Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высокопроизводительный скрининг химических соединений для выяснения их влияния на бактериальную персистенцию

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61597
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston

Summary

В этой статье мы представляем высокопроизводительную стратегию скрининга для выявления химических соединений, таких как осмолиты, которые оказывают значительное влияние на бактериальную персистенцию.

Abstract

Бактериальные персистенты определяются как небольшая субпопуляция фенотипических вариантов со способностью выдерживать высокие концентрации антибиотиков. Они являются важной проблемой для здоровья, поскольку они связаны с рецидивирующими хроническими инфекциями. Хотя стохастическая и детерминированная динамика механизмов, связанных со стрессом, как известно, играет значительную роль в персистентности, механизмы, лежащие в основе фенотипического перехода в состояние персистентности / из него, не полностью поняты. Хотя факторы стойкости, вызванные сигналами окружающей среды (например, истощение источников углерода, азота и кислорода), были широко изучены, воздействие осмолитов на стойкость еще предстоит определить. Используя микрочипы (т.е. 96 пластин скважин, содержащих различные химические вещества), мы разработали подход к выяснению влияния различных осмолитов на персистенцию кишечной палочки с высокой пропускной способностью. Этот подход является преобразующим, поскольку он может быть легко адаптирован для других скрининговых массивов, таких как панели лекарств и библиотеки нокаута генов.

Introduction

Бактериальные культуры содержат небольшую субпопуляцию персистентных клеток, которые временно терпимы к необычно высоким уровням антибиотиков. Персистентные клетки генетически идентичны своим чувствительным к антибиотикам сородиням, и их выживание объясняется временным ингибированием роста1. Персистентные клетки были впервые обнаружены Глэдис Хобби2, но этот термин был впервые использован Джозефом Биггером, когда он идентифицировал их в обработанных пенициллином культурах Staphylococcus pyogenes 3. Основополагающее исследование, опубликованное Balaban et al.4, обнаружило два типа персистентов: варианты типа I, которые в основном формируются при прохождении через стационарную фазу, и варианты типа II, которые непрерывно генерируются во время экспоненциального роста. Персистенты обнаруживаются с помощью клоногенных анализов выживаемости, в которых образцы культуры берутся через различные промежутки времени во время лечения антибиотиками, промываются и покрываются на типичной питательной среде для подсчета выживших клеток, которые могут колонизироваться в отсутствие антибиотиков. Существование персистентов в клеточной культуре оценивается по двухфазной кривой убийства4,5, где начальный экспоненциальный распад указывает на гибель чувствительных к антибиотикам клеток. Тем не менее, тенденция к уничтожению со временем уменьшается, что в конечном итоге приводит к плато, которая представляет собой выжившие персистентные клетки.

Персистентные клетки были связаны с различными заболеваниями, такими как туберкулез6,муковисцидоз7,кандидоз8 и инфекции мочевыводящих путей9. Было обнаружено, что почти все микроорганизмы, протестированные до сих пор, генерируют персистентные фенотипы, включая высокопатогенные Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 и Candida albicans8. Недавние исследования также свидетельствуют о росте мутантов с множественной лекарственной устойчивостью из персистных субпопуляций11,12. Значительные усилия в этой области показали, что механизмы сохранения являются весьма сложными и разнообразными; известно, что как стохастические и детерминированныефакторы,связанные с реакцией SOS13,14,активных форм кислорода (АФК)15,системами токсина/антитоксина (ТА)16,аутофагией или самоперевариванием17 и строгим ответом18, связанным с ppGpp, облегчают образование персистаторов.

Несмотря на значительный прогресс в понимании фенотипа персистенции, влияние осмолитов на бактериальную персистенцию не было полностью понято. Поскольку поддержание оптимального осмотического давления является необходимостью для роста клеток, правильного функционирования и выживания, углубленное изучение осмолитов может привести к потенциальным целям для антиперсистентных стратегий. Несмотря на трудоемкий, высокопроизводительный скрининг является очень эффективным подходом к выявлению метаболитов и других химических веществ, которые играют решающую роль в фенотипе персистенции19,20. В этой работе мы обсудим наш опубликованный метод19,где мы использовали микрочипы, т.е. 96 пластин скважин, содержащих различные осмолиты (например, хлорид натрия, мочевину, нитрит натрия, нитрат натрия, хлорид калия), для выявления осмолитов, которые существенно влияют на персистенцию E. coli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление питательной среды, раствора офлоксацина и запасов клеток E. coli

  1. Обычная среда Лурия-Бертани (LB): Добавьте 10 г / л триптона, 10 г / л хлорида натрия (NaCl) и 5 г / л дрожжевого экстракта в деионизированную (DI) воду. Стерилизуйте среду путем автоклавирования.
  2. Пластины с агаром LB: Добавьте 10 г / л триптона, 10 г / л NaCl, 5 г / л дрожжевого экстракта и 15 г / л агара в воду DI и стерилизуйте среду путем автоклавирования. При нужной температуре (~55 °C) налейте ~30 мл агаровой среды в квадратные тарелки (10 х 10 см). Высушите пластины и храните при 4 °C.
  3. Модифицированная среда LB: Добавьте 10 г / л триптона и 5 г / л дрожжевого экстракта в воду DI. Стерилизуйте среду путем автоклавирования.
  4. Модифицированная среда LB, включая осмолит: Смешайте 2-кратную модифицированную среду LB с 2-кратным раствором осмолита в равных объемах. Для приготовления 2x модифицированной среды LB добавляют 20 г/л триптона и 10 г/л дрожжевого экстракта в воду DI и стерилизуют автоклавированием. Чтобы приготовить 2x раствор осмолите, растворите интересующий осмолит (2x количество) в воде DI, а затем фильтруйте стерилизующий раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующих его осмолит и его концентрации могут быть определены с помощью скрининговых анализов фенотипа микрочипов (см. Протокол 4). Однако тестируемый осмолит и связанная с ним 2-кратная концентрация могут быть скорректированы в зависимости от характера исследования. Например, для изучения воздействия 1 мМ хлорида натрия 2x раствор осмолите будет представлять собой раствор хлорида натрия 2 мМ.
  5. Стоковый раствор офлоксацина (5 мг/мл): Добавьте 5 мг соли офлоксацина (OFX) в 1 мл воды DI. Добавьте 10 мкл 10 М гидроксида натрия для повышения растворимости OFX в воде, а затем фильтруйте стерилизуйте раствор. Приготовьте аликвоты и храните при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Офлоксацин является хинолоновым антибиотиком, который широко используется как для растущих, так и для нерастращивающихся бактериальных клеток14,21. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) OFX для клеток E. coli MG1655 находится в пределах 0,039–0,078 мкг/мл19,20. Также обратите внимание, что другие антибиотики, такие как ампициллин и канамицин, обычно используются в исследованиях персистенции. Выбор антибиотиков зависит от характера исследования.
  6. Кишечно-кишечное кишечно Запасы клеток MG1655: Привить 2 мл обычной среды LB одной колонией в пробирке объемом 14 мл (с защелкиванием) и культивировать клетки в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C. Когда клетки достигнут стационарной фазы, смешайте 500 мкл клеточной культуры с 500 мкл 50% глицерина (стерильного) в криогенном флаконе и храните при -80 °C.

2. Размножение клеток для устранения ранее существовавщих персистаторов

  1. Чтобы приготовить культуру на ночь, соскоблите небольшое количество клеток из замороженного клеточного запаса стерильным наконечником пипетки (не размораживайте запас клеток глицерина) и инокулируйте клетки в 2 мл модифицированной среды LB в пробирке с защелкиванием 14 мл. Культивировщик клеток в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C в течение 12 ч.
  2. Первое распространение
    1. Через 12 ч переложить 250 мкл ночной культуры в 25 мл свежей модифицированной среды LB в 250 мл перемешанных колб, покрытых стерильной алюминиевой фольгой.
    2. Выращивайте клеточную культуру в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C до тех пор, пока клетки не достигнут средней экспоненциальной фазы (OD600 = 0,5).
    3. Измеряйте оптическую плотность при 600 нм (OD600)с помощью считывателя микропластин каждые 30 минут.
  3. Второе распространение
    1. При OD600 = 0,5 разбавляют 250 мкл клеточной культуры из первой колбы в 25 мл свежей модифицированной среды LB в 250 мл перегородоченной колбы.
    2. Выращивайте вторую культуру клеток в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C до OD600= 0,5.
    3. Измеряйте оптическую плотность каждые 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ночная культура может иметь значительное количество персистерных клеток4,5,22. Описанный выше способ цикла разбавления/роста можетбыть использован для устранения этих ранее существовающих персистаторов перед переносом клеток в микрочипы. Их элиминация может быть подтверждена путем количественной оценки персистентных уровней ночных культур с помощью анализа, описанного в Протоколе 3. Этот метод уже был подтвержден в предыдущем исследовании19.

3. Проверка устранения ранее существовающих персистерных клеток

  1. После второго размножения (см. этап 2.3) разбавляют 250 мкл клеточной культуры (OD600 = 0,5) в 25 мл свежей модифицированной среды LB в 250 мл перегородившой колбы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контрольных органов разбавляют 250 мкл ночной культуры (см. этап 2.1) в 25 мл свежей модифицированной среды LB в 250 мл перегородоченной колбы. Перед переносом клеток в колбу плотность клеток ночной культуры следует отрегулировать в свежей модифицированной среде LB для получения OD600 = 0,5.
  2. Добавьте 25 мкл раствора OFX (5 мг/мл) в клеточную суспензию и аккуратно встряхните колбу, чтобы сделать культуру анализа однородной. Конечная концентрация OFX составляет 5 мкг/мл в пробирной культуре.
  3. Инкубировать пробирную культуру в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C.
  4. Каждый час во время лечения (включая 0 ч, временную точку перед добавлением OFX в культуру анализа) передавайте 1 мл пробирной культуры из колбы в микроцентрифужную трубку 1,5 мл.
  5. Центрифугировать культуру анализа в микроцентрифужной трубке при 17 000 х г в течение 3 мин.
  6. Осторожно удалите 950 мкл супернатанта, не нарушая клеточную гранулу.
  7. Добавьте 950 мкл фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) в микроцентрифужную трубку.
  8. Повторяйте промывочные этапы 3,5-3,7 в общей сложности 3 раза до тех пор, пока концентрация антибиотика не будет ниже минимальной ингибирующей концентрации (МИК).
  9. После окончательной промывки повторно суспендируют гранулу ячейки в 100 мкл раствора PBS, в результате чего получается 10-кратный концентрированный образец.
  10. Взять 10 мкл клеточной суспензии и последовательно разбавить шесть раз в 90 мкл раствора PBS с использованием пластины круглого дна из 96 скважин.
  11. Наклеите 10 мкл разбавленных клеточных суспензий на свежие агаровые пластины без антибиотиков. Чтобы увеличить предел обнаружения, наклеиваем оставшиеся 90 мкл клеточной суспензии на свежую агаровую пластину.
  12. Инкубируют агаровые пластины при 37 °C в течение 16 ч, а затем подсчитывают колониеобразующие единицы (КОЕ). Учитываем коэффициенты разбавления при расчете общего количества КОЕ в 1 мл пробирной культуры. Кривые уничтожения генерируются путем построения логарифмических значений КОЕ относительно продолжительности лечения антибиотиками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 6-ч лечения OFX достаточно для получения двухфазной кривой уничтожения клеток E. coli 19,20. Персистентный уровень размножаемых клеток (измеряемый количеством КОЕ через 6 ч) должен быть значительно меньше, чем у ночной культуры. Процедуры, описанные в Протоколах 2 и 3, могут быть выполнены с обычным ЛБ в зависимости от дизайна исследования.

4. Экранирование пластин микрочипов

  1. Подготовка культур микрочипов-клеток
    1. Перенос 250 мкл экспоненциально-фазовых клеток в 25 мл свежей модифицированной LB-среды в 50 мл центрифужной трубки. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию, чтобы сделать ее однородной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспоненциально-фазовые ячейки (OD600 = 0,5) получаются на втором этапе распространения (см. шаг 2.3).
    2. Переложите разбавленный клеточный суспензию в стерильный резервуар объемом 50 мл.
    3. Используя многоканальную пипетку, перенесите 150 мкл клеточной суспензии в каждую скважину микрочипа, т. е. пластину из 96 скважин, содержащую различные осмолиты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, не имея осмолитов, служат в качестве контроля.
    4. Накройте микрочип газонепроницаемой уплотнительной мембраной.
    5. Инкубируют пластину в орбитальном шейкере при 37 °C и 250 об/мин в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих экспериментах использовались коммерчески доступные пластины, такие как микрочипы фенотипа (PM-9 и PM-10), которые включают широкий спектр осмолитов, буферов pH и других химических веществ в высушенном состоянии при различных концентрациях. Эти микрочипы находятся в форматах пластин половинной площади 96 скважин. Объемы культуры должны регулироваться в зависимости от типа используемых пластин. Микрочипы также могут быть сгенерированы вручную (см. Ниже).
  2. Ручная подготовка пластин микрочипов
    1. Перенесите 75 мкл 2-х растворов осмоллита в скважины половинной площади 96-й плиты скважины.
    2. Перенесите 500 мкл экспоненциально-фазовых ячеек в 25 мл 2-кратно модифицированной LB-среды в 50 мл центрифужной трубки. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию, чтобы сделать ее однородной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость прививки была скорректирована в соответствии с протоколом скрининга микрочипов, описанным в 4.1.
    3. Добавляют 75 мкл клеточной суспензии в каждую скважину половинной площади 96-й пластины скважины, содержащей 2x раствора осмолита.
    4. Инкубируют пластину в орбитальном шейкере при 37 °C и 250 об/мин в течение 24 ч.
  3. Подготовка пластин для анализа персистеров
    1. Приготовьте 25 мл модифицированной среды LB, содержащей 5 мкг/мл OFX в 50 мл центрифужной трубки, и перенесите эту среду в стерильный резервуар.
    2. Перенесите 190 мкл модифицированной среды LB с OFX из коллектора в каждую скважину общей плоскодонной 96-й скважинной пластины (пластина персистер-анализ) с помощью многоканальной пипетки.
    3. Извлекают микрочип из шейкера (после культивирования в течение 24 ч) и переносят 10 мкл клеточных культур из микрочипы в колодцы персистенторно-пробирной пластины, содержащей модифицированную LB-среду с OFX.
    4. Возьмите 10 мкл клеточных суспензий с пластины для анализа персистера и последовательно разбавьте три раза в 290 мкл раствора PBS с использованием круглодонной 96-скважинной пластины и многоканальной пипетки.
    5. После серийного разведения наклейте 10 мкл всех последовательно разбавленных клеточных суспензий на не имеющих антибиотиков свежих агаровых пластинах с помощью многоканальной пипетки.
    6. Инкубируют пластину для анализа персистера (приготовленную на этапе 4.3.3) в орбитальном шейкере при 37 °C и 250 об/мин в течение 6 ч после покрытия пластины газопроницаемой уплотнительной мембраной.
    7. После 6 ч инкубации в шейкере выньте пластину для анализа персистента и повторите шаги 4.3.4-4.3.5.
    8. Инкубируют агаровые пластины в течение 16 ч при 37 °C, а затем подсчитывают КОЕ. Уровни КОЕ до и через 6 ч после лечения антибиотиками позволяют рассчитать персистентную фракцию в каждой скважине. Количество КОЕ до лечения OFX также помогает оценить влияние осмолитов и на жизнеспособность E. coli.

