Indsamling af skeletmuskulatur biopsier fra superior rum humane musculus Tibialis forreste til mekanisk evaluering

Summary

Denne tekniske rapport beskriver en variation af den modificerede Bergström teknik til biopsi af musculus tibialis forreste, der begrænser fiberskader.

Abstract

De mekaniske egenskaber ordregivende skeletfibre er afgørende indikatorer for generelle muskel sundhed, funktion, og ydeevne. Humane skeletmuskulatur biopsier er ofte indsamlet for disse bestræbelser. Der findes dog relativt få tekniske beskrivelser af biopsiprocedurer uden for de almindeligt anvendte musculus vastus lateralis. Selv om biopsi teknikker er ofte justeret til at rumme de særlige kendetegn ved hver muskel under undersøgelse, få tekniske rapporter deler disse ændringer til større samfund. Således muskelvæv fra menneskelige deltagere er ofte spildt som operatøren genopfinder hjulet. Udvidelse af det tilgængelige materiale på biopsier fra en række muskler kan reducere hændelsen af mislykkede biopsier. Denne tekniske rapport beskriver en variation af den modificerede Bergström teknik på musculus tibialis forreste, der begrænser fiber skader og giver fiber længder tilstrækkelig til mekanisk evaluering. Operationen er en ambulant procedure, der kan afsluttes i en time. Restitutionsperioden for denne procedure er øjeblikkelig for let aktivitet (dvs. gang), op til tre dage for genoptagelse af normal fysisk aktivitet, og omkring en uge for sårpleje. Det udtrukne væv kan bruges til mekaniske kraftforsøg, og her præsenterer vi repræsentative aktiveringsdata. Denne protokol er velegnet til de fleste indsamlingsformål, potentielt kan tilpasses andre skeletmuskulatur, og kan forbedres ved ændringer af indsamlingsnålen.

Introduction

Studiet af human muskelfysiologi til kliniske eller forskningsmæssige formål kræver ofte muskelbiopsier. For eksempel, en stor udfordring i menneskelige muskel fysiologi og biomekanik er at skelne mellem og forstå de forskellige tilpasninger af muskel ydeevne til at udøve. Præstationstilpasninger omfatter ikke kun strukturelle tilpasninger (f.eks. ændringer i kontraktile proteiner, muskelarkitektur), men omfatter også neurale^{tilpasninger 1}, som er meget svære, hvis ikke umulige, at vurdere separat, når man tester intakte in situ menneskelige muskler. Fiber-niveau eksperimenter fjerne disse højere orden komponenter og giver mulighed for en mere direkte evaluering af muskelsammentrækning og kan indsamles via biopsi teknikker. Muskelbiopsier er blevet indsamlet siden mindst 1868². I dag er den fremherskende teknik til at indsamle muskelbiopsier den modificerede Bergström teknik^3,4,5, selv om andre teknikker er tilgængelige, herunder brugen af en Weil-Blakesley conkotome⁶ eller den såkaldte fine-needle^7,8. Alle disse teknikker bruger specielle nåle-lignende instrumenter, der er designet til at passere ind i muskler og skære et stykke væv. Specifikt bruger den modificerede Bergström teknik en stor modificeret nål (5 mm nålestørrelse her; Figur 1) der har et vindue tæt på nålespidsen og en mindre indvendig trokar, der bevæger sig op og ned ad nålen, og skærer musklen, når du passerer over nålevinduet. Inden for denne hellige trokar er en ramrod, der bevæger sig op og ned ad skaftet af trokaren og skubber biopsi mod nålen vinduet. For at trække musklen ind i nålevinduet, en sugeslange er fastgjort, som suger luft ud af nålen og trækker musklen ind i nålen vinduet via undertryk.

Muskelbiopsier er ofte erhvervet til at studere ændringer i proteinindhold, genekspression, eller morfologi forårsaget af sygdom eller i en reaktion på en øvelse program^1,,9,,10,11. En anden kritisk brug for muskel biopsier er mekaniske eksperimenter såsom måling af fiber kontraktile kraft, muskel fiber stivhed, og historie-afhængige muskel egenskaber^{12,,13,,14,,15,16}. Enkelt fiber eller fiber bundt mekanik måles ved at fastgøre fibre mellem en længde motor og kraft transducer på specialiserede rigge, der styrer fiber længde og samtidig måle kraft. Ved permeabilizing (f.eks flåning) fibre, sarcolemma membran bliver gennemtrængelig for kemikalier i badet løsning, giver mulighed for aktivering kontrol ved at variere calcium koncentration. Desuden kan virkningen af kontraktile egenskaber på kemikalier/lægemidler/andre proteiner let vurderes ved at tilsætte det pågældende reagens til badeopløsningen. Men, mens denne teknik er meget brugt i andre dyremodeller, mærkbart færre undersøgelser gennemført mekaniske test på flåede fibre fra menneskelige muskel biopsier^17,18,19. En af grundene er, at biopsi værktøjer og protokoller er designet til at fjerne så meget muskelvæv som muligt med mindre hensyn til niveauet af strukturelle skader under vævsudvinding. Faktisk, en nylig biopsi protokol foreslår at drive biopsi nål i musklen og indsamle 2-4 bidder af muskel³. Selve processen gør lidt skade på DNA eller protein materiale, men ofte ødelægger fiber og sarcomeric strukturer på en sådan måde, at aktivering af muskelfibre bliver ustabil eller umuligt. Desuden er den relative længde af fibre i biopsi typisk korte (<2 mm) og ikke let håndteres til mekanisk test. Til mekanisk test er ideelle fibre lange (3-5 mm) og ikke strukturelt beskadigede.

Mere avancerede væv udvinding teknikker kan bruges til at begrænse fiberskader. For eksempel, en gruppe^{20 benyttede} sig af tidligere planlagte “åbne operationer” af underarme (f.eks knoglebrud reparation), hvor musklerne var fuldt eksponeret og en kirurg var i stand til at visualisere muskelstruktur og omhyggeligt dissekere relativt store og strukturelt ubeskadigede prøver af muskelvæv (15 mm x 5mm x 5 mm). Denne “åbne biopsi” teknik foretrækkes, når deltagerne gennemgår en tidligere planlagt procedure, og så begrænser puljen af potentielle deltagere, især for raske voksne, hvor ingen operationer ellers ville finde sted. Således er mange biopsier udført til forskningsformål sker som en ambulant procedure og indsnit site holdes så lille som muligt for at begrænse infektion risiko, ardannelse, og helbredende tid. Derfor indsamles de fleste biopsier blindt (dvs. operatøren er ikke i stand til at se indsamlingsnålen, når den passerer gennem fasciaen ind i musklen). Dette indebærer, at kvaliteten af biopsi er næsten udelukkende baseret på dygtighed og erfaring af operatøren. Hver muskel har sine egne vanskeligheder, når indsamling væv, såsom risici for at krænke nerver og blodkar, udvælgelse af en ideel indsamling dybde og placering, og beslutter på en passende kropsstilling for at holde musklen så slap som muligt. Desværre er de fleste af de muskel-specifikke skillsets ikke skrevet ned, og så hver læge skal “genopfinde hjulet”, når de udfører biopsier på muskler nye for dem. Denne mangel på erfaring fører normalt til flere samlinger med lav kvalitet, indtil lægen identificerer den bedste praksis for biopsier på denne muskel. Novice læger lærer ofte dygtighed gennem samtaler med deres mere erfarne kolleger, men relativt få informative og peer-reviewed tekster findes på området, især for muskler, der ikke traditionelt anvendes til biopsi indsamling. Hvis vi ser på ovenstående oplysninger, sammen med vanskeligheden ved at rekruttere menneskelige frivillige til biopsier, er det klart, at mere undervisning oplysninger er nødvendige, der maksimerer chancerne for succes for hver deltager.

Således, formålet med dette papir var at præsentere en muskel biopsi teknik, der giver protokoller for en vellykket indsamling af muskel biopsier med lange, ubeskadigede fiber fragmenter til mekaniske tests. Menneskelige muskel biopsier er normalt udføres på, og hovedparten af biopsi træningsmateriale er på, muskculus vastus lateralis. Dens relativt store muskel størrelse og overfladisk placering i forhold til huden giver mulighed for indsamling af passende muskelvæv, samtidig med at minimere patientens ubehag og fysiske^{traumer 1,,21}. Der er dog visse begrænsninger for at bruge vastus lateralis til uddannelse i længderetningen. For eksempel, under eksperimentelle protokoller, der omfatter et træningsprogram, skal deltagerne afstå fra yderligere uddannelse uden for studiet i en periode, der ofte spænder over 2-6 måneder. For atleter er dette ofte ikke muligt, da vastus lateralis normalt trænes under typiske øvelser (f.eks. squats, hopper) eller generelt bruges til sporten (f.eks. løb, cykling). Disse separate træningserfaringer væk fra undersøgelsens mål kan forårsage muskulære tilpasninger, der ændrer muskelmekanik, arkitektur, og fysiologi på en sådan måde, at det er vanskeligt eller umuligt at kende den sande effekt af undersøgelsens eksperimentelle protokol om muskelegenskaber. For disse typer af undersøgelser, ville det være ideelt at vælge et mål muskel, der ofte ikke er i fokus for uddannelse regimenter. Musculus tibialis anterior (TA) er en ideel målmuskel, der opfylder ovenstående krav. Desuden kan uddannelsesinterventioner målrettes mod teknisk bistand ved hjælp af kontrollerbare tilgange, f.eks. Der er næsten ingen undervisningsmateriale vedrørende en TA muskel biopsi. Derfor udviklede vi en modificeret protokol til indsamling af relativt ubeskadigede muskelbiopsier fra TA.

Protocol

BEMÆRK: Nedenfor skitserer vi en protokol til høst mekanisk ubeskadigede fibre fra TA af frivillige, der var indskrevet i en separat igangværende undersøgelse. Denne protokol svarer til den, der er beskrevet af Shanely et al.3, som har beskrevet den modificerede Bergström-teknik i vastus lateralis. De oplysninger, der præsenteres her, er blevet forfinet af vores forskningsgruppe, men er muligvis ikke ideelle til alle laboratoriegrupper eller organisationsopsætninger. Vi giver kun retningsli…

Representative Results

Hele tiden engagement for en deltager var omkring en time (10 min konsultation, 10 min ultralyd, 20 min kirurgi forberedelse og bedøvelseslæg administration, 10 min operation, og 10 min opsving). Ofte, deltagerne ubevidst aktiveret deres TA og havde brug for konsekvente påmindelser for at holde musklen så afslappet som muligt. Når biopsi nålen var inde i musklen, deltagerne normalt rapporteret en unik “tryk” fornemmelse i området omkring biopsi nålen, med lejlighedsvise perioder med moderat til intens ubehag. Eng…

Discussion

I denne rapport beskrev vi en teknik til biopsi af strukturelt ubeskadiget muskelvæv fra TA. Vi fandt, at denne procedure giver et acceptabelt indhold af brugbare muskelfibre (5-10 fiber bundt præparater pr 50 mg indsamlet væv) til mekanisk test. Desuden havde vi nok væv til opfølgende mekaniske, genetiske og proteomiske eksperimenter.

Der er flere metoder, der typisk anvendes til indsamling af muskelbiopsier^3,4,,<sup c…

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction