों को तैयार करना
    1. 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ताजा संशोधित एलबी माध्यम के 25 एमएल में घातीय चरण कोशिकाओं के 250 माइक्रोनल को स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे सेल सस्पेंशन को मिलाकर इसे सजातीय बना दें।
      नोट: घातीय चरण कोशिकाओं (OD600 = 0.5) दूसरे प्रचार कदम से प्राप्त कर रहे हैं (चरण 2.3 देखें).
    2. पतला सेल निलंबन को बाँझ 50 एमएल जलाशय में स्थानांतरित करें।
    3. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, कोशिका निलंबन के 150 माइक्रोल को माइक्रोएरे के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें, यानी, विभिन्न ओस्मोलाइट्स युक्त 96 अच्छी प्लेट।
      नोट: जिन कुओं में ओस्मोलाइट्स नहीं होते हैं, वे नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।
    4. माइक्रोएरे को गैस-पारमी सीलिंग झिल्ली से ढक दें।
    5. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: इन प्रयोगों में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेटों का उपयोग किया गया था, जैसे फेनोटाइप माइक्रोरैयस (पीएम-9 और पीएम-10) जिसमें विभिन्न सांद्रता में सूखे राज्य में ओस्मोलाइट्स, पीएच बफ़र्स और अन्य रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है। ये माइक्रोएरे आधे क्षेत्र 96 वेल प्लेट प्रारूपों में हैं। संस्कृति की मात्रा का उपयोग की जा रही प्लेटों के प्रकार के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए। माइक्रोएरास को मैन्युअल रूप से भी उत्पन्न किया जा सकता है (नीचे देखें)।
  2. माइक्रोएरे प्लेटों की मैनुअल तैयारी
    1. आधा क्षेत्र 96 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में 2x ओस्मोलिटे समाधान के 75 μL स्थानांतरित करें।
    2. 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में 2x संशोधित एलबी माध्यम के 25 एमएल में एक्सपोनेंशियल फेज कोशिकाओं के 500 माइक्रोनल को स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे सेल सस्पेंशन को मिलाकर इसे सजातीय बना दें।
      नोट: टीका दर 4.1 में वर्णित माइक्रोएरे स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के अनुरूप होने के लिए समायोजित किया गया था।
    3. 2x ओस्मोलाइट समाधान युक्त आधे क्षेत्र 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 75 μL जोड़ें।
    4. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर में इनक्यूबेट करें।
  3. जारी रखने की परख प्लेटें तैयार
    1. 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ओएफएक्स के 5 माइक्रोग्राम/एमएल युक्त संशोधित एलबी माध्यम की 25 एमएल तैयार करें और इस माध्यम को बाँझ जलाशय में स्थानांतरित करें।
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके जलाशय से ओएफएक्स के साथ संशोधित एलबी माध्यम के 190 माइक्रोन को एक सामान्य फ्लैट-बॉटम 96 वेल प्लेट (संडिएर-परख प्लेट) के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें।
    3. शेकर से माइक्रोएरी निकालें (24 घंटे के लिए खेती के बाद) और माइक्रोएरे से सेल संस्कृतियों के 10 माइक्रोल को एक्सएएक्स के साथ संशोधित एलबी माध्यम युक्त, एक्स-परख प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें।
    4. एक गोल-नीचे 96 अच्छी प्लेट और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके पीबीएस समाधान के 290 माइक्रोन में तीन बार सिम्ब्राल-परख प्लेट से सेल निलंबन के 10 माइक्रोन लें।
    5. धारावाहिक कमजोर पड़ने के बाद, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके एंटीबायोटिक-मुक्त ताजा आगर प्लेटों पर सभी धारावाहिक रूप से पतला सेल निलंबन के 10 माइक्रोन स्पॉट करें।
    6. गैस-पारमी सीलिंग झिल्ली के साथ प्लेट को कवर करने के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में और 6 घंटे के लिए 250 आरपीएम में स्टीपर-परख प्लेट (चरण 4.3.3 में तैयार) को इनक्यूबेट करें।
    7. एक शेखर में 6 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, एक बनी-परख प्लेट बाहर ले और कदम 4.3.4-4.3.5 दोहराएं ।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और फिर सीएफयू गिनें। एंटीबायोटिक उपचार के बाद सीएलयू का स्तर पहले और 6 घंटे प्रत्येक कुएं में सिस्ट्रेंचर अंश की गणना करने में सक्षम है। ओएफएक्स उपचार से पहले सीआईएफयू की गिनती भी ऑस्मोलाइट्स के प्रभावों का आकलन करने और ई कोलाई व्यवहार्यता पर मदद करता है।