5. Проверка выявленных условий

  1. Перенос 250 мкл экспоненциальных фазовых клеток с этапа 2,3 на 25 мл свежей модифицированной LB-среды, содержащей осмолит, идентифицированный в результате скрининга микрочипов (см. Протокол 4).
  2. Инкубировать колбу в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C в течение 24 ч.
  3. Через 24 ч извлекают колбу из шейкерной колбы и переносят 250 мкл клеточной культуры в 25 мл свежей модифицированной среды LB в 250 мл перемешанных колб.
  4. Добавьте 25 мкл раствора OFX (5 мг/мл) в клеточную суспензию и аккуратно встряхните колбу, чтобы сделать культуру анализа однородной. Высиживание колбы в шейкере при 37 °C и 250 об/мин.
  5. Каждый час во время лечения переносите 1 мл пробирной культуры из колбы в микроцентрифужную трубку 1,5 мл.
  6. Центрифугировать культуру анализа в микроцентрифужной трубке при 17 000 х г в течение 3 мин.
  7. Удалите 950 мкл супернатанта и добавьте 950 мкл PBS.
  8. Повторите шаги стирки 5.6 и 5.7 для 3x.
  9. После окончательной промывки повторно суспендируют гранулу ячейки в 100 мкл раствора PBS.
  10. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и последовательно разбавьте 6x в 90 мкл раствора PBS, используя пластину круглого дна из 96 скважин.
  11. Надените 10 мкл разбавленных клеточных суспензий на пластину свежего агара, не обогащенного антибиотиками. Чтобы увеличить предел обнаружения, наклеиваем оставшиеся 90 мкл клеточной суспензии на свежую агаровую пластину.
  12. Инкубируют агарную пластину при 37 °C в течение 16 ч, а затем подсчитывают КОЕ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 описан наш экспериментальный протокол. Эксперименты с циклом разбавления/роста (см. Протокол 2) были адаптированы из исследования, проведенного Keren et al.5, для устранения персистентов, происходящих из ночных культур. Рисунок 2А представляет собой репрезентативное изображение агаровых пластин, используемых для определения уровней КОЕ клеточных культур до и после обработки OFX. В этих экспериментах клетки культивировали в модифицированной среде LB с осмолитами в пластинах скважины половинной площади 96, как описано на этапе 4.2. После инкубации пластины в орбитальном шейкере в течение 24 ч анализ персистента проводили с использованием общей плоской нижней 96-луночной пластины (см. этап 4.3). Осмолиты и концентрация, которые здесь тестируются, были выбраны на основе нашего предыдущего исследования19,где мы выполнили этапы 4.1 и 4.3 с использованием пластины PM-9, которая включает различные осмолиты в разных концентрациях (хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, этиленгликоль, формиат натрия, мочевина, лактат натрия, фосфат натрия, бензоат натрия, сульфат аммония, нитрит натрия и нитрат натрия). В первом столбце на рисунке 2A показано количество КОЕ контрольной группы. Вторая колонка представляет собой состояние, при котором клетки культивировали в 100 мМ нитрата натрия; Ранее было обнаружено, что это условие немного увеличивает уровни персистента19. Третий столбец представляет собой состояние, при котором клетки культивировали в 60 мМ нитрита натрия, и ранее было обнаружено, что это состояние значительно снижает уровни персистенции по сравнению с контрольной19-йчастью. Рисунок 2В представляет собой графическое представление данных КОЕ, полученных с агаровых пластин. На рисунке 2С показаны персистентные фракции клеточных культур, протестированных в 96 пластинах скважин. Чтобы рассчитать фракции, количество персистентов было нормализовано до количества клеток, полученных до лечения антибиотиками. На рисунке 3 показаны двухфазные кривые уничтожения и фракции персистента, соответственно, для пробирных культур, выполненных в сбитых с толку колбах. В этих экспериментах клетки сначала культивировали в 25 мл модифицированной среды LB с указанными осмолитами в 250 мл сбитых с толку колбах в течение 24 ч, а затем клетки переносили в колбы для персистерного анализа для перечисления персистеров, как описано в Протоколе 5.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальная процедура. Клетки из замороженного клеточного запаса выращивали в течение ночи (12 ч) в свежей среде LB. Через 12 ч культуру на ночь разбавляли (1:100) в 25 мл модифицированной среды LB и выращивали до OD600=0,5. Этот шаг распространения повторялся дважды. После заключительной стадии распространения экспоненциальные фазовые ячейки (при OD600= 0,5) разбавляли (1:100) в свежей модифицированной среде LB в 250 мл сбитой колбы и 50 мл центрифужной трубки, соответственно. Клеточную суспензию в 250 мл сбитой колбы обрабатывали 5 мкг/мл OFX для количественной оценки персистантов. Клеточную суспензию в 50 мл центрифужной трубки переносили в микрочипы и инкубировали в течение 24 ч в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C. Затем клетки из микрочипов были перенесены на пластины для анализа персистента для количественной оценки персистентов. Этот рисунок был создан с использованием biorender.com. Эта цифра была изменена по сравнению с нашей предыдущей публикацией19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Эксперименты с микрочипами. (A)Клетки сначала выращивали в модифицированной среде LB с указанными осмолитами или без них в полупрощадной 96-й скважинной пластине в течение 24 ч. Затем клетки переносили на общую пластину с плоским дном 96 скважин и обрабатывали 5 мкг/мл OFX в течение 6 ч. До и после 6 ч обработки клетки последовательно разбавляли в PBS, наносили на агартовые пластины и инкубировали при 37 °C в течение 16 ч. Каждое условие имеет 8 технических реплик. (B)Измерения КОЕ были проведены для оценки влияния осмолитов на жизнеспособность и персистенцию клеток, соответственно. Прямая линия указывает предел обнаружения (600 КОЕ). (C)График представляет собой персистентные фракции клеточных культур, рассчитанные путем взятия соотношения количества КОЕ после и до обработки OFX. Персистентная фракция клеточной культуры, которая имеет 60 мМ нитрита натрия, не была рассчитана, поскольку ее уровень персистента ниже предела обнаружения. Каждая точка данных обозначалась средним значением ± стандартным отклонением, рассчитанным из 8 технических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Эксперименты по проверке. (A)Экспоненциально-фазовые клетки переносили в 25 мл свежей модифицированной среды LB с указанными осмолитами в 250 мл сбитых с толку колбах и культивировали в течение 24 ч. Затем клетки разбавляли (1:100) в 250 мл сбитых с толку колбах, содержащих 25 мл модифицированной LB-среды, и обрабатывали 5 мкг/мл OFX в течение 6 ч. Количество КОЕ в культурах анализа контролировалось ежечасно для получения двухфазных кривых убийства. * указывает на состояние, которое существенно влияет на уровни персистента OFX по сравнению с контролем без осмолитета (двуххвостый неравный дисперсионный t-тест, p<0,05). (B) График представляет сохраняемые фракции культур. Каждая точка данных обозначалась средним значением ± стандартным отклонением, рассчитанным из 3 биологических реплик. Эта цифра была изменена по сравнению с нашей предыдущей публикацией19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный здесь высокопроизводительный персистерный анализ был разработан для выяснения влияния различных химических веществ на персистенцию E. coli. В дополнение к коммерческим пластинам ТЧ микрочипы могут быть изготовлены вручную, как описано в шаге 4.2. Кроме того, протокол, представленный здесь, является гибким и может быть использован для скрининга других микрочипов, таких как панели лекарств и библиотеки ячеек, которые находятся в форматах пластин 96 скважин. Экспериментальные условия, включая фазу роста, скорость прививки и среду, могут быть скорректированы для тестирования этих библиотек. Например, если кто-то хочет отсеять библиотеку клеток, такую как Keio E. coli knockout collection23,они могут сначала перенести штаммы из библиотеки на 96 плит скважин, которые включают свежие носители, используя многоканальную пипетку. Как только клетки достигают желаемой фазы роста (например, экспоненциальной или стационарной фазы), клетки затем переносятся на пластины персистенсерного анализа, как описано на этапе 4.3, чтобы перечислить уровни персистенции нокаутных штаммов. Аналогичным образом, эта стратегия может быть использована для скрининга коллекции E. coli Promoter 24 (библиотека флуоресцентных репортерных штаммов в форматах пластин 96 скважин) для выявления промоторов, которые активируются антибиотиками. Эти промоторы могут быть легко обнаружены путем измерения флуоресцентных сигналов штаммов в пластинах персистенсерного анализа во время лечения антибиотиками.

В наших экспериментах мы использовали модифицированный LB (без NaCl), чтобы избежать любого дополнительного эффекта, который может возникнуть от NaCl, учитывая, что микрочипы уже имеют различные осмолиты. Хотя Известно, что NaCl в обычной среде LB хорош для сохранения целостности мембран клеток, сообщалось, что NaCl в диапазоне 0-1% оказывает минимальное влияние на рост клеток25. Более того, результаты окрашивания и анализов персистентов пропидия йодида (PI) в нашем предыдущем исследовании показали, что отсутствие NaCl существенно не влияет на целостность мембраны и стойкость клеток E. coli 19. Это изменение было сделано специально для решения проблем в нашем исследовании и может быть изменено в зависимости от характера исследования.

Мы также адаптировали метод, разработанный Keren et al.5, для устранения ранее существовавших персистентов в наших клеточных культурах до инокуляции в микрочипы. Известно, что персистенторы типа I генерируются во время стационарной фазы; поэтому прямая инокуляция клеток из ночных культур в пластины микрочипов будет передавать значительное количество персистентов, что может препятствовать воздействию осмолитов. С помощью экспериментов с циклом разбавления/роста (см. Протокол 2) мы смогли значительно уменьшить эти ранее существовавающие персистенции, возникающие из ночных культур19. Отметим, что мы культивировали клетки в пластинах микрочипов в течение 24 ч, чтобы иметь возможность подсчитать все персистенты, включая варианты I типа, которые образуются во время стационарной фазы в присутствии осмолитов. Однако эти адаптированные методы всегда могут быть изменены в зависимости от характера исследования.

Мы обработали клетки в микрочипах 5 мкг/мл OFX, чтобы перечислить персистент. Поскольку процедура промывки для удаления антибиотика из 96 образцов была бы очень трудоемкой, клетки после лечения последовательно разбавляли в PBS без промывки (см. шаг 4.2). Эта процедура разбавляла концентрацию OFX более чем в 30 раз. Затем разбавленные клеточные суспензии накладывались на безантибиотиков агартовые пластины, где OFX дополнительно рассеивали. Наши предварительные исследования, в которых мы повторяли эти эксперименты со стиркой и без нее, подтвердили, что этот метод серийного разбавления не повлиял на уровни персистента19.

Во время многоканальной пипетки в 96 пластинах скважин следует тщательно перемешивать клеточные суспензии для поддержания однородного клеточного распределения. Для этого в зависимости от рабочего объема было бы выгодно отметить минимальное количество пипетки, которое необходимо для того, чтобы сделать раствор однородным. Для этого мы провели простой контрольный эксперимент, в котором контролировали пипетку (вверх и вниз) путем диспергирования молекулы красителя в PBS и среде в условиях, изученных здесь. Кроме того, при работе с более сложными средами, такими как буферы pH, мы бы предложили измерить pH клеточной культуры до и во время инкубации в шейкере, поскольку клеточная культура имеет тенденцию быть очень щелочной (pH ≈ 8) с течением времени. Это может дать представление о качестве, а также о диапазоне рН используемого буфера. Кроме того, для получения счетных КОЕ на агаровых пластинах из высокопроизводительных анализов перед тестированием микрочипов следует оптимизировать определенные условия, такие как скорость посева клеток, возраст культур и параметры последовательного разбавления (объем PBS, скорость разбавления и количество этапов разбавления и т. Д.). Наконец, результаты, полученные из микрочипов, должны быть дополнительно проверены в колбах, поскольку объем культуры, площадь поверхности и аэрация в пластине из 96 скважин могут оказать дополнительное влияние на наблюдаемые результаты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить членов Orman Lab за их ценный вклад в это исследование. Это исследование финансировалось премией NIH / NIAID K22AI125468 за переход к карьере и грантом на запуск Университета Хьюстона.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14-ml test tube Fisher Scientific 14-959-1B
E. coli strain MG1655 Princeton University Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-5161
Gas permeable sealing membrane VWR 102097-058 Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate VWR 82050-062
LB agar Fisher Scientific BP1425-2 Molecular genetics grade
Ofloxacin salt VWR 103466-232 HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) Biolog N/A PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-0161
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500 Certified ACS grade
Sodium nitrate Fisher Scientific AC424345000 ACS reagent grade
Sodium nitrite Fisher Scientific AAA186680B 98% purity
Square petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Tryptone Fisher Scientific BP1421-500 Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader Thermo Fisher Scientific VLBL00D0 Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-100 Molecular genetics grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
  2. Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
  3. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
  4. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  5. Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
  6. Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
  7. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  8. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  9. Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
  10. Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
  11. Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
  12. Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
  13. Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
  14. Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
  15. Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
  16. Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
  17. Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
  18. Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
  19. Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
  20. Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
  21. Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
  22. Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
  23. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
  24. Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
  25. Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).

Tags

Втягивание выпуск 168 персистенты высокопроизводительный скрининг фенотипные микрочипы рН осмолиты антибиотики
Высокопроизводительный скрининг химических соединений для выяснения их влияния на бактериальную персистенцию
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karki, P., Orman, M. A.… More

Karki, P., Orman, M. A. High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence. J. Vis. Exp. (168), e61597, doi:10.3791/61597 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter