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Biology

Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61598
Automatic Translation
1,4, 1,2, 3
1Faculty of Sport Science, Human Movement Science, Ruhr University Bochum, 2School of Human Movement and Nutrition Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Sport Science, Sports Medicine and Sports Nutrition, Ruhr University Bochum, 4Institute of Physiology II, University of Muenster

Summary

Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata per la biopsia del musculus tibialis anteriore che limita i danni alle fibre.

Abstract

Le proprietà meccaniche di contrarre le fibre scheletriche sono indicatori cruciali della salute generale del muscolo, funzione, e le prestazioni. Le biopsie muscolari scheletriche umane sono spesso raccolte per questi sforzi. Tuttavia, sono disponibili relativamente poche descrizioni tecniche delle procedure di biopsia, al di fuori dei musculus vastus lateralis comunemente utilizzati. Anche se le tecniche di biopsia sono spesso regolate per adattarsi alle caratteristiche di ogni muscolo in fase di studio, pochi rapporti tecnici condividono questi cambiamenti alla comunità più grande. Così, tessuto muscolare da partecipanti umani è spesso sprecato come l'operatore reinventa la ruota. L'espansione del materiale disponibile sulle biopsie da una varietà di muscoli può ridurre l'incidente di biopsie fallite. Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata sul musculus tibialis anteriore che limita i danni alla fibra e fornisce lunghezze di fibra adeguate per la valutazione meccanica. L'intervento è una procedura ambulatoriale che può essere completata in un'ora. Il periodo di recupero per questa procedura è immediato per l'attività leggera (cioè camminare), fino a tre giorni per la ripresa della normale attività fisica e circa una settimana per la cura delle ferite. Il tessuto estratto può essere utilizzato per esperimenti di forza meccanica e qui presentiamo dati di attivazione rappresentativi. Questo protocollo è appropriato per la maggior parte degli scopi di raccolta, potenzialmente adattabile ad altri muscoli scheletrici, e può essere migliorato da modifiche all'ago di raccolta.

Introduction

Lo studio della fisiologia muscolare umana per scopi clinici o di ricerca spesso richiede biopsie muscolari. Ad esempio, una grande sfida nella fisiologia muscolare umana e nella biomeccanica è distinguere e comprendere i vari adattamenti delle prestazioni muscolari all'esercizio. Gli adattamenti delle prestazioni non includono solo adattamenti strutturali (ad esempio, cambiamenti nelle proteine contraili, architettura muscolare), ma includono anche adattamenti neurali1, che sono molto difficili, se non impossibili, da valutare separatamente quando si testano intatti in situ muscoli umani. Gli esperimenti di livello in fibra rimuovono questi componenti di ordine superiore e consentono una valutazione più diretta della contrazione muscolare e possono essere raccolti tramite tecniche di biopsia. Le biopsie muscolari sono state raccolte almeno dal 18682. Oggi, la tecnica predominante per raccogliere le biopsie muscolari è la tecnica modificata Bergstrom3,4,5, anche se sono disponibili altre tecniche tra cui l'uso di un conchotome Weil-Blakesley6 o il cosiddetto aghi sottili7,8. Tutte queste tecniche utilizzano speciali strumenti aghi che sono progettati per passare nel muscolo e tagliare un pezzo di tessuto. In particolare, la tecnica modificata bergstrom utilizza un grande ago modificato (5 mm di ago; Figura 1) che ha una finestra vicino alla punta dell'ago e una trocar interna più piccola che si muove su e giù per l'ago, tagliando il muscolo quando si passa sopra la finestra dell'ago. All'interno di questo trocar hallow è un ramrod che si muove su e giù per l'albero della trocar e spinge la biopsia verso la finestra dell'ago. Per tirare il muscolo nella finestra dell'ago, viene attaccato un tubo di aspirazione, che aspira l'aria dall'ago e tira il muscolo nella finestra dell'ago tramite pressione negativa.

Le biopsie muscolari sono spesso acquisite per studiare i cambiamenti nel contenuto proteico, nell'espressione genica o nella morfologia causata dalla malattia o in risposta a un programmadi esercizi 1,9,10,11. Un altro uso critico per le biopsie muscolari sono gli esperimenti meccanici come la misurazione della forza contraili in fibra, la rigidità della fibra muscolare e le proprietà muscolaridipendenti dalla storia 12,13,14,15,16. La meccanica del fascio di fibre singole o fibre viene misurata collegando fibre tra un motore di lunghezza e un trasduttore di forza su impianti specializzati che controllano la lunghezza della fibra e contemporaneamente misurano la forza. Permeabilizzando (ad esempio, la scuoiatura) le fibre, la membrana sarcolemma diventa permeabile alle sostanze chimiche nella soluzione del bagno, consentendo il controllo dell'attivazione variando la concentrazione di calcio. Inoltre, l'effetto delle proprietà contrattili sulle sostanze chimiche/prodotti farmaceutici/altre proteine può essere facilmente valutato aggiungendo il reagente in questione alla soluzione del bagno. Tuttavia, mentre questa tecnica è molto utilizzata in altri modelli animali, notevolmente meno studi condotti test meccanici su fibre scuoiate da biopsie muscolari umane17,18,19. Uno dei motivi è che gli strumenti e i protocolli di biopsia sono progettati per rimuovere il maggior tessuto muscolare possibile con meno riguardo al livello di danni strutturali subiti durante l'estrazione dei tessuti. Infatti, un recente protocollo di biopsia suggerisce di guidare l'ago biopsia nel muscolo e raccogliere 2-4 pezzi di muscolo3. Il processo stesso fa pochi danni al DNA o al materiale proteico, ma spesso distrugge le strutture di fibre e sarcomerici in modo tale che l'attivazione delle fibre muscolari diventi instabile o impossibile. Inoltre, la lunghezza relativa delle fibre all'interno della biopsia è tipicamente breve (<2 mm) e non facilmente maneggiabile per le prove meccaniche. Per i test meccanici, le fibre ideali sono lunghe (3-5 mm) e non sono strutturalmente danneggiate.

Tecniche di estrazione dei tessuti più avanzate possono essere utilizzate per limitare i danni alle fibre. Ad esempio, un gruppo20 ha approfittato di "interventi chirurgici aperti" precedentemente pianificati di avambracci (ad esempio, riparazione della frattura ossea), dove i muscoli sono stati completamente esposti e un chirurgo è stato in grado di visualizzare la struttura muscolare e analizzare attentamente campioni relativamente grandi e strutturalmente intatti di tessuto muscolare (15 mm x 5 mm x 5 mm). Questa tecnica di "biopsia aperta" è favorita quando i partecipanti sono sottoposti a una procedura precedentemente pianificata, e quindi limita il pool di potenziali partecipanti, soprattutto per gli adulti sani, dove nessun intervento chirurgico sarebbe altrimenti avvenuto. Così, molte biopsie condotte per scopi di ricerca sono fatte come una procedura ambulatoriale e il sito di incisione è mantenuto il più piccolo possibile per limitare il rischio di infezione, cicatrici, e il tempo di guarigione. Pertanto, la maggior parte blindly delle biopsie vengono raccolte alla cieca (cioè, l'operatore non è in grado di vedere l'ago di raccolta mentre passa attraverso la fascia nel muscolo). Ciò implica che la qualità della biopsia è quasi interamente basata sull'abilità e l'esperienza dell'operatore. Ogni muscolo ha le sue difficoltà durante la raccolta di tessuto, come i rischi di violare i nervi e vasi sanguigni, la selezione di una profondità di raccolta ideale e la posizione, e decidere su una posizione del corpo appropriata per mantenere il muscolo il più lento possibile. Sfortunatamente, la maggior parte delle competenze specifiche del muscolo non sono scritte e quindi ogni medico deve "reinventare la ruota" quando esegue biopsie sui muscoli nuovi per loro. Questa mancanza di esperienza di solito porta a diverse collezioni con bassa qualità fino a quando il medico identifica le migliori pratiche per le biopsie su quel muscolo. I medici alle prime armi spesso imparano l'abilità attraverso conversazioni con i loro colleghi più esperti, ma esistono relativamente pochi testi informativi e peer-reviewed sulla questione, soprattutto per i muscoli che non sono tradizionalmente utilizzati per la raccolta della biopsia. Se consideriamo le informazioni di cui sopra, insieme alla difficoltà di reclutare volontari umani per le biopsie, è chiaro che sono necessarie ulteriori informazioni didattiche che massimizzino le possibilità di successo per ogni partecipante.

Così, lo scopo di questo documento era quello di presentare una tecnica di biopsia muscolare che fornisce protocolli per la raccolta di successo di biopsie muscolari con lunghi frammenti di fibra non danneggiati per i test meccanici. Le biopsie muscolari umane sono di solito eseguite su, e la maggior parte del materiale di formazione biopsia è su, il musculus vastus lateralis. La sua dimensione muscolare relativamente grande e la posizione superficiale rispetto alla pelle consente la raccolta di un adeguato tessuto muscolare, riducendo al minimo il disagio del paziente e il traumafisico 1,21. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni all'utilizzo dei vastus lateralis per gli studi di formazione longitudinale. Ad esempio, durante i protocolli sperimentali che includono un programma di formazione, i partecipanti devono astenersi da una formazione aggiuntiva al di fuori dello studio per un periodo che spesso si estende per 2-6 mesi. Per gli atleti, questo spesso non è possibile, in quanto il vastus lateralis è di solito allenato durante gli esercizi tipici (ad esempio, squat, salti), o è generalmente utilizzato per lo sport (ad esempio, corsa, ciclismo). Queste esperienze di allenamento separate lontano dall'obiettivo dello studio possono causare adattamenti muscolari che alterano la meccanica muscolare, l'architettura e la fisiologia in modo tale che sia difficile o impossibile conoscere il vero effetto del protocollo sperimentale dello studio sulle proprietà muscolari. Per questi tipi di studi, sarebbe l'ideale per selezionare un muscolo bersaglio che spesso non è al centro dei reggimenti di formazione. Il musculus tibialis anteriore (TA) è un muscolo bersaglio ideale che soddisfa i requisiti di cui sopra. Inoltre, gli interventi di formazione possono essere mirati verso l'ATA utilizzando approcci controllabili, come ad esempio con l'uso di un dinamometro. Non c'è quasi nessun materiale di allenamento relativo a una biopsia muscolare TA. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo modificato per raccogliere biopsie muscolari relativamente intatte dall'TA.

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Protocol

NOTA: Di seguito, delineamo un protocollo per raccogliere le fibre meccanicamente non danneggiate dal TA di volontari che sono stati arruolati in uno studio in corso separato. Questo protocollo è simile a quello descritto da Shanely et al.3, che hanno descritto la tecnica modificata bergstrom in vastus lateralis. Le informazioni qui presentate sono state perfezionate dal nostro gruppo di ricerca, ma potrebbero non essere ideali per tutti i gruppi di laboratorio o le configurazioni organizzative. Diamo solo linee guida, e suggerisce fortemente che i laboratori nuovi alla raccolta di biopsia consultano gruppi di laboratorio esperti prima di tentare qualsiasi sperimentazione umana.

Tutti gli studi condotti in questo documento sono stati approvati dal Comitato Etico della Facoltà di Scienze dello Sport presso l'Università Ruhr Bochum. I partecipanti hanno dato il consenso informato scritto gratuito prima di partecipare allo studio.

1. Preparazione sperimentale

  1. Valutare i criteri di esclusione durante l'assunzione della storia medica dettagliata del partecipante durante la consultazione dei partecipanti (vedi sotto).
    1. Escludere i partecipanti se hanno subito una lesione al muscolo bersaglio durante le 6 settimane che precondo alla biopsia. Assicurarsi che i partecipanti siano generalmente sani, consapevoli di nessun muscolo o disturbi della coagulazione, e non sono attualmente su farmaci che causano l'assottigliamento del sangue (ad esempio, aspirina).
      NOTA: Qui, abbiamo selezionato i partecipanti che erano moderatamente attivi e abbiamo ordinato loro di astenersi da esercizi intensivi o non abituati alle gambe almeno 3 giorni prima della biopsia. Tuttavia, per altre questioni di ricerca, questi criteri possono cambiare.
  2. Aderendo alla sterilizzazione e alle tecniche asettiche, come regolato dal diritto tedesco e dalla pratica comune e supervisionato dal medico di squadra22,23. Questa procedura può spesso essere condotta come una procedura "letto" o in una suite chirurgica ambulatoriale. Consultare l'organismo di regolamentazione locale per una guida.
  3. Comporre il team di biopsia. Suggeriamo che il team di biopsia includa 4 persone. Un medico (o un individuo addestrato nella raccolta di biopsia), un assistente medico che lavora con il medico, un assistente che monitora e interagisce con il partecipante e un assistente che gestisce la biopsia muscolare subito dopo l'estrazione. Con questi numeri, la cura rapida del paziente può essere somministrata se si verifica un'emergenza medica durante la procedura. Se a proprio agio con la procedura, il team potrebbe essere composto solo da due persone: il medico e l'assistente medico, che insieme si occuperebbe contemporaneamente della cura del paziente e dell'elaborazione dei tessuti.
  4. Fare in modo che il partecipante incontri il responsabile/medico del progetto per esaminare, discutere e firmare il modulo di consenso dell'utente. Prendere una storia medica dettagliata (allergie, lesioni o interventi chirurgici all'arto inferiore e TA) ed escludere il partecipante se soddisfano uno qualsiasi dei criteri di esclusione. Discutere accuratamente il recupero e l'igiene dell'incisione.
    1. Spiegare al partecipante che saranno doloranti ma in grado di andare in giro subito dopo la procedura; camminare giù per pendii o scale è spesso scomodo per le prime 48 ore, con l'attività completa di solito tornare dopo 72 ore. Infine, spiegare che, per limitare l'infezione e le abrasioni meccaniche, il sito di incisione deve rimanere bendato per almeno 1 settimana e mantenuto pulito.

2. Visualizza il Tibialis anteriore con gli ultrasuoni in modalità B

  1. Istruisci il partecipante a sdraiarsi in una comoda posizione supina e rilassare il più possibile i muscoli delle gambe. Utilizzare un dispositivo su cui su come fare (vedi sotto) o fare in modo che l'assistente tena la caviglia in una posizione leggermente dorsiflessa per imitare ciò che verrà fatto durante la biopsia.
    NOTA: È importante che il partecipante abbia un TA rilassato in modo che si replica le caratteristiche muscolari durante la procedura. Durante l'esame, chiedere al partecipante di contrarre e rilassare il muscolo in modo che i cambiamenti nell'architettura muscolare possono essere notati.
  2. Utilizzare una sonda ad ultrasuoni per visualizzare i compartimenti superficiali e profondi dell'TA, per esaminare l'architettura muscolare e decidere sulla profondità di inserimento e sull'angolo di attacco dell'ago (Figura 2A-B). Indicare punti di riferimento sulla pelle.
    1. Dare particolare attenzione alla selezione di un'area di destinazione che evita le vene principali, arterie, o nervi.
    2. Valutare la sezione trasversale del muscolo, con l'obiettivo di identificare l'aponeurosi centrale all'interno della pancia muscolare TA (circa 1/3 della gamba, distale al ginocchio e 2 cm lateral della cresta tibiale)(Figura 2B). Registrare la posizione e la profondità dell'agruurosi centrale (di solito 1,5-3 cm) in modo da poter fare attenzione a non guidare l'ago di raccolta (Bergstrràm) oltre questo punto.
    3. Posizionare la sonda ad ultrasuoni nell'orientamento prossimale-distale sulla posizione di destinazione e visualizzare la pennazione del fascicle e lo spessore muscolare (Figura 2A). Utilizzare queste informazioni per aiutare a guidare con successo (ciecamente) l'ago di raccolta nella pancia muscolare. Salvare le immagini del sito di destinazione in entrambi i piani per riferimento futuro durante la procedura chirurgica.
  3. Con queste informazioni, creare un piano per il movimento dell'ago verso l'area di destinazione.
    1. Pianificare l'incisione di 1-3 cm distale dall'area della biopsia bersaglio. Dopo che l'ago è passato nel muscolo, ruotare l'ago ad un angolo del 45% rispetto alla pelle lungo il lungo asse dell'arto, e quindi guidato proximally verso l'area della biopsia. Questa strategia limita la possibilità di guidare l'ago nell'aponeurosi centrale, se l'ago viene spinto troppo forte. Inoltre, l'ago può essere azionato distally o proximally, a seconda della mano dell'operatore dell'ago.

3. Procedura di biopsia

  1. Istruire il partecipante a posare supina sul tavolo operatorio e rilassare i muscoli delle gambe. Assicurarsi che la linea di vista del partecipante al sito di biopsia sia bloccata da una tenda.
    1. Rimuovere la tensione passiva dalla pancia muscolare inserendo l'arto del partecipante in un dispositivo che fissa la caviglia in una posizione leggermente dorsiflexed (0-5 gradi da neutro; (Figura 3). Chiedere al paziente se possono ancora rilassare il loro muscolo, come troppa dorsiflexion può potenzialmente rendere difficile rilassarsi.
      NOTA: Abbiamo scoperto che la raccolta di biopsie da un piede dorsiflexed, non più di 5 gradi di neutro (cioè la suola del piede perpendicolare al gambo) produce biopsie più coerenti e più grandi rispetto agli angoli della caviglia più plantari. Il dispositivo che mantiene la caviglia dorsiflexed è un dispositivo su cui su come fare. Tuttavia, un numero qualsiasi di dispositivi (economici) può essere fabbricato che ancora producono il risultato desiderato.
  2. Rasare, pulire e disinfettare l'area di incisione selezionata, secondo le pratiche standard24.
    NOTA: L'area "pulita" del partecipante è di circa 20 cm prossimale-distale e 10 cm mediale-laterale del sito di incisione proposto. Tuttavia, consultare sempre le normative nazionali e/o dell'istituzione (se presenti) su questo argomento. Il protocollo di disinfezione include lo scrubbing della pelle pulita e poi la disinfezione quattro volte con l'uso liberale di spray di disinfezione di grado medico. Se il partecipante lascia la tabella per qualsiasi motivo, il protocollo di disinfezione deve essere riavviato.
  3. Somministrare un'iniezione suprafascial di 1,5 cc di 2% Xylocitina con epinefrina presso il sito di biopsia, che funziona come anestetico locale e vasoconstrictor. Attendere il tempo di influenza assegnato di 20-30 min.
    NOTA: Questi farmaci sono miotossici e quindi non devono mai essere iniettati nel muscolo, solo il tessuto sottocutaneo. Come reazione alla vasoconstriction, l'area del sito di iniezione può diventare bianca (su toni della pelle più chiari) o grigia (toni della pelle più scuri).
  4. Confermare l'effetto farmaco con piazzole della pelle e pokes delicati con un bisturi sterile.
  5. Nel sito di biopsia precedentemente marcato, fare un'incisione prossimale-distale di 1 cm con un bisturi sterile che taglia la pelle e la fascia, esponendo la pancia muscolare. Fare attenzione a tagliare completamente la fascia perché l'ago è smussato e non passerà attraverso la fascia.
  6. Spingere l'ago della biopsia 0,5-1,0 cm nel muscolo con un orientamento perpendicolare alla pelle (Figura 2C, 2E).
    NOTA: L'operatore sentirà un cambiamento nella tensione necessaria per guidare l'ago attraverso i diversi tipi di tessuto. Il tessuto adiposo è facile, la fascia è la più dura e il muscolo è in mezzo (ma può essere variabile, in base al partecipante).
  7. Orientare l'ago in una posizione di 45 gradi di angolo verso la pelle, lungo l'asse lungo della gamba (Figura 2D, 2F). Spingere l'ago di altro 1-2 cm nel muscolo fino a quando la punta dell'ago è nella posizione di destinazione all'interno del muscolo.
    NOTA: Il medico deve utilizzare le immagini ecografiche salvate per tenere conto della variazione individuale delle dimensioni muscolari. Poiché l'incisione è abbastanza grande da inserire l'ago, il medico guida l'ago alla cieca attraverso la pelle. C'è una "sensazione" che l'operatore di biopsia guadagna con l'esperienza. Un principiante deve imparare l'abilità da un operatore di biopsia addestrato (maggiori informazioni su questo nella discussione).
  8. Fissare la siringa e il tubo da 100 mL all'ago della biopsia (Figura 1G). Applicare l'aspirazione sull'ago bergrbrio tirando lo stantuffo della siringa di circa 15-20 mL per produrre una pressione negativa nell'ago e succhiare il tessuto muscolare nella finestra dell'ago. Quindi, accise il muscolo con una rapida spinta del trocar sopra la finestra dell'ago.
    NOTA: Prima e durante l'aspirazione, a volte è utile posizionare una leggera pressione sulla pelle immediatamente sopra la finestra dell'ago per aiutare a spingere il muscolo nell'ago.
  9. Rimuovere delicatamente l'ago dalla gamba, ruotando lentamente. Ci dovrebbe essere solo resistenza alla luce durante l'estrazione dell'ago. Se c'è più resistenza, questo può indicare un taglio parziale della biopsia. Ciò si verifica, restituire la necessità alla posizione di destinazione e ritentare la raccolta dei tessuti.
  10. Spingere il tessuto a estato verso la finestra dell'ago utilizzando il ramrod interno.
  11. Rimuovere con attenzione il campione dall'ago.
    NOTA: Immergere l'ago nella soluzione di raccolta (vedi sezione di preparazione della fibra) spesso allontana la biopsia dall'ago. Inoltre, la siringa può essere utilizzata per guidare l'aria attraverso l'ago e spingere fuori il campione. Queste tecniche rimuovono la necessità di toccare fisicamente la biopsia con una pinzetta e riducono la possibilità di danni. Se strumenti, mani (guantate o meno) o soluzioni non sterili entrano in contatto con l'ago, l'ago non può essere utilizzato ulteriormente durante la procedura. Pertanto, se è necessaria una seconda biopsia immediata, è necessario utilizzare un nuovo ago sterile. Questo spesso si verifica, quindi è una buona pratica per mantenere diversi aghi sterili in riserva.
  12. Identificare il tessuto come muscolo e non adiposo o tessuto connettivo. Tessuto muscolare è facilmente identificabile da altri tessuti a causa del suo colore rosso profondo (Figura 4A). A volte, il tessuto raccolto non è muscolo, ma grasso o tessuto connettivo.
    1. Se viene raccolta una quantità adeguata di tessuto muscolare, continuare il protocollo. Se non c'è abbastanza muscoli, provare di nuovo la biopsia.
    2. Se è necessaria una seconda biopsia, monitorare attentamente il partecipante, poiché una seconda spinta ad ago occasionalmente rende il partecipante più scomodo del primo.
  13. Lavare immediatamente i campioni muscolari in una soluzione di raccolta e prepararsi per esperimenti su singole fibre (vedere la gestione e lo stoccaggio della biopsia muscolare).
    1. Avere un assistente esperto controllare la qualità del campione (vedi sotto) e valutare la necessità di eseguire una seconda biopsia. Un assistente separato prende la biopsia per l'elaborazione, mentre il resto del team continua con il partecipante.
  14. Chiudere il sito di incisione.
    1. Chiudere la ferita da incisione con nastro leucoro sterile. Utilizzare uno o più pezzi per unire i bordi del sito di incisione ponendoli perpendicolarmente al lungo asse dell'incisione, e quindi posare ulteriori strisce in un modello a forma di stella per proteggersi dal caricamento multidirezionale.
      NOTA: una corretta gestione di questo passaggio ridurrà le cicatrici. Suturare la ferita può essere fatto, ma non è necessario. Altre opzioni includono colla ferita.
    2. Posizionare la medicazione sterile della ferita (ad esempio, Leucomed T plus) sul sito di incisione per proteggersi dalle infezioni.
    3. Avvolgere la gamba con bende elastiche coesive (ad esempio, Unihaft) per limitare il sanguinamento iniziale e proteggere contro l'impatto meccanico esterno.
    4. Avvolgere la gamba con bende di compressione acrilastica per evitare sanguinamento e proteggere le bende più profonde da diventare sciolti o distrutti.

4. Cura post-biopsia

  1. Chiedere al partecipante di andare in giro subito dopo la procedura. Ci sarà dolore localizzato. Indicare al partecipante di camminare nel modo più normale possibile.
  2. Indicare al partecipante di non rimuovere le bende o lasciare che l'acqua immerga le bende. Devono essere tenuti in servizio per almeno: un giorno per la benda acrilastica, tre giorni per la benda elastica coesa e sette giorni per la medicazione della ferita. Informare il partecipante che possono essere ribandati se necessario.
    1. Adattare la cura post-biopsia di un partecipante alle esigenze dell'individuo. Avere un assistente o un medico qualificato valutare il partecipante e fare un piano di cura post-biopsia appropriato. Per questa procedura, suggeriamo che qualsiasi ulteriore test neuromuscolare in vivo della TA sia separato da almeno una settimana dalla biopsia.

5. Gestione e stoccaggio della biopsia muscolare

  1. Dopo l'estrazione dei tessuti, posizionare immediatamente il tessuto in una fiala di 5 mL contenente soluzione di raccolta del rigore (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), compressa inibitore della proteasi (1), pH 7.0) e agitare leggermente per 4-6 min per lavare il sangue.
  2. Scambiare la soluzione di rigor per il rigore fresco, agitare leggermente per 4-6 min, quindi conservare a 4 gradi centigradi per 4-6 h per consentire lo scambio di soluzione di stoccaggio proteaie-inibitore e sangue.
  3. Soluzione di cambio rigore per il rigore notturno (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), compressa inibitore della proteasi (1), 50:50 glicerolo, pH 7.0) e conservare a 4 gradi centigradi per 12-18 h.
  4. Scambiare il rigore notturno per il rigore di raccolta 50:50:glicerolo e conservato a -20 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi, o un anno in un congelatore di -80 gradi centigradi.
    NOTA: Questo processo permea la membrana in fibra che consente l'aggiunta manuale di calcio all'interno e all'uscita dalla cellula. Questo processo richiede tempo e potrebbe essere diverso tra diversi muscoli e specie.

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Representative Results

L'impegno di tutto il tempo per un partecipante è stato di circa un'ora (10 min di consultazione, 10 min ultrasuoni, 20 min di preparazione chirurgica e somministrazione anestetica, 10 min di chirurgia e 10 minuti di recupero). Spesso, i partecipanti inconsciamente attivato il loro TA e aveva bisogno di promemoria coerenti per mantenere il muscolo il più rilassato possibile. Quando l'ago della biopsia era all'interno del muscolo, i partecipanti di solito hanno riportato una sensazione di "pressione" unica nella zona intorno all'ago biopsia, con periodi occasionali di disagio da moderato a intenso. Una volta, le dita dei piedi di un partecipante leggermente strette durante la procedura, ma immediatamente fermato dopo l'ago è stato rimosso. Le dimensioni della biopsia erano di solito 50-100 mg (massa umida). Le reazioni dei partecipanti alla procedura erano spesso imprevedibili. A volte, il partecipante si aspettava di non essere influenzato durante la procedura, ma poi ha mostrato segni di svenimento, mentre altri erano nervosi ma completamente insensibili durante la procedura. Così, abbiamo trovato buona pratica per mantenere il partecipante occupato con una conversazione o lasciarli usare il loro telefono cellulare, in modo che la loro piena attenzione non era focalizzata sulla procedura in corso. L'assistente che ha parlato con il partecipante li ha anche monitorati alla ricerca di segni di angoscia, dolore o svenimento. A volte, una biopsia conteneva solo adiposo o tessuto connettivo (identificato da un colore bianco pallido del tessuto, Figura 4A). In questi casi, è stata immediatamente presa una seconda biopsia (dopo l'approvazione del partecipante). Di solito, una biopsia di successo produrrà >80% tessuto muscolare (Figura 4A).

Post-op, la maggior parte dei partecipanti ha avvertito disagio dopo la procedura che è durata 3-5 giorni. I partecipanti hanno riferito che il dolore TA era simile a quello che ci si aspetterebbe dopo una giornata di ripide escursioni. Nessuna pressione meccanica deve essere messa sul sito di incisione per almeno 5 giorni, o potrebbe riaprire. I partecipanti sono stati di solito lasciati con una piccola cicatrice, ma non abbiamo osservato cambiamenti sollevati o comunque anormali alla pelle. Inoltre, nessun partecipante ha sviluppato infezioni.

Le biopsie sono state permeabili (cioè scuoiate) in una soluzione di glicerolo (1:1 miscela di glicerolo: soluzione di rigore) per 6 settimane e poi preparate per i test meccanici il giorno degli esperimenti. La permeabilizzazione del glicerolo delle fibre consente la diffusione della soluzione del bagno nelle fibre, che dà al ricercatore il controllo di attivazione e fornisce anche un modo per sottoponerlo al muscolo a prodotti farmaceutici o altre sostanze chimiche. Inoltre, il glicerolo funziona come agente anti-congelamento, permettendo al muscolo di essere posto a temperature fredde per lo stoccaggio a lungo termine, con danni limitati. Tuttavia, è necessario un po 'di tempo per consentire al glicerolo di penetrare i campioni, e quindi inizialmente memorizzare campioni di biopsia durante la notte a 4 gradi centigradi (idealmente su una piastra di agitazione) è prudente. I muscoli possono essere memorizzati solo per così tanto tempo prima che la loro funzione sia compromessa. La guida generale sulla questione è che i muscoli manterranno la loro funzione all'interno della soluzione di glicerolo per almeno 3 mesi in un congelatore -20 gradi centigradi, o un anno in un congelatore di -80 gradi centigradi.

I campioni muscolari sono stati visualizzati al microscopio a sesticazione. Alcuni pezzi muscolari erano piccoli o danneggiati (Figura 4B) e sono stati rimossi. Successivamente, gruppi di fibre sono stati valutati per eventuali danni strutturali (visually rotto o frantumato fibra sarcolemma, Figura 4C). Da questi fasci, fasci di fibra più piccoli di 3-10 fibre sono stati sezionati e accuratamente collocati nella camera sperimentale del carro di prova meccanico (Figura 4D). Le lunghezze strutturalmente utilizzabili delle fibre erano in genere lunghe 3-5 mm. L'ago bergamaso aveva una finestra di raccolta di 7 mm, quindi la biopsia poteva produrre al massimo solo fibre lunghe 7 mm. Così, le fibre strutturalmente utilizzabili che abbiamo raccolto erano quasi il più a lungo possibile. Tipicamente, prepariamo 5-10 fascio di fibre per 50 mg di tessuto (raccolto). I dettagli completi di queste procedure sono disponibili altrove14,15,25. Per dimostrare la durata delle fibre, mostriamo i dati rappresentativi di un semplice protocollo meccanico utilizzando fasci di fibra TA glicati (Figura 5). 40 fasci di fibre delle biopsie di 10 partecipanti sono stati attivati nella soluzione di attivazione26 (alto [Ca2] , pCa < 4.2) a 2,7 m di lunghezza del sarcomere per 60 secondi e lo stress attivo a stato costante è stato misurato come 100,71 x 11 mN mm-2 (media SEM).

Figure 1
Figura 1: L'ago bergstrom. L'ago Bergstrom utilizzato in questo studio è costituito dall'ago stesso (A-F), dal tubo di aspirazione (G) e dalla siringa (F). L'ago bergamasma è costituito da un ago esterno (A) che ha una finestra vicino alla punta dell'ago, un trocar interno cavo più piccolo (B) che si muove su e giù per l'ago e taglia il muscolo quando passa sopra la finestra dell'ago, e una canna (C) che si muove su e giù per il trochanter per aiutare a rimuovere il muscolo dall'ago. Questi pezzi sono separati da una lavatrice (D) che rende l'ago ermetico, e un distanziale (E) tra l'asta e la trocar protegge contro la frantumazione della biopsia muscolare. Infine, viene collegato un adattatore per tubo di aspirazione. Per tirare il muscolo nella finestra dell'ago, un tubo di aspirazione (G) è attaccato all'adattatore dell'ago e alla siringa. Questo aspira l'aria dall'ago e tira il muscolo nella finestra dell'ago tramite pressione negativa, consentendo la raccolta del campione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: imaging ad ultrasuoni e posizionamento dell'ago. Il TA è composto da compartimenti superficiali e profondi che sono definiti da aponeuroses. L'TA è immagine con la sonda ad ultrasuoni orientata nelle prospettive distale-prossimale (A) e mediale-laterale (B) in modo che la forma 3D dell'TA possa essere riconosciuta. La profondità ideale dell'ago per la raccolta è tra le linee tratteggiate orizzontali. Una rappresentazione a cartoni animati dell'inserimento dell'ago è mostrata nei pannelli C e D. Dopo l'incisione, l'ago viene prima posizionato perpendicolare al muscolo e spinto nel muscolo fino a quando la finestra dell'ago è nel muscolo (C). L'ago viene quindi riorientato ad un angolo di 45 gradi lungo l'asse lungo della gamba, e spinto ulteriormente nel muscolo, prestando attenzione che l'ago non penetra nell'aponeurosi profonda (D). Le immagini dal vivo (E, F) durante la procedura sono fornite in riferimento al cartone animato (C, D). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Posizionamento dei partecipanti. Il partecipante si trova in una posizione supina sul tavolo delle operazioni. La testa può essere elevata per il comfort. Il piede destro è posto in un dispositivo personalizzato che mantiene il piede leggermente dorsiflexed, riducendo la tensione muscolare. Una tenda è posta di fronte al partecipante in modo che non possano guardare la procedura. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini rappresentative del tessuto muscolare. (A) Immediatamente dopo la biopsia, il campione muscolare sarà un rosso più scuro rispetto ad altri tessuti, compreso il tessuto adiposo e il tessuto connettivo (etichettato nel pannello). (B) Dissezione di campioni con fasci di fibre corti/corti (in alto) e vitali (sotto). (C) Ingrandimento di un raggruppamento di fibre praticabile per ispezionare la superficie alla ricerca di segni di danno. (D) Un fascio a 6 fibre è stato sezionato lontano da questo fascio di fibra (legato alle estremità con sutura 6-0 per un facile movimento e attaccato all'apparato meccanico. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Output di forza rappresentativa di una preparazione del fascio di fibre. Per dimostrare la durata delle fibre, mostriamo dati rappresentativi di stress di un semplice protocollo meccanico utilizzando il fascio di fibra TA glicata (3 fibre). In totale, 40 fasci di fibre delle biopsie di 10 partecipanti sono stati allungati da allentamento a 2,7 m lunghezza sarcomere e tenuti per consentire il rilassamento dello stress. Successivamente, le fibre sono state attivate nella soluzione di attivazione26 (area ombreggiata; alta [Ca2' ], pCa < 4.2) a 2,7 m lunghezza sarcomere per 60 secondi e lo stress attivo a stato costante è stato misurato a 100,71 x 11 mN mm-2 (media SEM). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questa relazione, abbiamo descritto una tecnica per la biopsia del tessuto muscolare strutturalmente intatto da TA. Abbiamo scoperto che questa procedura produce un contenuto accettabile di fibre muscolari utilizzabili (5-10 preparazioni di fascio di fibre per 50 mg di tessuto raccolto) per test meccanici. Inoltre, avevamo abbastanza tessuto per gli esperimenti meccanici, genetici e proteomici di follow-up.

Ci sono diversi metodi tipicamente utilizzati per la raccolta di biopsie muscolari3,4,6,27,28. La cosiddetta biopsia aperta20 produce fibre di altissima qualità perché un chirurgo espone completamente il muscolo e seziona il campione. Naturalmente, la chirurgia aperta è piuttosto una procedura invasiva e non è una procedura appropriata per presentare partecipanti sani, indipendentemente dalla domanda di ricerca, a causa dei potenziali rischi associati a interventi chirurgici aperti. Il metodo di biopsia meno invasivo è la biopsia dell'agosottile 29,30, che utilizza un ago relativamente più piccolo per raccogliere i tessuti. Le biopsie dell'ago sottile sono sufficienti per condurre esperimenti sui componenti genetici/chimici/proteini delle fibre30,31, ma spesso la qualità delle fibre è molto scarsa, il che rende i test meccanici difficili o impossibili. La tecnica dell'ago di Bergstrom è un buon compromesso tra le due procedure sopra descritte perché l'intervento chirurgico è meno invasivo della biopsia aperta, ma raccoglie ancora campioni muscolari più grandi e (potenzialmente) più strutturalmente intatti rispetto alle biopsie ad ago fine. Le precedenti relazioni sulla procedura dell'agobergamas 3,5 sonograndi risorse per coloro che imparano la tecnica, ma presentano solo protocolli per i vasti laterali. Il nostro rapporto dimostra la tecnica per il TA che si concentra sulla raccolta di alte rese di fibre strutturalmente intatte per i test meccanici.

Per nostra conoscenza non ci sono pubblicazioni dettagliate sulla raccolta di biopsie TA. Tuttavia, la prassi standard è di porre il partecipante supina e farli rilassare la gamba il più possibile. Il piede rilassato in questa posizione è naturalmente plantarflexed, che di conseguenza allunga il TA e lo mette in tensione. Troviamo che qualsiasi tensione muscolare rende più difficile guidare il muscolo nell'ago biopsia, anche con pressione negativa, e quindi la tensione dovrebbe essere ridotta il più possibile. Per raggiungere questo obiettivo, la semplice ma importante modifica qui è stata quella di utilizzare una piastra del piede su misura che ha mantenuto la caviglia in una posizione leggermente dorsiflexed (0 - 5 gradi da neutro), mantenendo il TA slack e migliorando la raccolta. I medici devono fare attenzione a non sovra-dorsiflex la caviglia, come il TA sarà attivato in modo incontrollabile, aumentando la tensione, che è naturalmente in contrasto con la procedura in primo luogo. Il partecipante può in genere sentire questa attivazione muscolare, quindi la comunicazione è la chiave. Dai protocolli, l'AT produce solo 25% tessuto rispetto ai più comunemente utilizzati vastus lateralis, 100 mg e 400 mg, rispettivamente. Pertanto, è importante massimizzare le dimensioni della raccolta dei tessuti, considerando anche se il campione di tessuto TA sarà sufficientemente grande per i progetti di ricerca desiderati. Abbiamo scoperto che l'assunzione di un secondo campione immediatamente dopo il primo non causa complicazioni extra o tempo di guarigione per i partecipanti.

Anche se il protocollo dà qualche guida verso altre biopsie muscolari, la selezione muscolare determinerà la procedura appropriata. Pertanto, suggeriamo vivamente ad altri ricercatori e medici di pubblicare, per intero, i loro metodi di biopsia. Per esperienza, identifichiamo alcuni fattori importanti alla selezione muscolare, al di fuori della domanda di ricerca. In primo luogo, si consiglia di considerare i muscoli che sono superficiali per la pelle e hanno arterie principali / nervi che sono o profondo o facilmente evitabile. In secondo luogo, perché i partecipanti sono svegli durante la procedura, è importante considerare se la procedura di biopsia sarà molto scomoda per il paziente, sia a causa del posizionamento iniziale del paziente, sia a causa della pressione dell'ago biopsia, che spinge anche sui muscoli più profondi in modo scomodo. Abbiamo avuto successo con i vasti laterali e pectoralis. Altre opzioni potenziali sono il trapezius, latissimus dorsi, e gastrocnemius (anche se altamente vascolarizzato e incline al sanguinamento). I muscoli del tendine del ginocchio sono possibili ma scomodi per il paziente, e difficili perché si muovono lateralmente quando raccolgono la biopsia.

Anche se gli aghi Bergstrom possono essere acquistati dai produttori, alcuni laboratori si fanno da soli. Piccole, ma intelligenti, regolazioni al design possono aumentare la resa di fibre muscolari lunghe e intatte. Ad esempio, la finestra di raccolta dell'ago utilizzato qui era 7 mm x 5 mm (lunghezza x larghezza). Questo è appropriato per catturare un cubo di muscolo. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di raccogliere fibre lunghe e non danneggiate (dello stesso volume), allora la lunghezza potrebbe essere aumentata e la larghezza è diminuita (cioè, 10 mm x 3,5 mm). Se l'ago è orientato lungo la direzione del fascicle, allora è probabile che questo ago raccoglierebbe sezioni di fibra più lunghe.

Le biopsie muscolari sono spesso raccolte in modo sicuro senza la guida di un'immagine ad ultrasuoni, soprattutto per i muscoli più grandi come i vasti laterali. In questa situazione, un medico adeguatamente esperto può facilmente palpare il muscolo per trovare il miglior sito di incisione. Tuttavia, quando il medico è meno esperto con il muscolo bersaglio, o una cura supplementare è giustificata per evitare nervi importanti o vasi sanguigni, l'ecografia è un grande strumento e semplicemente applicato. Infine, il monitoraggio post-operatorio dell'area della biopsia può essere rapidamente realizzato con l'aiuto di un'ecografia.

Le biopsie pediatriche sono certamente possibili e comunementeeffettuate 32,33,34. Tuttavia, esistono in genere diverse modifiche apportate alla procedura. Spesso sono necessari un ago di misura più piccolo e una sedazione cosciente e la procedura avviene in un ambiente ospedaliero. In generale, l'esperienza potrebbe essere traumatica per un bambino e gruppi di ricerca che vogliono includere partecipanti pediatrici sani dovrebbero valutare attentamente questo contro i potenziali meriti dello studio.

I fasci di fibra o il materiale inutilizzato possono essere trasferiti ad altri esperimenti prima o dopo la meccanica delle fibre. Ad esempio, le tecniche che valutano il contenuto di proteine sarcomeche o classificano il tipo isoforme possono esserecondotte 35. Tuttavia, per limitare la degradazione delle proteine e migliorare il successo dell'analisi, il tessuto deve essere congelato in modo flash nell'azoto liquido dopo l'estrazione originale, immediatamente dopo la valutazione meccanica, o immediatamente per l'analisi delle proteine. Le fibre possono anche essere preparate per l'immunostochimica o altre tecniche di imaging36 che consentono la valutazione della posizione delle proteine all'interno della fibra. In questo caso, le fibre possono essere collocate in una soluzione fissativa (ad esempio, 4% di paraformaldeide/0,25% glutaraldeide in tampone fisiologico al pH 7; nessuna glutaraldeide per immunohistochimica) mentre sono ancora sull'apparato di prova meccanica, preservando le strutture sarcomeche a una lunghezza sarcome desiderata. Se possibile, un piccolo pezzo della biopsia originale può essere raccolto, lavato vigorosamente in soluzione di raccolta per 10 min e quindi messo in soluzione fissativa. Molti gruppi preferiscono congelare immediatamente i campioni appena aesprili appena aespriti, il che limita la formazione di cristalli di ghiaccio dannosi e migliora la qualità dell'immagine per le valutazioni visive. Questo è infatti il gold-standard per il congelamento flash; tuttavia, scopriamo che il danno del cristallo di ghiaccio causato dal congelamento dell'azoto si concentra solo sulle strutture extra-myofibril. Abbiamo un'integrità strutturale soddisfacente dei componenti sarcomerici nei campioni congelati anche in azoto liquido, e quindi pensiamo che l'azoto sia una possibilità, soprattutto se è più facilmente disponibile, o l'equipe chirurgica/ autorità chimica locale non è disposta a utilizzare isopentane. Un problema importante e spesso non segnalato con la preparazione dei campioni per la visualizzazione è che i sarcomi sono spesso contratti / brevi, con la regione I-band del sarcomere breve o inosservabile. Per superare questo, il ricercatore deve allungare manualmente i campioni di fibra (dall'apparato di prova o a mano utilizzando una pinzetta fine) prima di fissarli. Come regola generale, ci allunghiamo fino a 3,2 m di lunghezza del sarcomere (misurato tramite diffrazione laser), o ci allunghiamo fino al 150% della lunghezza del lasco, in una soluzione rilassante fisiologica a basso calcio. Infine, se si ricercano sottocampioni per l'analisi dell'espressione RNA, il metodo di congelamento del flash non influisce sui risultati, ma i campioni devono essere congelati immediatamente dopo l'estrazione originale e collocati in un congelatore a -80 gradi centigradi, poiché l'RNA è molto instabile. Ci sono alcune soluzioni di stoccaggio di protezione dell'RNA sul mercato, ma abbiamo trovato risultati contrastanti con il loro uso, e solo campioni freschi di congelamento flash.

Per massimizzare la quantità di informazioni raccolte durante una prova, è possibile completare la raccolta simultanea di altri dati durante le prove meccaniche. Ad esempio, lo studio delle strutture sarcomeriche può essere eseguito durante i test meccanici utilizzando l'imaging a raggi X a basso angolo, come in altri animali37,38. Per gli esperimenti genetici, il muscolo a estato deve essere immediatamente elaborato a tale scopo o congelato in modo flash perché il DNA/RNA è relativamente meno stabile delle proteine.

Alcune limitazioni sono già descritte in precedenza. Qui discutiamo la procedura stessa. Una grande limitazione per la maggior parte dei gruppi è avere un membro del team che è adeguatamente addestrato nella raccolta di biopsia. Indipendentemente dalla professione della persona (medico, assistente medico, tecnico o altro), questa procedura è difficile perché l'investigatore guida l'ago alla cieca e deve fare affidamento su "sentire"3,28 perindividuare con precisione la finestra dell'ago. Gli errori non sono tollerabili perché i partecipanti umani consenzienti per le biopsie sono scarsi, una biopsia è preferibile a molti e gli errori potrebbero portare a danni vascolari o nervosi. Pertanto, qualsiasi possibilità di formazione dovrebbe essere completata prima di eseguire una biopsia umana. Ad esempio, per ottenere una "sensazione" per guidare l'ago, carne di maiale con la pelle ancora attaccata può essere acquistato dalla maggior parte dei negozi di alimentari e utilizzato come proxy per la pelle umana e muscolare. Un'altra preziosa esperienza è quello di ombra un gruppo di ricerca addestrato.

Abbiamo valutato il dolore/disagio dei partecipanti in modo più qualitativo, basandoti sull'esperienza del medico e sulle conversazioni con il partecipante per valutare il dolore percepito. Tuttavia, la valutazione del dolore e del disagio post-biopsia può essere più quantificata e comparabile tra gli individui e gli studi attraverso l'uso di indagini convalidate sul dolore/disagio. Questi punti hanno sorprendentemente poco trattamento nella letteratura. Tuttavia, uno studio recente ha presentato un modo per quantificare il dolore/disagio dei partecipanti prima, durante e dopo le biopsie, utilizzando indagini ben consolidate del dolore39. Notiamo che questo articolo ha usato il vastus lateralis come muscolo bersaglio, e quindi sono necessari studi di follow-up per confrontare le valutazioni del dolore tra i muscoli.

Indipendentemente dal metodo di estrazione, la tecnica Bergstrom non può accisa la lunghezza totale della fibra nel muscolo perché le fibre sono troppo lunghe (6-8 cm in TA40, 6,5-8 cm in vasti laterali40). Pertanto, è inevitabile che per un lungo pezzo di fibra raccolta, le estremità vengono distrutte dalla tecnica della biopsia. Spesso, la parte centrale utilizzabile di una fibra è piccola e quindi è difficile da testare meccanicamente. Anche se la tecnica fornisce regioni centrali ragionevolmente lunghe (3-5 mm), lo sperimentatore deve controllare attentamente la qualità dei fasci di fibre durante la dissezione perché l'uso di fibre danneggiate altererà le uscite di forza passiva o attiva. L'osservazione visiva delle biopsie di successo mostrerà una porzione di fibre che non sono danneggiate dalla procedura di biopsia. Se vista da un microscopio leggero di dissezione tradizionale, la superficie delle fibre avrà un aspetto liscio, senza fori o strappi (Figura 4). Inoltre, le fibre dovrebbero apparire cilindriche e non hanno aree appiattite. Anche se non visibile, il muscolo stesso si degrada nel tempo a causa di proteasi naturali che iniziano ad abbattere le proteine muscolari quasi immediatamente dopo l'estrazione. Pertanto, è fondamentale aggiungere inibitori della proteasi a tutte le soluzioni utilizzate con le fibre. Inoltre, suggeriamo anche lavaggi extra delle biopsie per rimuovere più sangue possibile.

Anche con un'attenta preparazione, possono verificarsi danni alle fibre e portare a scarse attivazioni di fibra. Ci sono molte ragioni per danni alla fibra perché le fibre sono molto sensibili a quasi ogni parte della procedura. Ad esempio, durante la biopsia, se la trocar non è abbastanza affilata, può spingere nel tessuto muscolare durante l'estrazione invece di tagliarlo, che può allungare e distruggere le fibre. La soluzione di raccolta deve essere adeguatamente preparata perché le fibre sono sensibili ai cambiamenti osmotici, al pH e alla temperatura. Quando si maneggiano le fibre, è necessario fare molta attenzione per limitare completamente la pressione sulle fibre. Invece, pinzette dovrebbero essere utilizzati per afferrare la biopsia dal suo tessuto connettivo. Un'altra alternativa è quella di utilizzare una sutura di seta di taglia 0-7 per avvolgere un'estremità inutilizzabile della biopsia e poi afferrare questo durante la manipolazione. Infine, il glicerolo serve due ruoli: il primo è quello di mantenere il muscolo dal congelamento mentre a -20 gradi centigradi e il secondo è quello di essere un detergente delicato per la fibra. Vale a dire, glicerolo permea la fibra a soluzioni esterne, consentendo l'afflusso di calcio (tramite una soluzione di attivazione). Per la maggior parte dei muscoli, questo processo richiede 10 giorni. Tuttavia, a seconda della quantità di contenuto di collagene e delle dimensioni del campione, questo potrebbe richiedere fino a 6 settimane. Le fibre devono essere permeabili affinché qualsiasi attivazione ad alto contenuto di calcio si verifichi durante gli esperimenti meccanici. Le fibre sono generalmente utilizzabili per almeno 3 mesi. Per limitare i rifiuti di fibre, è suggerito un tempo di attesa per permeabilizzazione più lungo (4-6 settimane) per le fibre muscolari TA.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Michaela Rau, Lea-Fedia Rissmann, Michael Marsh, Janina-Sophie Tennler, Kilian Kimmeskamp e Wolfgang Linke per aver assistito al progetto. Il finanziamento di questo progetto è stato fornito dalla Fondazione MERCUR (ID: An-2016-0050) a DH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe B. Braun Melsungen AG
Carl-Braun-Straße 1
34212 Melsungen, Hessen
Germany
 		 4606027V Drug administration
5mm Berstöm needle homemade N/A Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 269700 elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11836145001 Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept PAUL HARTMANN AG
Paul-Hartmann-Straße 12
89522 Heidenheim
Germany		 9805630 Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 7238201 Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road,
Hull
Great Britain		 66002876 wound closure
Surgical disposable scalpels Aesculap AG
Am Aesculap-Platz
78532 Tuttlingen
Germany		 BA200 series Incision
Unihaft cohesive elastic bandage BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 4589600 cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin Milbe GmbH
Münchner Straße 15
06796 Brehna
Germany		 N/A Controlled substance anesthesia, vasoconstriction

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Biologia Numero 163 Tibialis anteriore biopsia muscolare ultrasuoni meccanica delle fibre umane biomeccanica tecnica Bergstrom modificata
Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica
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Hessel, A. L., Hahn, D., de Marées, M. Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation. J. Vis. Exp. (163), e61598, doi:10.3791/61598 (2020).

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