5. पहचानकी गई स्थितियों को मान्य करना

  1. माइक्रोएरी स्क्रीनिंग से पहचाने गए ऑस्मोलाइट युक्त ताजा संशोधित एलबी माध्यम के चरण 2.3 से 25 एमएल तक घातीय चरण कोशिकाओं के 250 माइक्रोल को स्थानांतरित करें (प्रोटोकॉल 4 देखें)।
  2. फ्लास्क को 250 आरपीएम और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में इनक्यूबेट करें।
  3. 24 घंटे के बाद, शेकर से फ्लास्क को हटा दें और सेल कल्चर के 250 माइक्रोन को 250 एमएल चकित फ्लास्क में फ्रेश मॉडिफाइड एलबी मीडियम के 25 एमएल में ट्रांसफर करें।
  4. सेल सस्पेंशन में ओएफएक्स स्टॉक सॉल्यूशन (5 मिलीग्राम/एमएल) के 25 माइक्रोनल जोड़ें और परख संस्कृति को समरूप बनाने के लिए फ्लास्क को धीरे से हिलाएं। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर शेकर में इनक्यूबेट करें।
  5. उपचार के दौरान हर घंटे में, परख संस्कृति के 1 एमएल को फ्लास्क से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 3 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में परख संस्कृति को केंद्रित करें।
  7. सुपरनैंट के 950 माइक्रोन निकालें और पीबीएस के 950 माइक्रोन जोड़ें।
  8. 3x के लिए वाशिंग चरण 5.6 और 5.7 दोहराएं।
  9. अंतिम धोने के बाद, पीबीएस समाधान के 100 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  10. सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन लें और 96 अच्छी तरह से गोल बॉटम प्लेट का उपयोग करके पीबीएस समाधान के 90 माइक्रोन में 6x को क्रमिक रूप से पतला करें।
  11. एंटीबायोटिक मुक्त ताजा आगर प्लेट पर पतला सेल निलंबन के 10 माइक्रोन स्पॉट करें। पता लगाने की सीमा बढ़ाने के लिए, एक ताजा आगर प्लेट पर सेल निलंबन के शेष 90 माइक्रोन प्लेट।
  12. 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेट को इनक्यूबेट करें, और फिर सीएफयू गिनें।

