Summary
In questo documento di metodo, presentiamo una strategia di screening ad alta produttività per identificare composti chimici, come gli osmoliti, che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.
Abstract
I persister batterici sono definiti come una piccola sottopopolazione di varianti fenotipiche con la capacità di tollerare alte concentrazioni di antibiotici. Sono un'importante preoccupazione per la salute in quanto sono stati associati a infezioni croniche ricorrenti. Sebbene le dinamiche stocastiche e deterministiche dei meccanismi legati allo stress svolgano un ruolo significativo nella persistenza, i meccanismi alla base del passaggio fenotipico da/verso lo stato di persistenza non sono completamente compresi. Mentre i fattori di persistenza innescati dai segnali ambientali (ad esempio, l'esaurimento delle fonti di carbonio, azoto e ossigeno) sono stati ampiamente studiati, gli impatti degli osmoliti sulla persistenza devono ancora essere determinati. Utilizzando microarray (cioè 96 piastre di pozzo contenenti varie sostanze chimiche), abbiamo progettato un approccio per chiarire gli effetti di vari osmoliti sulla persistenza di Escherichia coli in modo ad alta produttività. Questo approccio è trasformativo in quanto può essere facilmente adattato per altri array di screening, come pannelli di farmaci e librerie di knockout genico.
Introduction
Le colture batteriche contengono una piccola sottopopolazione di cellule persistenti che sono temporaneamente tolleranti a livelli insolitamente elevati di antibiotici. Le cellule persistenti sono geneticamente identiche ai loro parenti sensibili agli antibiotici e la loro sopravvivenza è stata attribuita all'inibizione transitoria della crescita1. Le cellule persistenti sono state scoperte per la prima volta da Gladys Hobby2, ma il termine è stato usato per la prima volta da Joseph Bigger quando le ha identificate nelle colture di Staphylococcus pyogenes trattate con penicillina3. Uno studio seminale pubblicato da Balaban et al. I persister sono rilevati da test di sopravvivenza clonogenici, in cui i campioni di coltura vengono prelevati a vari intervalli durante i trattamenti antibiotici, lavati e placcati su un tipico mezzo di crescita per contare le cellule sopravvissute che possono colonizzare in assenza di antibiotici. L'esistenza di persistenti in una coltura cellulare è valutata da una curva di uccisione bifasica4,5 in cui il decadimento esponenziale iniziale indica la morte di cellule sensibili agli antibiotici. Tuttavia, la tendenza all'uccisione diminuisce nel tempo, portando infine a una regione di altopiano che rappresenta le cellule persistenti sopravvissute.
Le cellule persistenti sono state associate a varie malattie come la tubercolosi6,la fibrosi cistica7,la candidosi8 e le infezioni del tratto urinario9. Quasi tutti i microrganismi testati finora hanno generato fenotipi persistenti, tra cui Mycobacterium tuberculosis6ad alta patogenicità, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 e Candida albicans8. Studi recenti forniscono anche prove dell'ascesa di mutanti multirrogatori dalle sottopopolazioni persistenti11,12. Notevoli sforzi in questo campo hanno rivelato che i meccanismi di persistenza sono molto complessi e diversificati; sia i fattori stocastico che deterministico associati ai sistemi di risposta SOS13,14, specie reattive dell'ossigeno (ROS)15, tossina/antitossina (TA)16, autofagia o autodigestione17 e risposta rigorosa correlata al ppGpp18 sono noti per facilitare la formazione persister.
Nonostante i significativi progressi nella comprensione del fenotipo di persistenza, gli effetti degli osmoliti sulla persistenza batterica non sono stati pienamente compresi. Poiché il mantenimento di una pressione osmotica ottimale è una necessità per la crescita delle cellule, il corretto funzionamento e la sopravvivenza, uno studio approfondito degli osmoliti potrebbe portare a potenziali obiettivi per strategie anti-persistenti. Sebbene lo screening laborioso e ad alta produttività sia un approccio molto efficace per identificare metaboliti e altre sostanze chimiche che svolgono un ruolo cruciale nel fenotipo di persistenza19,20. In questo lavoro, discuteremo il nostro metodopubblicato 19, dove abbiamo usato microarray, cioè 96 piastre di pozzo contenenti vari osmoliti (ad esempio, cloruro di sodio, urea, nitrito di sodio, nitrato di sodio, cloruro di potassio), per identificare gli osmoliti che influenzano significativamente la persistenza di E. coli.
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Protocol
1. Preparazione del mezzo di crescita, della soluzione di ofloxacina e delle scorte di cellule E. coli
- Mezzo regolare Luria-Bertani (LB): Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata (DI). Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.
- Piastre di agar LB: Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 15 g/L di agar in acqua DI e sterilizzare il mezzo mediante autoclave. Alla temperatura desiderata (~55 °C), versare ~30 mL di mezzo agar in piastre quadrate (10 x 10 cm). Asciugare i piatti e conservare a 4 °C.
- Mezzo LB modificato: Aggiungere 10 g/L di triptono e 5 g/L di estratto di lievito in acqua DI. Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.
- Mezzo LB modificato incluso un osmolita: mescolare 2x mezzo LB modificato con una soluzione di osmolita 2x in volumi uguali. Per preparare 2x mezzo LB modificato, aggiungere 20 g/L di triptono e 10 g/L di estratto di lievito in acqua DI e sterilizzare mediante autoclave. Per preparare la soluzione di osmolita 2x, sciogliere l'osmolita di interesse (quantità 2x) in acqua DI, quindi filtrare sterilizzare la soluzione.
NOTA: L'osmolita di interesse e le sue concentrazioni possono essere determinati dai test di screening del fenotipo microarray (cfr. protocollo 4). Tuttavia, l'osmolita testato e la concentrazione 2x associata possono essere regolati in base alla natura della ricerca. Ad esempio, per studiare l'impatto del cloruro di sodio da 1 mM, una soluzione di osmolita 2x sarebbe una soluzione di cloruro di sodio da 2 mM. - Soluzione di stock di ofloxacina (5 mg/mL): Aggiungere 5 mg di sale di ofloxacina (OFX) in 1 mL di acqua DI. Aggiungere 10 μL di idrossido di sodio 10 M per aumentare la solubilità dell'OFX in acqua, quindi filtrare sterilizzare la soluzione. Preparare le aliquote e conservare a -20 °C.
NOTA: L'ofloxacina è un antibiotico del quinolone che è stato ampiamente utilizzato sia per le cellule batteriche in crescita che per quelle non increscita 14,21. La concentrazione inibitoria minima (MIC) di OFX per le cellule E. coli MG1655 rientra nell'intervallo 0,039-0,078 μg/mL19,20. Si noti inoltre che altri antibiotici come l'ampicillina e la kanamicina sono comunemente usati nella ricerca persister. La scelta degli antibiotici dipende dalla natura dello studio. - E. coli Scorte cellulari MG1655: Inoculare 2 ml di mezzo LB regolare con una singola colonia in una provetta da 14 mL (snap-capped) e colturare le cellule in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C. Quando le cellule raggiungono la fase stazionaria, mescolare 500 μL della coltura cellulare con 500 μL di glicerolo 50% (sterile) in una fiala criogenica e conservare a -80 °C.
2. Propagazione delle cellule per eliminare i persister preesistenti
- Per preparare una coltura notturna, raschiare una piccola quantità di cellule da un calcio cellulare congelato con una punta di pipetta sterile (non scongelare il materiale cellulare di glicerolo) e inoculare le cellule in 2 ml di mezzo LB modificato in una provetta con snap-capped da 14 ml. Coltura delle cellule in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C per 12 ore.
- Prima propagazione
- Dopo 12 ore, trasferire 250 μL di coltura notturna a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml coperto da un foglio di alluminio sterile.
- Far crescere la coltura cellulare in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a quando le cellule non raggiungono la fase medio-esponenziale (OD600 = 0,5).
- Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando un lettore di micropiatte ogni 30 minuti.
- Seconda propagazione
- A600 OD = 0,5, diluire 250 μL di coltura cellulare dal primo pallone in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml.
- Far crescere la seconda coltura cellulare in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a600=0,5 OD.
- Misurare la densità ottica ogni 30 minuti.
NOTA: una coltura notturna può avere una quantità significativa di celle persistenti4,5,22. Il metodo del ciclo didiluizione/crescita 5 sopra descritto può essere utilizzato per eliminare questi persister preesistenti prima di trasferire le cellule in microarray. La loro eliminazione può essere convalidata quantificando i livelli persistenti di colture notturne con il saggio descritto nel protocollo n. 3. Questo metodo è già stato convalidato in uno studio precedente19.
3. Convalida dell'eliminazione delle celle persistenti preesistenti
- Dopo la seconda propagazione (vedi fase 2.3), diluire 250 μL della coltura cellulare (OD600 = 0,5) in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml.
NOTA: Per i comandi, diluire 250 μL di coltura notturna (vedi fase 2.1) in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml. Prima di trasferire le cellule nel pallone, la densità cellulare della coltura notturna deve essere regolata in un mezzo LB fresco modificato per ottenere OD600 = 0,5. - Aggiungere 25 μL di soluzione stock OFX (5 mg/mL) nella sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del saggio. La concentrazione finale di OFX è di 5 μg/mL nella coltura del saggio.
- Incubare la coltura del saggio in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C.
- Ad ogni ora durante il trattamento (incluso 0 h, il punto di tempo prima di aggiungere OFX nella coltura del dosaggio), trasferire 1 ml della coltura di dosaggio dal pallone a un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
- Centrifugare la coltura di dosaggio nel tubo di microcentrifugo a 17.000 x g per 3 min.
- Rimuovere con cura 950 μL del supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Aggiungere 950 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nel tubo di microcentrifugo.
- Ripetere i passaggi di lavaggio 3.5-3.7 per 3x in totale fino a quando la concentrazione antibiotica è inferiore alla concentrazione inibitoria minima (MIC).
- Dopo il lavaggio finale, resuspend il pellet cellulare in 100 μL di soluzione PBS, con conseguente 10x campione concentrato.
- Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire serialmente sei volte in 90 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra inferiore ben rotonda da 96.
- Spot 10 μL di sospensioni cellulari diluite su piastre di agar fresche senza antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 μL di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca.
- Incubare le piastre di agar a 37 °C per 16 ore, quindi contare le unità di formazione della colonia (CFC). Tenere conto dei tassi di diluizione durante il calcolo del numero totale di CFC in 1 mL di coltura di saggi. Le curve di uccisione vengono generate tracciando i valori logaritmici della CFU rispetto alla durata del trattamento antibiotico.
NOTA: Un trattamento OFX di 6 ore è sufficiente per ottenere una curva di uccisione bifasica per le cellule E. coli 19,20. Il livello più persistente di cellule propagate (misurato dal conteggio cfu a 6 ore) dovrebbe essere significativamente inferiore a quello della coltura overnight. Le procedure descritte nei protocolli 2 e 3 possono essere eseguite con LB regolare a seconda della progettazione della ricerca.
4. Screening delle piastre microarray
- Preparazione delle colture microarray-cell
- Trasferire 250 μL di cellule in fase esponenziale a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
NOTA: Le cellule in fase esponenziale (OD600 = 0,5) sono ottenute dal secondo passaggio di propagazione (vedere fase 2.3). - Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile da 50 mL.
- Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 μL della sospensione cellulare ad ogni pozzo di un microarray, cioè una piastra di 96 pouf contenente vari osmoliti.
NOTA: I pozzi che non hanno osmoliti fungono da controlli. - Coprire il microarray con una membrana di tenuta permeabile al gas.
- Incubare la piastra in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 ore.
NOTA: In questi esperimenti sono state utilizzate piastre disponibili in commercio, come Phenotype Microarrays (PM-9 e PM-10) che includono una vasta gamma di osmoliti, tamponi di pH e altre sostanze chimiche in uno stato essiccato a varie concentrazioni. Questi microarray sono in formati a piastre a mezza area 96. I volumi di coltura devono essere regolati in base al tipo di piastre utilizzate. I microarray possono anche essere generati manualmente (vedi sotto).
- Trasferire 250 μL di cellule in fase esponenziale a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
- Preparazione manuale di piastre microarray
- Trasferire 75 μL di soluzioni di osmoliti 2x nei pozzi di una piastra di pozzo 96 semi-area.
- Trasferire 500 μL di cellule in fase esponenziale a 25 ml di mezzo LB modificato 2x in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
NOTA: Il tasso di inoculazione è stato regolato in modo da essere coerente con il protocollo di screening microarray descritto al 4.1. - Aggiungere 75 μL della sospensione cellulare in ogni pozzo della piastra del pozzo 96 a mezza area contenente soluzioni di osmoliti 2x.
- Incubare la piastra in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 ore.
- Preparazione di piastre di dosaggio persistenti
- Preparare 25 ml di mezzo LB modificato contenente 5 μg/ml di OFX in un tubo di centrifuga da 50 ml e trasferire questo mezzo in un serbatoio sterile.
- Trasferire 190 μL di mezzo LB modificato con OFX dal serbatoio in ogni pozzo di una piastra generica a fondo piatto da 96 poggiale (piastra di dosaggio persister) utilizzando una pipetta multicanale.
- Rimuovere il microarray dallo shaker (dopo la coltivazione per 24 ore) e trasferire 10 μL di colture cellulari dal microarray ai pozzi della piastra di dosaggio persister, contenente mezzo LB modificato con OFX.
- Prendere 10 μL di sospensioni cellulari dalla piastra di dosaggio persister e diluire serialmente tre volte in 290 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra di pozzo 96 a fondo rotondo e una pipetta multicanale.
- Dopo la diluizione seriale, individuare 10 μL di tutte le sospensioni cellulari diluite in serie su piastre di agar fresche senza antibiotici utilizzando una pipetta multicanale.
- Incubare la piastra di dosaggio persister (preparata al passaggio 4.3.3) in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 6 ore dopo aver coperto la piastra con una membrana di tenuta permeabile al gas.
- Dopo 6 ore di incubazione in uno shaker, estraere la piastra di dosaggio persister e ripetere i passaggi 4.3.4-4.3.5.
- Incubare le piastre di agar per 16 ore a 37 °C, quindi contare i CFC. I livelli di CFU prima e 6 ore dopo il trattamento antibiotico consentono di calcolare la frazione più persistente in ogni pozzo. Il CFU conta prima del trattamento OFX aiuta anche a valutare gli effetti degli osmoliti e sulla vitalità di E. coli.
5. Convalida delle condizioni identificate
- Trasferire 250 μL delle cellule di fase esponenziale dal passaggio 2.3 a 25 mL di mezzo LB fresco modificato contenente l'osmolita identificato dallo screening del microarray (vedi protocollo 4).
- Incubare il pallone in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C per 24 ore.
- Dopo 24 ore, rimuovere il pallone dallo shaker e trasferire 250 μL della coltura cellulare a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 mL.
- Aggiungere 25 μL di soluzione stock OFX (5 mg/mL) nella sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del dosaggio. Incubare il pallone in uno shaker a 37 °C e 250 giri/min.
- Ad ogni ora durante il trattamento, trasferire 1 ml della coltura del saggio dal pallone a un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
- Centrifugare la coltura di dosaggio nel tubo di microcentrifugo a 17.000 x g per 3 min.
- Rimuovere 950 μL di supernatante e aggiungere 950 μL di PBS.
- Ripetere i passaggi di lavaggio 5.6 e 5.7 per 3x.
- Dopo il lavaggio finale, rimorsi il pellet cellulare in 100 μL di soluzione PBS.
- Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire serialmente 6x in 90 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra inferiore ben rotonda 96.
- Individuare 10 μL delle sospensioni cellulari diluite su una piastra di agar fresca priva di antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 μL di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca.
- Incubare la piastra di agar a 37 °C per 16 ore, quindi contare i CFC.
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Representative Results
La figura 1 descrive il nostro protocollo sperimentale. Gli esperimenti del ciclo di diluizione/crescita (cfr. protocollo n. 2) sono stati adattati da uno studio condotto da Keren etal. La figura 2A è un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. In questi esperimenti, le cellule sono state coltivate in mezzo LB modificato con osmoliti in piastre di pozzo a mezza area 96 come descritto nel passaggio 4.2. Dopo aver incubato la piastra in uno shaker orbitale per 24 ore, il saggio persister è stato eseguito utilizzando una piastra generica piatta inferiore di 96 poggia (vedere fase 4.3). Gli osmoliti e la concentrazione qui testata sono stati scelti sulla base del nostro precedentestudio 19,dove abbiamo eseguito i passaggi 4.1 e 4.3 utilizzando la piastra PM-9 che include vari osmoliti a diverse concentrazioni (cloruro di sodio, cloruro di potassio, solfato di sodio, glicole etilenico, formato sodio, urea, lattato di sodio, fosfato di sodio, benzoato di sodio, solfato di ammonio, nitrito di sodio e nitrato di sodio). La prima colonna della figura 2A mostra i conteggi CFU del gruppo di controlli. La seconda colonna rappresenta una condizione in cui le cellule sono state coltivate in nitrato di sodio da 100 mM; questa condizione è stata precedentemente riscontrata per aumentare leggermente i livelli piùpersistenti 19. La terza colonna rappresenta una condizione in cui le cellule sono state coltivate in nitrito di sodio da 60 mM e questa condizione è stata precedentemente trovata per ridurre significativamente i livelli più persistenti rispettoai controlli 19. La figura 2B è una rappresentazione grafica dei dati CFU ottenuti dalle piastre di agar. La figura 2C mostra le frazioni più persistenti delle colture cellulari testate in 96 piastre di pozzo. Per calcolare le frazioni, i conteggi dei persistenti sono stati normalizzati in base al conteggio cellulare ottenuto prima dei trattamenti antibiotici. La figura 3 mostra le curve di uccisione bifasica e le frazioni più persistenti, rispettivamente, per le colture di saggi eseguite in fiasche sconcertate. In questi esperimenti, le cellule sono state coltivate per la prima volta in 25 mL di mezzo LB modificato con gli osmoliti indicati in mastri sconcertati da 250 mL per 24 ore, e quindi le cellule sono state trasferite in matasse di dosaggio persister per l'enumerazione persister come descritto nel protocollo 5.
Figura 1: La procedura sperimentale. Le cellule di un patrimonio cellulare congelato sono state coltivate durante la notte (12 ore) in mezzo LB fresco. Alle 12 h, la coltura notturna è stata diluita (1:100) in 25 mL di mezzo LB modificato e coltivata fino a600OD =0,5. Questo passaggio di propagazione è stato ripetuto due volte. Dopo la fase finale di propagazione, le cellule di fase esponenziale (a OD600=0,5) sono state diluite (1:100) in un mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 mL e un tubo di centrifuga da 50 mL, rispettivamente. La sospensione cellulare nel pallone sconcertato da 250 mL è stata trattata con 5 μg/ml di OFX per quantificare i persister. La sospensione cellulare nel tubo di centrifuga da 50 ml è stata trasferita a microarray e incubata per 24 ore in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C. Le cellule dei microarray sono state quindi trasferite in piastre di dosaggio persister per quantificare i persister. Questa figura è stata creata utilizzando biorender.com. Questa cifra è stata modificata rispetto alla nostra precedentepubblicazione 19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esperimenti di microarray. (A) Le cellule sono state coltivate per la prima volta in mezzo LB modificato con o senza osmoliti indicati in una piastra di pozzo di mezza area 96 per 24 ore. Le cellule sono state quindi trasferite su una piastra generica a fondo piatto da 96 poggiagli e trattate con 5 μg/mL di OFX per 6 h. Prima e dopo il trattamento di 6 ore, le cellule sono state diluite serialmente in PBS, placcate su piastre di agar e incubate a 37 °C per 16 ore. Ogni condizione ha 8 repliche tecniche. (B) Sono state effettuate misurazioni della CFU per valutare gli effetti degli osmoliti rispettivamente sulla vitalità e sulla persistenza delle cellule. La linea retta indica il limite di rilevamento (600 CFC). (C) Il grafico rappresenta le frazioni più persistenti delle colture cellulari, calcolate prendendo il rapporto dei conteggi CFU dopo e prima del trattamento OFX. La frazione più persistente della coltura cellulare con nitrito di sodio da 60 mM non è stata calcolata in quanto il suo livello persistente è inferiore al limite di rilevamento. Ogni punto dati è stato indicato per valore medio ± deviazione standard, calcolata da 8 repliche tecniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esperimenti di convalida. (A) Le cellule in fase esponenziale sono state trasferite a 25 mL di mezzo LB fresco modificato con osmoliti indicati in mastri sconcertati da 250 mL e coltivate per 24 ore. Quindi, le cellule sono state diluite (1:100) in mastri sconcertati da 250 mL contenenti 25 mL di mezzo LB modificato e trattate con 5 μg/mL OFX per 6 h. I conteggi CFU nelle colture di saggi sono stati monitorati ogni ora per generare curve di uccisione bifasica. * indica la condizione che influisce significativamente sui livelli di persister OFX rispetto ai controlli senza osmoliti (test t di varianza disuguale a due code, p<0,05). (B) Il grafico rappresenta le frazioni più persistenti delle colture. Ogni punto dati è stato indicato per valore medio ± deviazione standard, calcolata da 3 repliche biologiche. Questa cifra è stata modificata rispetto alla nostra precedentepubblicazione 19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il saggio persister ad alta produttività qui descritto è stato sviluppato per chiarire gli effetti di varie sostanze chimiche sulla persistenza di E. coli. Oltre alle piastre PM commerciali, i microarray possono essere costruiti manualmente come descritto al passaggio 4.2. Inoltre, il protocollo qui presentato è flessibile e può essere utilizzato per schermare altri microarray, come pannelli antidroga e librerie cellulari, che sono in 96 formati di piastra di pozzo. Le condizioni sperimentali, compresa la fase di crescita, il tasso di inoculazione e il mezzo, possono essere regolate per testare queste librerie. Ad esempio, se si desidera migliorare una libreria di celle, ad esempio Keio E. coli knockout collection23, possono prima trasferire i ceppi dalla libreria a 96 piastre di pozzo che includono supporti freschi, utilizzando una pipetta multicanale. Una volta che le cellule raggiungono la fase di crescita desiderata (ad esempio, fase esponenziale o stazionaria), le cellule vengono quindi trasferite su piastre di dosaggio persister come descritto nel passaggio 4.3 per enumerare i livelli più persistenti dei ceppi knockout. Allo stesso modo, questa strategia può essere utilizzata per migliorare la collezione24 di E. coli Promoter (una libreria di ceppi di reporter fluorescenti in 96 formati di piastre di pozzo) per identificare i promotori attivati dagli antibiotici. Questi promotori possono essere prontamente rilevati misurando i segnali di fluorescenza dei ceppi nelle piastre di dosaggio persister durante il trattamento antibiotico.
Nei nostri esperimenti, abbiamo usato un LB modificato (privo di NaCl) per evitare qualsiasi effetto aggiuntivo che potrebbe derivare dal NaCl, considerando che i microarray hanno già vari osmoliti. Sebbene nacl in mezzo LB regolare sia noto per essere buono per preservare l'integrità della membrana delle cellule, è stato riferito che nacl a 0-1% intervallo ha un effetto minimo sulla crescita cellulare25. Inoltre, i risultati della colorazione propidio ioduro (PI) e dei saggi persistenti nel nostro studio precedente hanno dimostrato che l'assenza di NaCl non influisce in modo significativo sull'integrità della membrana e sulla persistenza delle cellule E. coli 19. Questa modifica è stata apportta specificamente per rispondere alle preoccupazioni del nostro studio e può essere modificata in base alla natura della ricerca.
Abbiamo anche adattato un metodo sviluppato da Keren etal. I persister di tipo I sono noti per essere generati durante la fase stazionaria; pertanto, l'inoculazione diretta delle cellule dalle colture notturne in piastre di microarray trasferirebbe un numero significativo di persistenti, il che potrebbe ostacolare gli effetti degli osmoliti. Con gli esperimenti del ciclo di diluizione/crescita (cfr. protocollo 2), siamo stati in grado di ridurre significativamente questi persister preesistenti derivanti dallecolture notturne 19. Notiamo che abbiamo coltivato le cellule in piastre di microarray per 24 ore per poter contare tutti i persister, comprese le varianti di tipo I che si formano durante la fase stazionaria in presenza di osmoliti. Tuttavia, queste tecniche adattate possono sempre essere modificate a seconda della natura dello studio.
Abbiamo trattato le cellule in microarray con 5 μg/mL OFX per enumerare i persister. Poiché la procedura di lavaggio per rimuovere l'antibiotico da 96 campioni sarebbe molto laboriosa, le cellule dopo il trattamento sono state diluite in serie in PBS senza lavaggio (vedere fase 4.2). Questa procedura ha diluito la concentrazione di OFX più di 30 volte. Le sospensioni cellulari diluite sono state quindi placcate su piastre di agar senza antibiotici dove l'OFX è stato ulteriormente disperso. I nostri studi preliminari in cui abbiamo ripetuto questi esperimenti con e senza lavaggio hanno verificato che questo metodo di diluizione seriale non ha influenzato i livelli più persistenti19.
Durante la pipettazione multicanale in 96 piastre di pozzo, si dovrebbe mescolare attentamente le sospensioni cellulari per mantenere una distribuzione omogenea delle celle. Per fare ciò, a seconda del volume di lavoro, sarebbe utile notare il numero minimo di pipettazione necessario per rendere omogenea la soluzione. A questo scopo, abbiamo condotto un semplice esperimento di controllo in cui abbiamo monitorato la pipettazione (su e giù) disperdendo una molecola di colorante in PBS e mezzo nelle condizioni qui studiate. Inoltre, se si lavora con ambienti più complessi come i tamponi di pH, suggeriamo di misurare il pH della coltura cellulare prima e durante l'incubazione in uno shaker poiché la coltura cellulare tende ad essere molto alcalina (pH ≈ 8) nel tempo. Questo può dare un'idea della qualità e dell'intervallo di pH del buffer utilizzato. Inoltre, al fine di ottenere CLU numerabili sulle piastre di agar dai saggi ad alta produttività, alcune condizioni, come il tasso di inoculazione cellulare, l'età delle colture e i parametri di diluizione seriale (volume PBS, tassi di diluizione e numero di passaggi di diluizione, ecc.) dovrebbero essere ottimizzate prima di testare i microarray. Infine, i risultati ottenuti dai microarray dovrebbero essere ulteriormente convalidati in contenitori in quanto il volume della coltura, della superficie e dell'aerazione in una piastra di 96 potte potrebbe avere effetti aggiuntivi sui risultati osservati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri di Orman Lab per i loro preziosi contributi durante questo studio. Questo studio è stato finanziato dal nih/NIAID K22AI125468 career transition award e da una borsa di studio per le startup dell'Università di Houston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
- Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
- Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
- Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
- Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
- Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
- Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
- Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
- Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
- Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
- Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
- Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
- Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
- Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
- Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
- Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
- Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).