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Representative Results

चित्रा 1 हमारे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। कमजोर पड़ने/विकास चक्र प्रयोगों (देखें प्रोटोकॉल 2) को रातभर संस्कृतियों से निकलने वाले बनी रहने वालों को खत्म करने के लिए केरेन एट अल5 द्वारा किए गए अध्ययन से अनुकूलित किया गया था । चित्रा 2A ओएफएक्स उपचार से पहले और बाद में सेल संस्कृतियों के सीएलयू स्तरों को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली आगर प्लेटों की एक प्रतिनिधि छवि है। इन प्रयोगों में, कोशिकाओं को संशोधित पौंड माध्यम में आधे क्षेत्र में ओस्मोलाइट्स के साथ सुसंस्कृत किया गया था 96 अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में कदम 4.2 में वर्णित है। 24 घंटे के लिए एक कक्षीय शेखर में थाली इनक्यूबेटिंग के बाद, एक जेनेरिक फ्लैट नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था (कदम ४.३ देखें) । ओस्मोलाइट्स और यहां परीक्षण की जा रही एकाग्रता को हमारे पिछले अध्ययन19के आधार पर चुना गया था, जहां हमने पीएम-9 प्लेट का उपयोग करके चरण 4.1 और 4.3 किया जिसमें विभिन्न सांद्रता (सोडियम क्लोराइड, पोटेशियम क्लोराइड, सोडियम सल्फेट, एथिलीन ग्लाइकोल, सोडियम फोरमेट, यूरिया, सोडियम लैक्टेट, सोडियम फॉस्फेट, सोडियम बेंजोएट, अमोनियम सल्फेट, सोडियम नाइट्राइट और सोडियम नाइट्रेट) । चित्रा 2A में पहला कॉलम नियंत्रण समूह के CFU मायने रखता है दिखाता है । दूसरा स्तंभ एक ऐसी स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है जहां कोशिकाओं को 100 mm सोडियम नाइट्रेट में सुसंस्कृत किया गया था; इस कंडीशन पहले थोड़ा19का स्तर बढ़ाने के लिए पाया गया था . तीसरा कॉलम एक ऐसी स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है जहां कोशिकाओं को 60 mm सोडियम नाइट्राइट में सुसंस्कृत किया गया था, और यह स्थिति पहले नियंत्रण19की तुलना में सिंडर के स्तर को काफी कम करने के लिए पाई गई थी। चित्रा 2B आगर प्लेटों से प्राप्त सीएलयू डेटा का एक चित्रमय प्रतिनिधित्व है। चित्रा 2C 96 अच्छी तरह से प्लेटों में परीक्षण सेल संस्कृतियों के कायम अंशों से पता चलता है। अंशों की गणना करने के लिए, प्रोस्ट्रेचर काउंट को एंटीबायोटिक उपचार से पहले प्राप्त सेल काउंट में सामान्यीकृत किया गया था। चित्रा 3 से पता चलता है बिफेसिक मार घटता है और बनी अंश, क्रमशः, परख संस्कृतियों के लिए चकित फ्लास्क में प्रदर्शन किया । इन प्रयोगों में, कोशिकाओं को पहले संशोधित एलबी माध्यम के 25 एमएल में 24 घंटे के लिए 250 एमएल चकित फ्लास्क में संकेतित ओस्मोलाइट्स के साथ सुसंस्कृत किया गया था, और फिर कोशिकाओं को प्रोटोकॉल 5 में वर्णित के रूप में संरक्षक गणना के लिए सस्टेनेर-परख फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक प्रक्रिया। एक जमे हुए सेल स्टॉक से कोशिकाओं को ताजा पौंड माध्यम में रातोंरात (12 घंटे) उगाया गया । 12 घंटे में, रातोंरात संस्कृति को संशोधित एलबी माध्यम के 25 एमएल में पतला (1:100) किया गया था और ओडी600= 0.5 तक उगाया गया था। यह प्रचार-प्रसार कदम दो बार दोहराया गया। अंतिम प्रचार चरण के बाद, घातीय चरण कोशिकाओं (ओडी600= 0.5 पर) को क्रमशः 250 एमएल चकित फ्लास्क और 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ताजा संशोधित पौंड माध्यम में पतला (1:100) किया गया था। २५० एमएल चकित फ्लास्क में सेल सस्पेंशन को 5 μg/L ofX के साथ इलाज किया गया ताकि persisters की मात्रा निर्धारित की जा सके । 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में सेल सस्पेंशन को माइक्रोएरास में ट्रांसफर किया गया और 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्बिटल शेकर में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया। इसके बाद माइक्रोएरे से कोशिकाओं को बने रहने वालों की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्ट्रीज-परख प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया । यह आंकड़ा biorender.com का उपयोग कर बनाया गया था। इस आंकड़े को हमारे पिछले प्रकाशन19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोएरे प्रयोग। (क)कोशिकाओं को पहले संशोधित पौंड माध्यम में या बिना संकेत के 24 घंटे के लिए आधे क्षेत्र ९६ वेल प्लेट में उगाया जाता था । कोशिकाओं को तो एक जेनेरिक फ्लैट नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित कर दिया गया और 6 घंटे के लिए OFX के 5 μg/mL के साथ इलाज किया । 6 घंटे के उपचार से पहले और बाद में, कोशिकाओं को पीबीएस में क्रमिक रूप से पतला किया गया था, आगर प्लेटों पर चढ़ाया गया था और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था। प्रत्येक शर्त में 8 तकनीकी प्रतिकृति है। (ख)सीएलयू माप क्रमशः कोशिका व्यवहार्यता और दृढ़ता पर ओस्मोलाइट्स के प्रभावों का आकलन करने के लिए किया गया था । सीधी रेखा डिटेक्शन की सीमा (600 सीएफयू) को इंगित करती है। (ग)ग्राफ सेल संस्कृतियों के बने अंशों का प्रतिनिधित्व करता है, जो ओएफएक्स उपचार के बाद और उससे पहले सीआईएफयू के अनुपात को लेकर गणना की जाती है । सेल संस्कृति के एस्ट्राइपर अंश जिसमें 60 एमएम सोडियम नाइट्राइट है, की गणना नहीं की गई थी क्योंकि इसका एक्सप्लोसिव स्तर पता लगाने की सीमा से नीचे है। प्रत्येक डेटा बिंदु को मानक विचलन ± मतलब मूल्य द्वारा चिह्नित किया गया था, जो 8 तकनीकी प्रतिकृति से गणना की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: सत्यापन प्रयोग। (क)एक्सपोनेंटल फेज कोशिकाओं को 250 एमएल चकित फ्लास्क में संकेतित ऑस्मोलाइट्स के साथ ताजा संशोधित पौंड माध्यम के 25 एमएल में स्थानांतरित किया गया था और 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था । फिर, कोशिकाओं को पतला किया गया (1:100) 250 एमएल में संशोधित एलबी माध्यम के 25 एमएल वाले फ्लास्क चकित किए गए और 6 घंटे के लिए 5 माइक्रोग्राम/एमएल ओएफएक्स के साथ इलाज किया गया। परख संस्कृतियों में CFU मायने रखता है प्रति घंटा निगरानी के लिए biphasic मार घटता उत्पंन किया गया । * उस स्थिति को इंगित करता है जो नो-ऑस्मोलिट नियंत्रण (दो-पूंछ असमान विचरण टी-टेस्ट, पी<0.05) की तुलना में ओएफएक्स सस्टेलर स्तर को काफी प्रभावित करता है। (ख)ग्राफ संस्कृतियों के बने अंशों का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक डेटा बिंदु को मानक विचलन ± मतलब मूल्य द्वारा चिह्नित किया गया था, जो 3 जैविक प्रतिकृति से गणना की जाती है। इस आंकड़े को हमारे पिछले प्रकाशन19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ई. कोलाई हठ पर विभिन्न रसायनों के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए यहां वर्णित उच्च थ्रूपुट कॉन्डिर परख विकसित की गई थी। वाणिज्यिक पीएम प्लेटों के अलावा, चरण 4.2 में वर्णित माइक्रोरे को मैन्युअल रूप से बनाया जा सकता है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल लचीला है और इस तरह के दवा पैनलों और सेल पुस्तकालयों के रूप में अंय microarrays, कि ९६ अच्छी तरह से थाली प्रारूपों में है स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन पुस्तकालयों का परीक्षण करने के लिए विकास चरण, टीका दर और माध्यम सहित प्रायोगिक स्थितियों को समायोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि कोई एक सेल लाइब्रेरी को स्क्रीन करना चाहता है, जैसे कि कीओ ई. कोलाई नॉकआउट संग्रह23,तो वे पहले पुस्तकालय से उपभेदों को 96 अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित कर सकते हैं जिसमें मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके ताजा मीडिया शामिल है। एक बार जब कोशिकाएं वांछित विकास चरण (जैसे, घातीय या स्थिर चरण) तक पहुंच जाती हैं, तो कोशिकाओं को नॉकआउट उपभेदों के निरंतर स्तर की गणना करने के लिए कदम 4.3 में वर्णित के रूप में स्स्ट्रेचर-परख प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इसी तरह, एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा सक्रिय प्रमोटरों की पहचान करने के लिए ई. कोलाई प्रमोटर संग्रह24 (96 वेल प्लेट प्रारूपों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उपभेदों की एक लाइब्रेरी) को स्क्रीन करने के लिए इस रणनीति का उपयोग किया जा सकता है। एंटीबायोटिक उपचार के दौरान बनी-परख प्लेटों में उपभेदों के फ्लोरेसेंस संकेतों को मापकर इन प्रमोटरों का आसानी से पता लगाया जा सकता है।

हमारे प्रयोगों में, हमने एनएसीएल से उत्पन्न होने वाले किसी भी अतिरिक्त प्रभाव से बचने के लिए एक संशोधित एलबी (एनएसीएल की कमी) का उपयोग किया, यह देखते हुए कि माइक्रोरास में पहले से ही विभिन्न ओस्मोलाइट्स हैं। हालांकि नियमित एलबी माध्यम में एनएसीएल कोशिकाओं की झिल्ली अखंडता के संरक्षण के लिए अच्छा माना जाता है, यह बताया गया है कि 0-1% रेंज में NaCl सेल विकास25पर एक ंयूनतम प्रभाव पड़ता है । इसके अलावा, प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के परिणामों और हमारे पिछले अध्ययन में परीकता है कि NaCl की अनुपस्थिति झिल्ली अखंडता और ई. कोलाई कोशिकाओं19के हठ को काफी प्रभावित नहीं करता है । यह संशोधन विशेष रूप से हमारे अध्ययन में चिंताओं को दूर करने के लिए किया गया था और अनुसंधान की प्रकृति के आधार पर बदला जा सकता है ।

हमने माइक्रोएरे में टीका लगाने से पहले हमारी सेल संस्कृतियों में पूर्व-मौजूदा बने रहने वालोंको खत्म करने के लिए केरेन एट अल द्वारा विकसित एक विधि भी अनुकूलित की है। टाइप I बने रहने वालों को स्थिर चरण के दौरान उत्पन्न होने के लिए जाना जाता है; इसलिए, रात भर संस्कृतियों से कोशिकाओं का सीधा टीका माइक्रोरे प्लेटों में काफी संख्या में बने रहने वालों को स्थानांतरित करेगा, जो ओस्मोलाइट्स के प्रभाव में बाधा डाल सकता है। कमजोर पड़ने/विकास चक्र प्रयोगों (प्रोटोकॉल 2 देखें) के साथ, हम रातोंरात संस्कृतियों19से उत्पन्न होने वाले इन पहले से मौजूद बने रहने वाले बने रहने वालों को काफी कम करने में सक्षम थे । हम ध्यान दें कि हमने 24 घंटे के लिए माइक्रोएरे प्लेटों में कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया है ताकि ओस्मोलाइट्स की उपस्थिति में स्थिर चरण के दौरान बनने वाले प्रकार I वेरिएंट सहित सभी बने रहने वालों को गिन सकें। हालांकि, इन अनुकूलित तकनीकों को हमेशा अध्ययन की प्रकृति के आधार पर संशोधित किया जा सकता है।

हमने 5 माइक्रोगेस/एमएल ओएफएक्स के साथ माइक्रोएरे में कोशिकाओं का इलाज किया ताकि वे बने रहने की गणना कर सके । चूंकि 96 नमूनों से एंटीबायोटिक को हटाने के लिए धोने की प्रक्रिया बहुत श्रम-प्रधान होगी, उपचार के बाद कोशिकाओं को धोने के बिना पीबीएस में क्रमिक रूप से पतला किया गया था (चरण 4.2 देखें)। इस प्रक्रिया ने ओएफएक्स एकाग्रता को 30 गुना से अधिक पतला कर दिया। इसके बाद पतला सेल सस्पेंशन को एंटीबायोटिक-फ्री एगर प्लेटों पर चढ़ाया गया जहां ओएफएक्स को आगे फैलाया गया । हमारे प्रारंभिक अध्ययनों में जहां हमने इन प्रयोगों को दोहराया और बिना धोने के यह सत्यापित किया है कि इस धारावाहिक-कमजोर पड़ने की विधि ने19के स्तर को प्रभावित नहीं किया ।

96 अच्छी प्लेटों में मल्टी-चैनल पिपटिंग के दौरान, एक समरूप सेल वितरण को बनाए रखने के लिए सेल निलंबन को सावधानीपूर्वक मिलाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, काम करने की मात्रा के आधार पर, समाधान को सजातीय बनाने के लिए आवश्यक पिपटिंग की न्यूनतम संख्या को नोट करना फायदेमंद होगा। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक सरल नियंत्रण प्रयोग किया जहां हमने यहां अध्ययन की गई शर्तों के तहत पीबीएस और मध्यम में डाई अणु को फैलाकर पिपटिंग (ऊपर और नीचे) की निगरानी की । इसके अतिरिक्त, यदि पीएच बफ़र्स जैसे अधिक जटिल वातावरण के साथ काम करना, तो हम एक शेखर में इनक्यूबेशन से पहले और दौरान सेल संस्कृति के पीएच को मापने का सुझाव देंगे क्योंकि सेल संस्कृति समय के साथ बहुत क्षारीय (पीएच ≈ 8) हो जाती है। यह गुणवत्ता के साथ-साथ इस्तेमाल किए गए बफर की पीएच रेंज का एक विचार दे सकता है। इसके अतिरिक्त, उच्च थ्रूपुट परख से आगर प्लेटों पर गणना योग्य सीएफयू प्राप्त करने के लिए, कुछ शर्तें, जैसे सेल टीका दर, संस्कृतियों की आयु, और धारावाहिक-कमजोर पड़ने के मापदंड (पीबीएस वॉल्यूम, कमजोर पड़ने की दर और कमजोर पड़ने वाले चरणों की संख्या, आदि) को माइक्रोरैरेसी का परीक्षण करने से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। अंत में, माइक्रोएरास से प्राप्त परिणामों को फ्लास्क में और मान्य किया जाना चाहिए क्योंकि 96 अच्छी प्लेट में संस्कृति, सतह क्षेत्र और वातारण की मात्रा का अवलोकन परिणामों पर अतिरिक्त प्रभाव पड़ सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन के दौरान ओरमैन लैब के सदस्यों को उनकी मूल्यवान जानकारी के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन NIH/NIAID K22AI125468 कैरियर संक्रमण पुरस्कार और ह्यूस्टन स्टार्टअप अनुदान के एक विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14-ml test tube Fisher Scientific 14-959-1B
E. coli strain MG1655 Princeton University Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-5161
Gas permeable sealing membrane VWR 102097-058 Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate VWR 82050-062
LB agar Fisher Scientific BP1425-2 Molecular genetics grade
Ofloxacin salt VWR 103466-232 HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) Biolog N/A PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-0161
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500 Certified ACS grade
Sodium nitrate Fisher Scientific AC424345000 ACS reagent grade
Sodium nitrite Fisher Scientific AAA186680B 98% purity
Square petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Tryptone Fisher Scientific BP1421-500 Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader Thermo Fisher Scientific VLBL00D0 Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-100 Molecular genetics grade

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References

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Karki, P., Orman, M. A. High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence. J. Vis. Exp. (168), e61597, doi:10.3791/61597 (2021).

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