Summary
Dit technische rapport beschrijft een variatie van de gewijzigde Bergström techniek voor de biopsie van de musculus tibialis voorste die vezelschade beperkt.
Abstract
De mechanische eigenschappen van het samentrekken skeletvezels zijn cruciale indicatoren van de algehele gezondheid van de spieren, functie en prestaties. Menselijke skeletspier biopten worden vaak verzameld voor deze inspanningen. Er zijn echter relatief weinig technische beschrijvingen van biopsieprocedures beschikbaar, buiten de veelgebruikte musculus vastus lateralis. Hoewel de biopsietechnieken vaak worden aangepast aan de kenmerken van elke spier die wordt bestudeerd, delen weinig technische rapporten deze veranderingen aan de grotere gemeenschap. Zo wordt spierweefsel van menselijke deelnemers vaak verspild als de operator het wiel opnieuw uitvindt. Het uitbreiden van het beschikbare materiaal op biopten van een verscheidenheid van spieren kan het incident van mislukte biopten verminderen. Dit technische rapport beschrijft een variatie van de gewijzigde Bergström techniek op het musculus tibialis voorste dat vezelschade beperkt en vezellengtes biedt die geschikt zijn voor mechanische evaluatie. De operatie is een poliklinische procedure die kan worden afgerond in een uur. De herstelperiode voor deze procedure is onmiddellijk voor lichte activiteit (d.w.z. lopen), tot drie dagen voor de hervatting van de normale fysieke activiteit en ongeveer een week voor wondverzorging. Het geëxtraheerde weefsel kan worden gebruikt voor mechanische krachtexperimenten en hier presenteren we representatieve activeringsgegevens. Dit protocol is geschikt voor de meeste verzameldoeleinden, mogelijk aanpasbaar aan andere skeletspieren, en kan worden verbeterd door wijzigingen aan de opvangnaald.
Introduction
De studie van menselijke spierfysiologie voor klinische of onderzoeksdoeleinden vereist vaak spierbiopten. Bijvoorbeeld, een grote uitdaging in de menselijke spierfysiologie en biomechanica is om onderscheid te maken tussen en begrijpen van de verschillende aanpassingen van spierprestaties uit te oefenen. Prestatieaanpassingen omvatten niet alleen structurele aanpassingen (bijvoorbeeld veranderingen in contractiele eiwitten, spierarchitectuur), maar ook neurale aanpassingen1, die zeer moeilijk, zo niet onmogelijk zijn, afzonderlijk te beoordelen bij het testen van intacte menselijke spieren. Vezel-niveau experimenten verwijderen deze hogere orde componenten en zorgen voor een meer directe evaluatie van spiercontractie en kan worden verzameld via biopsie technieken. Spierbiopten zijn verzameld sinds ten minste 18682. Vandaag de dag is de belangrijkste techniek om spierbiopten te verzamelen de gewijzigde Bergström techniek3,4,5, hoewel andere technieken beschikbaar zijn, waaronder het gebruik van een Weil-Blakesley conchotome6 of de zogenaamde fijne naald7,8. Al deze technieken maken gebruik van speciale naald-achtige instrumenten die zijn ontworpen om door te geven in de spier en snijd een stuk weefsel. Specifiek, de gewijzigde Bergström techniek maakt gebruik van een grote gemodificeerde naald (5 mm naald grootte hier; Figuur 1) dat heeft een venster dicht bij de naald tip en een kleinere interne trocar die beweegt op en neer de naald, het snijden van de spier bij het passeren over de naald venster. Binnen deze hallow trocar is een ramrod die beweegt op en neer de schacht van de trocar en duwt de biopsie naar de naald venster. Om de spier in het naaldvenster te trekken, wordt een zuigslang bevestigd, die lucht uit de naald zuigt en de spier in het naaldvenster door negatieve druk trekt.
Spierbiopten worden vaak verworven om veranderingen in het eiwitgehalte, genexpressie of morfologie veroorzaakt door ziekte of in reactie op een oefenprogramma1,9,10,11te bestuderen . Een ander cruciaal gebruik voor spierbiopten is mechanische experimenten zoals het meten van vezelcontractielkracht, spiervezelstijfheid en geschiedenisafhankelijke spiereigenschappen12,13,14,15,16. Enkele vezel of vezel bundel mechanica worden gemeten door het bevestigen van vezels tussen een lengte motor en kracht transducer op gespecialiseerde rigs die de vezel lengte controle, terwijl tegelijkertijd het meten van kracht. Door het permeabiliseren (bijvoorbeeld, villen) vezels, de sarcolemma membraan wordt doorlatend voor chemische stoffen in het bad oplossing, waardoor voor activering controle door verschillende calciumconcentratie. Bovendien kan het effect van contractiele eigenschappen op chemicaliën/farmaceutische producten/andere eiwitten gemakkelijk worden geëvalueerd door het betrokken reagens toe te voegen aan de badoplossing. Hoewel deze techniek veel wordt gebruikt in andere diermodellen, zijn er merkbaar minder studies uitgevoerd op gevilde vezels van menselijke spierbiopten17,18,19. Een van de redenen is dat de biopsie tools en protocollen zijn ontworpen om zo veel spierweefsel mogelijk te verwijderen met minder respect voor het niveau van structurele schade opgelopen tijdens weefselextractie. Inderdaad, een recente biopsie protocol suggereert om de biopsie naald rijden in de spier en het verzamelen van 2-4 brokken van spier3. Het proces zelf doet weinig schade aan het DNA of eiwitmateriaal, maar vernietigt vaak vezels en sarcomerische structuren op een zodanige wijze dat de activering van spiervezels onstabiel of onmogelijk wordt. Bovendien is de relatieve lengte van vezels binnen de biopsie meestal kort (<2 mm) en niet gemakkelijk te hanteren voor mechanische tests. Voor mechanische testen zijn ideale vezels lang (3-5 mm) en niet structureel beschadigd.
Meer geavanceerde weefselextractie technieken kunnen worden gebruikt om vezelschade te beperken. Zo maakte één groep20 gebruik van eerder geplande "open operaties" van onderarmen (bijvoorbeeld botbreukherstel), waarbij de spieren volledig werden blootgesteld en een chirurg in staat was om de spierstructuur te visualiseren en relatief grote en structureel onbeschadigde monsters van spierweefsel zorgvuldig te ontleden (15 mm x 5 mm x 5 mm). Deze "open biopsie" techniek is favoriet wanneer de deelnemers een eerder geplande procedure ondergaan, en dus beperkt de pool van potentiële deelnemers, vooral voor gezonde volwassenen, waar geen operaties anders zou plaatsvinden. Zo worden veel biopten uitgevoerd voor onderzoeksdoeleinden gedaan als een poliklinische procedure en de incisieplaats wordt zo klein mogelijk gehouden om het infectierisico, littekens en genezingstijd te beperken. Daarom worden de meeste biopten blindelings verzameld (d.w.z. de operator is niet in staat om de verzamelnaald te zien als deze door de fascia in de spier gaat). Dit houdt in dat de kwaliteit van de biopsie bijna volledig is gebaseerd op de vaardigheid en ervaring van de operator. Elke spier heeft zijn eigen problemen bij het verzamelen van weefsel, zoals risico's om zenuwen en bloedvaten te schenden, selectie van een ideale collectie diepte en locatie, en de beslissing over een geschikte lichaamshouding om de spier zo slap mogelijk te houden. Helaas, de meeste van de spier-specifieke skillsets zijn niet opgeschreven en dus elke arts moet "opnieuw uitvinden van het wiel" bij het uitvoeren van biopten op spieren nieuw voor hen. Dit gebrek aan ervaring leidt meestal tot verschillende collecties met een lage kwaliteit totdat de arts de beste praktijken voor biopten op die spier identificeert. Beginnende artsen leren de vaardigheid vaak door middel van gesprekken met hun meer ervaren collega's, maar er bestaan relatief weinig informatieve en peer-reviewed teksten over de kwestie, vooral voor spieren die traditioneel niet worden gebruikt voor biopsieverzameling. Als we kijken naar de bovenstaande informatie, samen met de moeilijkheid van het werven van menselijke vrijwilligers voor biopten, is het duidelijk dat meer onderwijs informatie nodig is die de kans op succes voor elke deelnemer maximaliseert.
Het doel van dit document was dus om een spierbiopsietechniek te presenteren die protocollen biedt voor het succesvol verzamelen van spierbiopten met lange, onbeschadigde vezelfragmenten voor mechanische tests. Menselijke spierbiopten worden meestal uitgevoerd op, en het grootste deel van de biopsie training materiaal is op, de musculus vastus lateralis. De relatief grote spiergrootte en oppervlakkige locatie ten opzichte van de huid zorgt voor het verzamelen van voldoende spierweefsel, terwijl het minimaliseren van ongemak van de patiënt en fysiek trauma1,21. Er zijn echter enkele beperkingen aan het gebruik van de vastus lateralis voor longitudinale trainingsstudies. Bijvoorbeeld, tijdens experimentele protocollen die een trainingsprogramma omvatten, moeten de deelnemers afzien van aanvullende training buiten de studie voor een periode die vaak 2-6 maanden beslaat. Voor atleten is dit vaak niet mogelijk, omdat de vastus lateralis meestal wordt getraind tijdens typische oefeningen (bijvoorbeeld kraakpanden, sprongen), of over het algemeen wordt gebruikt voor de sport (bijvoorbeeld hardlopen, fietsen). Deze afzonderlijke trainingservaringen uit de buurt van het doel van de studie kunnen spieraanpassingen veroorzaken die spiermechanica, architectuur en fysiologie zodanig veranderen dat het moeilijk of onmogelijk is om het ware effect van het experimentele protocol van de studie op spiereigenschappen te kennen. Voor dit soort studies, zou het ideaal zijn om een doelspier die vaak niet de focus van de opleiding regimenten te selecteren. De musculus tibialis anterior (TA) is een ideale doelspier die voldoet aan de bovenstaande eisen. Daarnaast kunnen trainingsinterventies op de TA worden gericht met behulp van controleerbare benaderingen, zoals bij het gebruik van een dynamometer. Er is bijna geen trainingsmateriaal met betrekking tot een TA spierbiopsie. Daarom ontwikkelden we een aangepast protocol om relatief onbeschadigde spierbiopten uit de TA te verzamelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Hieronder schetsen we een protocol om mechanisch onbeschadigde vezels te oogsten van de TA van vrijwilligers die waren ingeschreven in een apart lopend onderzoek. Dit protocol is vergelijkbaar met dat beschreven door Shanely et al.3, die hebben beschreven de gewijzigde Bergström techniek in vastus lateralis. De hier gepresenteerde informatie is verfijnd door onze onderzoeksgroep, maar is mogelijk niet ideaal voor alle labgroepen of organisatieopstellingen. We geven alleen richtlijnen, en stelt sterk voor dat laboratoria die nieuw zijn voor biopsie collectie ervaren laboratoriumgroepen raadplegen voordat ze menselijke proeven proberen.
Alle studies uitgevoerd in deze paper werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Faculteit SportWetenschappen van de Ruhr Universiteit Bochum. Deelnemers gaven gratis schriftelijke toestemming voordat ze aan het onderzoek deelnamen.
1. Experimentele bereiding
- Beoordeel uitsluitingscriteria terwijl u tijdens het deelnemersoverleg de gedetailleerde medische geschiedenis van de deelnemer inneemt (zie hieronder).
- Sluit deelnemers uit als ze een verwonding aan de doelspier hebben opgelopen tijdens de 6 weken voorafgaand aan de biopsie. Zorg ervoor dat deelnemers over het algemeen gezond zijn, zich bewust zijn van geen spier- of stollingsstoornissen en momenteel geen medicatie gebruiken die bloedverdunnen veroorzaakt (bijvoorbeeld aspirine).
LET OP: Hier selecteerden we deelnemers die matig actief waren en droegen ze op om zich te onthouden van intensieve of niet-geaccustomeerde beenoefeningen ten minste 3 dagen voor de biopsie. Voor andere onderzoeksvragen kunnen deze criteria echter veranderen.
- Sluit deelnemers uit als ze een verwonding aan de doelspier hebben opgelopen tijdens de 6 weken voorafgaand aan de biopsie. Zorg ervoor dat deelnemers over het algemeen gezond zijn, zich bewust zijn van geen spier- of stollingsstoornissen en momenteel geen medicatie gebruiken die bloedverdunnen veroorzaakt (bijvoorbeeld aspirine).
- Houd u aan sterilisatie en aseptische technieken, zoals geregeld door de Duitse wet en de gangbare praktijk en onder toezicht van de teamarts22,23. Deze procedure kan vaak worden uitgevoerd als een "bed" procedure of in een poliklinische chirurgische suite. Raadpleeg de plaatselijke regelgevende instantie voor begeleiding.
- Stel het biopsieteam samen. We stellen voor dat het biopsieteam bestaat uit 4 personen. Een arts (of opgeleid individu in biopsie collectie), een medische assistent werken met de arts, een assistent die controleert en interageert met de deelnemer, en een assistent die de spierbiopsie behandelt onmiddellijk na extractie. Met deze nummers kan snelle patiëntenzorg worden toegediend als er een medische noodsituatie optreedt tijdens de procedure. Als comfortabel met de procedure, dan is het team kan worden gemaakt van slechts twee mensen: de arts en medisch assistent, die samen zou nemen patiëntenzorg en weefsel verwerking gelijktijdig.
- Laat de deelnemer de projectleider/arts ontmoeten om het toestemmingsformulier van de gebruiker te bekijken, te bespreken en te ondertekenen. Neem een gedetailleerde medische voorgeschiedenis (allergieën, verwondingen of operaties aan de onderste ledematen en TA) en sluit de deelnemer uit als deze voldoet aan een van de uitsluitingscriteria. Bespreek grondig herstel en incisiehygiëne.
- Leg de deelnemer uit dat hij of zij pijn zal hebben, maar direct na de procedure kan rondlopen; het lopen van hellingen of trappen is vaak ongemakkelijk voor de eerste 48 uur, met volledige activiteit meestal terug te keren na 72 uur. Ten slotte, leg uit dat, om infectie en mechanische schaafwonden te beperken, de incisieplaats minstens 1 week verbonden moet blijven en schoon moet blijven.
2. Visualiseer de voorste Tibialis met B-mode Ultrasound
- Instrueer de deelnemer om in een comfortabele supine positie te gaan liggen en zijn beenspieren zoveel mogelijk te ontspannen. Gebruik een op maat gemaakt apparaat (zie hieronder) of laat de assistent de enkel in een licht dorsiflexed positie houden om na te bootsen wat tijdens de biopsie zal worden gedaan.
LET OP: Het is belangrijk dat de deelnemer een ontspannen TA heeft, zodat deze de spierkenmerken tijdens de procedure repliceert. Vraag de deelnemer tijdens het examen om de spier te contracteren en te ontspannen, zodat de veranderingen in de spierarchitectuur kunnen worden opgemerkt. - Gebruik een ultrasone sonde om de oppervlakkige en diepe compartimenten van de TA te visualiseren, om de spierarchitectuur te onderzoeken en te beslissen over de diepte van het inbrengen en de naaldhoek van de aanval(figuur 2A-B). Geef oriëntatiepunten op de huid aan.
- Geef bijzondere aandacht aan de selectie van een doelgebied dat grote aderen, slagaders of zenuwen vermijdt.
- Beoordeel de dwarsdoorsnede van de spier, met het doel om de centrale aponeurose in de TA-spierbuik te identificeren (ongeveer 1/3 van het been, distaal tot aan de knie en 2 cm laterale van de tibiale kam)(figuur 2B). Nota van de locatie en diepte van de centrale aponeurose (meestal 1,5-3 cm), zodat er voor kan worden gezorgd dat de collectie (Bergström) naald niet voorbij dit punt rijdt.
- Plaats de ultrasone sonde in de proximale-distale oriëntatie over de doellocatie en visualiseer de fascicle pennatie en spierdikte(figuur 2A). Gebruik deze informatie om de verzamelnaald (blindelings) in de spierbuik te helpen rijden. Sla afbeeldingen van de doelsite in beide vlakken op voor toekomstige referentie tijdens de chirurgische ingreep.
- Maak met deze informatie een plan voor naaldbeweging naar het doelgebied.
- Plan om de incisie 1-3 cm distale van het doel biopsie gebied te maken. Nadat de naald is doorgegeven in de spier, draai de naald naar een ~ 45% hoek naar de huid langs de lange as van de ledemaat, en vervolgens proximally gedreven naar de biopsie gebied. Deze strategie beperkt de kans om de naald in de centrale aponeurose te drijven, als de naald te hard wordt geduwd. Bovendien kan de naald distally of proximally worden gereden, afhankelijk van de handigheid van de naaldoperator.
3. Biopsieprocedure
- Instrueer de deelnemer om supine op de operatietafel te leggen en zijn beenspieren te ontspannen. Zorg ervoor dat de zichtlijn van de deelnemer naar de biopsieplaats wordt geblokkeerd door een gordijn.
- Verwijder passieve spanning uit de spierbuik door de ledematen van de deelnemer in een apparaat te plaatsen dat de enkel in een licht dorsiflexed positie bevestigt (0-5° van neutraal; Figuur 3). Vraag de patiënt of ze nog steeds hun spieren kunnen ontspannen, omdat te veel dorsiflexie het mogelijk moeilijk kan maken om te ontspannen.
OPMERKING: We hebben vastgesteld dat het verzamelen van biopten van een dorsiflexed voet, niet meer dan 5° neutraal (dat wil zeggen, de zool van de voet loodrecht op de steel) produceert meer consistente en grotere biopsieën dan meer plantar gebogen enkelhoeken. Het apparaat dat de enkel dorsiflexed houdt is een op maat gemaakt apparaat. Echter, een aantal (goedkope) apparaten kunnen worden vervaardigd die nog steeds het gewenste resultaat te produceren.
- Verwijder passieve spanning uit de spierbuik door de ledematen van de deelnemer in een apparaat te plaatsen dat de enkel in een licht dorsiflexed positie bevestigt (0-5° van neutraal; Figuur 3). Vraag de patiënt of ze nog steeds hun spieren kunnen ontspannen, omdat te veel dorsiflexie het mogelijk moeilijk kan maken om te ontspannen.
- Scheer, reinig en ontsmet het geselecteerde incisiegebied, volgens de standaardpraktijken24.
LET OP: Het "schone" gebied van de deelnemer is ongeveer 20 cm proximale-distaal en 10 cm mediaal-laterale van de voorgestelde incisiesite. Raadpleeg echter altijd de (eventuele) nationale voorschriften van de instelling over dit onderwerp. Het desinfectieprotocol omvat het reinigen van de huid schoon en vervolgens vier keer ontsmetten met liberaal gebruik van desinfectiespray van medische kwaliteit. Als de deelnemer om welke reden dan ook de tafel verlaat, moet het desinfectieprotocol opnieuw worden gestart. - Beheer een suprafasciale injectie van 1,5 cc van 2% Xylocitine met Epinephrinum op de biopsieplaats, die fungeert als een lokale verdovings- en vasoconstrictor. Wacht op de toegewezen invloed tijd van ~ 20-30 min.
OPMERKING: Deze geneesmiddelen zijn myotoxisch en mogen dus nooit in de spier worden geïnjecteerd, alleen het onderhuidse weefsel. Als reactie op de vasoconstrictie kan het gebied van de injectieplaats wit worden (op lichtere huidtinten) of grijs (donkerdere huidtinten). - Bevestig het drugeffect met huidplaatsen en zachte porren met een steriele scalpel.
- Op de eerder gemarkeerde biopsie site, maak een 1 cm proximale-distale incisie met een steriele scalpel die snijdt door de huid en fascia, het blootstellen van de spierbuik. Zorg ervoor dat de fascia volledig snijden, omdat de naald is bot en zal niet door de fascia.
- Duw de biopsienaald 0,5-1,0 cm in de spier met een oriëntatie loodrecht op de huid(figuur 2C, 2E).
OPMERKING: De operator voelt een verandering in de spanning die nodig is om de naald door de verschillende weefseltypen te rijden. Het vetweefsel is eenvoudig, de fascia is de zwaarste, en de spier is tussen (maar kan variabel zijn, op basis van de deelnemer). - Oriënteer de naald op een positie van ~45° hoek op de huid, langs de lange as van het been(figuur 2D, 2F). Duw de naald nog eens 1-2 cm in de spier totdat de naaldpunt zich op de doellocatie binnen de spier bevindt.
OPMERKING: De arts moet de opgeslagen echografie beelden gebruiken om rekening te houden met individuele variatie van spierafmetingen. Omdat de incisie alleen groot genoeg is om de naald in te brengen, drijft de arts de naald blindelings door de huid. Er is een "gevoel" dat de biopsie operator opgroeit met ervaring. Een beginner moet leren de vaardigheid van een getrainde biopsie operator (meer hierover in de discussie). - Bevestig de spuit en slang van 100 mL aan de biopsienaald (Figuur 1G). Breng zuigkracht aan op de Bergström naald door de zuiger van de spuit met ongeveer 15-20 mL te trekken om een negatieve druk in de naald te produceren en het spierweefsel in het naaldvenster te zuigen. Dan, accijns de spier door een snelle duw (es) van de trocar over de naald venster.
OPMERKING: Voor en tijdens het zuigen is het soms handig om lichte druk op de huid direct boven het naaldvenster te plaatsen om de spier in de naald te duwen. - Verwijder voorzichtig de naald van het been en draai langzaam. Er mag alleen lichtweerstand zijn tijdens het extraheren van de naald. Als er meer weerstand is, kan dit duiden op een gedeeltelijke biopsiesnede. Het gebeurt dit, de noodzaak terug te keren naar de doellocatie, en opnieuw te bepogingen weefsel collectie.
- Duw het uitgesneden weefsel naar het naaldraam met behulp van de interne ramrod.
- Verwijder het monster voorzichtig uit de naald.
OPMERKING: Onderdompelt de naald in de opvangoplossing (zie vezelvoorbereidingssectie) verjagt vaak de biopsie van de naald. Bovendien kan de spuit worden gebruikt om lucht door de naald te drijven en het monster eruit te duwen. Deze technieken verwijderen de noodzaak om de biopsie fysiek aan te raken met een pincet en verminderen de kans op schade. Als gereedschap, al dan niet gehandschoende wijzers of niet-steriele oplossingen in contact komen met de naald, kan de naald tijdens de procedure niet worden gebruikt. Dus, als een tweede onmiddellijke biopsie nodig is, dan moet een nieuwe steriele naald worden gebruikt. Dit gebeurt vaak, dus het is een beste praktijk om verschillende steriele naalden in reserve te houden. - Identificeer het weefsel als spier en niet vet of bindweefsel. Spierweefsel is gemakkelijk te identificeren uit ander weefsel vanwege de dieprode kleur(figuur 4A). Soms is het verzamelde weefsel geen spier, maar vet of bindweefsel.
- Als een voldoende hoeveelheid spierweefsel wordt verzameld, zet u het protocol voort. Als er niet genoeg spieren zijn, probeer dan opnieuw de biopsie.
- Als een tweede biopsie nodig is, houd de deelnemer goed in de gaten, omdat een tweede naaldduw de deelnemer af en toe oncomfortabeler maakt dan de eerste.
- Was spiermonsters onmiddellijk in een verzameloplossing en bereid je voor op enkelvezelexperimenten (zie spierbiopsiebehandeling en -opslag).
- Laat een ervaren assistent de monsterkwaliteit controleren (zie hieronder) en beoordeel de noodzaak om een tweede biopsie uit te voeren. Een aparte assistent neemt de biopsie voor verwerking, terwijl de rest van het team verder gaat met de deelnemer.
- Sluit de incisieplaats.
- Sluit de incisiewond met steriele Leukostrip tape. Gebruik een of meer stukken om de randen van de incisieplaats te voegen door ze loodrecht op de lange as van de incisie te leggen en leg vervolgens verdere stroken in een sterrenvormig patroon om te beschermen tegen laden met meerdere richtingen.
OPMERKING: Een goede behandeling van deze stap vermindert littekens. Het hechten van de wond kan worden gedaan, maar is niet nodig. Andere opties zijn wondlijm. - Plaats steriele wondverband (bijvoorbeeld Leucomed T plus) over de incisieplaats om te beschermen tegen infectie.
- Wikkel het been met samenhangend elastisch verband (bijvoorbeeld Unihaft) om de initiële bloeding te beperken en te beschermen tegen externe mechanische impact.
- Wikkel het been met acrylastische compressie verband om te voorkomen dat bloeden en de diepere verbanden te beschermen tegen het krijgen van los of vernietigd.
- Sluit de incisiewond met steriele Leukostrip tape. Gebruik een of meer stukken om de randen van de incisieplaats te voegen door ze loodrecht op de lange as van de incisie te leggen en leg vervolgens verdere stroken in een sterrenvormig patroon om te beschermen tegen laden met meerdere richtingen.
4. Post-biopsie zorg
- Vraag de deelnemer om direct na de procedure rond te lopen. Er zal gelokaliseerde pijn zijn. Instrueren de deelnemer om zo normaal mogelijk te lopen.
- Instrueer de deelnemer om het verband niet te verwijderen of laat water het verband weken. Ze moeten ten minste worden vastgehouden: één dagen voor het acrylastische verband, drie dagen voor het samenhangende elastische verband en zeven dagen voor het wondverband. Informeer de deelnemer dat hij of zij indien nodig opnieuw kan worden geband.
- Pas de postbiopsiezorg van een deelnemer af op de behoeften van het individu. Laat een getrainde assistent of arts de deelnemer beoordelen en maak een passend postbiopsiezorgplan. Voor deze procedure stellen we voor dat verdere in vivo neuromusculaire testen van de TA wordt gescheiden door ten minste een week van de biopsie.
5. Behandeling en opslag van spierbiopsie
- Na weefselextractie plaatst u het weefsel onmiddellijk in een 5 mL flacon met rigoropvangoplossing (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), proteaseremmertablet (1), pH 7.0) en licht schudden gedurende 4-6 min om bloed uit te wassen.
- Ruil de Rigor-oplossing in voor verse strengheid, schud licht gedurende 4-6 min en bewaar vervolgens bij 4 °C voor 4-6 uur om de uitwisseling van protease-inhibitor-opslagoplossing en bloed mogelijk te maken.
- Exchange Rigor-oplossing voor 's nachts strengheid (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), proteaseremmer tablet (1), 50:50 glycerol, pH 7.0), en op te slaan bij 4 °C voor 12-18 uur.
- Wissel 's nachts streng voor 50:50 collectie strengheid:glycerol en opgeslagen bij -20 °C voor maximaal 3 maanden, of een jaar in een -80 °C vriezer.
OPMERKING: Dit proces permeabiliseert het vezelmembraan waardoor calcium handmatig in en uit de cel kan worden opgekomen. Dit proces kost tijd en kan verschillen tussen verschillende spieren en soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hele tijd inzet voor een deelnemer was ongeveer een uur (10 min overleg, 10 min echografie, 20 min chirurgie voorbereiding en verdoving toediening, 10 min chirurgie, en 10 min herstel). Vaak activeerden deelnemers onbewust hun TA en hadden ze consistente herinneringen nodig om de spier zo ontspannen mogelijk te houden. Wanneer de biopsienaald in de spier zat, meldden deelnemers meestal een uniek "druk"-gevoel in het gebied rond de biopsienaald, met af en toe perioden van matig tot intens ongemak. Eens, een deelnemer tenen iets krap tijdens de procedure, maar onmiddellijk gestopt nadat de naald werd verwijderd. Biopsie maten waren meestal ~ 50-100 mg (natte massa). De reacties van de deelnemers op de procedure waren vaak onvoorspelbaar. Soms verwachtte de deelnemer tijdens de procedure onaangetast te blijven, maar vertoonde toen tekenen van flauwvallen, terwijl anderen nerveus maar volledig onaangedaan waren tijdens de procedure. Zo vonden we het een goede gewoonte om de deelnemer bezig te houden met een gesprek of hen hun mobiele telefoon te laten gebruiken, zodat hun volledige aandacht niet gericht was op de lopende procedure. De assistent die met de deelnemer sprak, hield ze ook in de gaten op tekenen van angst, pijn of flauwvallen. Soms bevatte een biopsie alleen vet of bindweefsel (geïdentificeerd door een lichtwitte kleur van het weefsel, figuur 4A). In deze gevallen werd onmiddellijk een tweede biopsie genomen (na goedkeuring werd gegeven door de deelnemer). Meestal zal een succesvolle biopsie opleveren >80% spierweefsel(figuur 4A).
Na de operatie voelden de meeste deelnemers ongemak na de procedure die 3-5 dagen duurde. Deelnemers meldden dat ta pijn was vergelijkbaar met wat zou worden verwacht na een dag van wandelen steile hellingen. Er mag gedurende ten minste 5 dagen geen mechanische druk op de incisieplaats worden uitgeoefend, anders kan deze worden heropend. Deelnemers bleven meestal achter met een klein litteken, maar we hebben geen verhoogde of anderszins abnormale veranderingen in de huid waargenomen. Ook ontwikkelden geen deelnemers infecties.
De biopten werden gedurende 6 weken permeabiliseerd (d.w.z. gevild) in een glyceroloplossing (1:1 mengsel van glycerol: rigoroplossing) en vervolgens voorbereid voor mechanische tests op de dag van experimenten. Glycerol permeabilisatie van vezels zorgt voor de verspreiding van de badoplossing in de vezels, die de onderzoeker activering controle geeft en biedt ook een laan om de spier te onderwerpen aan geneesmiddelen of andere chemische stoffen. Bovendien functioneert glycerol als een anti-vriesmiddel, waardoor de spier kan worden plaats in koude temperaturen voor langdurige opslag, met beperkte schade. Er is echter enige tijd nodig om de glycerol in staat te stellen de monsters binnen te dringen, en dus is het in eerste instantie opslaan van biopsiemonsters 's nachts bij 4 °C (idealiter op een schudplaat) verstandig. Spieren kunnen alleen worden opgeslagen voor zo lang voordat hun functie is aangetast. De algemene leidraad voor de kwestie is dat de spieren hun functie binnen de glyceroloplossing gedurende ten minste 3 maanden zullen behouden in een vriezer van -20 °C, of een jaar in een vriezer van -80 °C.
Spiermonsters werden gevisualiseerd onder een dissectiemicroscoop. Sommige stukjes spier waren klein of beschadigd (Figuur 4B) en werden verwijderd. Vervolgens werden groepen vezels beoordeeld op structurele schade (visueel gebroken of geplette vezel sarcolemma, figuur 4C). Uit deze bundels werden kleinere vezelbundels van 3-10 vezels weggesecteerd en zorgvuldig in de experimentele kamer van de mechanische testopstelling geplaatst(figuur 4D). Structureel bruikbare vezellengtes waren typisch 3-5 mm lang. De Bergström naald had een collectie venster van 7 mm, zodat de biopsie kon alleen maximaal opbrengst ~ 7 mm lange vezels. Zo waren de structureel bruikbare vezels die we verzamelden bijna zo lang mogelijk. Meestal bereiden we 5-10 vezelbundel per 50 mg (verzameld) weefsel. De volledige details van deze procedures zijn elders te vinden14,15,25. Om de duurzaamheid van de vezels aan te tonen, tonen we representatieve gegevens van een eenvoudig mechanisch protocol met behulp van glycated TA vezelbundels(figuur 5). 40 vezelbundels van de biopten van 10 deelnemers werden geactiveerd in activeringsoplossing26 (hoog [Ca2+], pCa < 4.2) bij 2,7 μm sarcomere lengte gedurende 60 seconden en steady-state actieve stress werd gemeten als 100,71 ± 11 mN mm-2 (gemiddelde ± SEM).
Figuur 1: De Bergström naald. De Bergström naald gebruikt in deze studie bestaat uit de naald zelf (A-F),zuigslang (G), en spuit (F). De Bergström naald bestaat uit een buitenste naald (A) die een venster dicht bij de naald tip heeft, een kleinere holle interne trocar (B) die beweegt op en neer de naald en snijdt de spier bij het passeren over de naald venster, en een staaf (C) die beweegt op en neer de trochanter om te helpen verwijderen van de spier uit de naald. Deze stukken worden gescheiden door een wasmachine(D)die de naald luchtdicht maakt, en een afstandsman(E)tussen de staaf en trocar beschermt tegen het breken van de spierbiopsie. Ten slotte is er een zuigslangadapter bevestigd. Om de spier in het naaldvenster te trekken, wordt een zuigslang(G)bevestigd aan de naaldadapter en spuit. Dit zuigt de lucht uit de naald en trekt de spier in de naald venster via negatieve druk, waardoor monster verzameling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Echografie en plaatsing van naalden. De TA bestaat uit oppervlakkige en diepe compartimenten die worden gedefinieerd door aponeuroses. De TA is afgebeeld met de echografie sonde georiënteerd in de distal-proximale(A) en mediale-laterale(B)perspectieven, zodat de 3D-vorm van de TA kan worden herkend. Ideale naalddiepte voor het verzamelen is tussen de horizontale stippellijnen. Een beeldverhaalvertegenwoordiging van de naaldinbrengen wordt getoond in panelen C en D. Nadat de incisie is gemaakt, wordt de naald eerst loodrecht op de spier geplaatst en in de spier geduwd totdat het naaldvenster zich in de spier bevindt(C). De naald wordt vervolgens geheroriënteerd naar een ~ 45° hoek langs de lange as van het been, en verder in de spier geduwd, met de aandacht dat de naald niet de diepe aponeurose(D)binnendringt. Live foto's (E, F) tijdens de procedure worden gegeven in verwijzing naar de cartoon (C, D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Plaatsing van deelnemers. De deelnemer legt in een supine positie op de verrichtingslijst. Het hoofd kan worden verhoogd voor comfort. De rechtervoet wordt geplaatst in een aangepast apparaat dat de voet licht dorsiflexed houdt, verminderend spierspanning. Er wordt een gordijn voor de deelnemer geplaatst, zodat hij de procedure niet kan volgen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van spierweefsel. (A) Onmiddellijk na de biopsie zal het spiermonster donkerder rood zijn dan andere weefsels, waaronder vetweefsel en bindweefsel (gelabeld in het paneel). (B) Dissectie van monsters met schade / korte (boven) en levensvatbare (onder) vezel bundels. (C) Vergroting van een levensvatbare vezelgroepering om het oppervlak te inspecteren op tekenen van schade. (D) Een 6-vezel bundel werd ontleed uit de buurt van deze vezel bundel (gebonden aan de uiteinden met 6-0 hechting voor eenvoudige beweging en bevestigd aan het mechanische apparaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve krachtoutput van een vezelbundelvoorbereiding. Om de duurzaamheid van de vezels aan te tonen, tonen we representatieve stressgegevens van een eenvoudig mechanisch protocol met behulp van glycated TA fiber bundel (3 vezels). In totaal werden 40 vezelbundels uit de biopten van 10 deelnemers uitgerekt van speling tot 2,7 μm sarcomere lengte en gehouden om stress-ontspanning mogelijk te maken. Vervolgens werden vezels geactiveerd in activeringsoplossing26 (gearceerd gebied; hoog [Ca2+], pCa < 4.2) bij 2,7 μm sarcomere lengte gedurende 60 seconden en steady-state actieve stress werd gemeten bij 100,71 ± 11 mN mm-2 (gemiddelde SEM). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport beschreven we een techniek voor de biopsie van structureel onbeschadigd spierweefsel van TA. We vonden dat deze procedure een aanvaardbaar gehalte van bruikbare spiervezels (5-10 vezel bundel preparaten per 50 mg verzameld weefsel) voor mechanische testen oplevert. Verder hadden we genoeg weefsel voor de follow-up mechanische, genetische en proteomische experimenten.
Er zijn verschillende methoden die meestal worden gebruikt voor het verzamelen van spierbiopten3,4,6,27,28. De zogenaamde open biopsie20 produceert vezels van de hoogste kwaliteit omdat een chirurg de spier volledig blootstelt en het monster ontleedt. Natuurlijk, open chirurgie is nogal een invasieve procedure en is niet een geschikte procedure om gezonde deelnemers voor te leggen aan, ongeacht de onderzoeksvraag, vanwege de potentiële risico's in verband met open operaties. De minst invasieve biopsie methode is de fijne naald biopsie29,30, die een relatief kleinere naald gebruikt om weefsel te verzamelen. De fijne naaldbiopten zijn voldoende om experimenten uit te voeren op de genetische/chemische/eiwitcomponenten van vezels30,31, maar vaak is de vezelkwaliteit zeer slecht, wat mechanische testen moeilijk of onmogelijk maakt. De Bergström naaldtechniek is een goed compromis tussen de twee hierboven beschreven procedures omdat de operatie minder invasief is dan de open biopsie, maar nog steeds spiermonsters verzamelt die groter en (potentieel) meer structureel intact zijn dan fijne naaldbiopsieën. Eerdere rapporten van de Bergström naald procedure3,5 zijn grote middelen voor degenen die het leren van de techniek, maar alleen aanwezig protocollen voor de vastus lateralis. Ons rapport toont de techniek voor de TA die zich richt op het verzamelen van hoge opbrengsten van structureel intacte vezels voor mechanische testen.
Voor zover wij weten zijn er geen gedetailleerde publicaties over de verzameling ta biopten. Toch is de standaardpraktijk om de deelnemer te laten supine leggen en ze hun been zoveel mogelijk te laten ontspannen. De ontspannen voet in deze positie is van nature plantarflexed, die bijgevolg verlengt de TA en zet het in spanning. We vinden dat elke spierspanning maakt het moeilijker om spieren te rijden in de biopsie naald, zelfs met negatieve druk, en dus spanning moet worden geminimaliseerd zoveel mogelijk. Om dit te bereiken, de eenvoudige maar grote wijziging hier was het gebruik van een op maat gemaakte voetplaat die de enkel in een licht dorsiflexed positie (0 - 5° van neutraal) handhaafde, houdend de TA speling en het verbeteren van inzameling. Clinici moeten oppassen niet te over-dorsiflex de enkel, als de TA zal ongecontroleerd worden geactiveerd, toenemende spanning, die natuurlijk in strijd is met de procedure in de eerste plaats. De deelnemer kan deze spieractivering meestal voelen, dus communicatie is de sleutel. Van de protocollen, de TA levert slechts ~ 25% weefsel in vergelijking met de meer gebruikte vastus lateralis, ~ 100 mg en ~ 400 mg, respectievelijk. Het is dus belangrijk om de grootte van de weefselverzameling te maximaliseren en tegelijkertijd te overwegen of het TA-weefselmonster groot genoeg is voor het gewenste onderzoeksproject(en). We hebben vastgesteld dat het nemen van een tweede monster direct na de eerste geen extra complicaties of genezingstijd voor de deelnemers veroorzaakt.
Hoewel het protocol geeft enige begeleiding naar andere spierbiopten, de spierselectie zal de juiste procedure dicteren. Daarom raden we andere onderzoekers en clinici ten zeerste aan om hun biopsiemethoden volledig te publiceren. Uit ervaring identificeren we een aantal belangrijke factoren voor spierselectie, buiten de onderzoeksvraag. Ten eerste raden we overweegt spieren die oppervlakkig zijn voor de huid en hebben grote slagaders / zenuwen die ofwel diep of gemakkelijk te vermijden. Ten tweede, omdat de deelnemers wakker zijn tijdens de procedure, is het belangrijk om te overwegen of de biopsieprocedure zeer ongemakkelijk zal zijn voor de patiënt, hetzij vanwege de initiële positionering van de patiënt, hetzij vanwege de druk van de biopsienaald, die ook op een ongemakkelijke manier diepere spieren duwt. We hebben succes gehad met de vastus lateralis en pectoralis. Andere potentiële opties zijn de trapezius, latissimus dorsi, en gastrocnemius (hoewel zeer gevasculariseerd en gevoelig voor bloeden). De hamstringspieren zijn mogelijk, maar ongemakkelijk voor de patiënt, en moeilijk omdat ze lateraal bewegen bij het verzamelen van de biopsie.
Hoewel Bergström naalden kunnen worden gekocht bij fabrikanten, sommige laboratoria op maat-maken hun eigen. Kleine, maar slimme, aanpassingen aan het ontwerp kan de opbrengst van lange en onbeschadigde spiervezels te verhogen. Het verzamelvenster van de hier gebruikte naald was bijvoorbeeld 7 mm x 5 mm (lengte x breedte). Dit is geschikt om een kubus van spier vast te leggen. Als het doel echter is om lange en onbeschadigde vezels (van hetzelfde volume) te verzamelen, kan de lengte worden verhoogd en de breedte afnemen (d.w.z. 10 mm x 3,5 mm). Als de naald is georiënteerd langs de fascicle richting, dan is het waarschijnlijk dat deze naald langere vezel secties zou verzamelen.
Spierbiopten worden vaak veilig verzameld zonder begeleiding van een echografie, vooral voor grotere spieren zoals de vastus lateralis. In deze situatie kan een goed ervaren arts gemakkelijk palpate de spier om de beste incisie site te vinden. Echter, wanneer de arts is minder ervaren met de doelspier, of extra zorg is gerechtvaardigd om grote zenuwen of bloedvaten te voorkomen, de echografie is een groot en eenvoudig toegepast instrument. Ten slotte kan na de operatie monitoring van het biopsiegebied snel worden bereikt met behulp van een echografie.
Pediatrische biopten zijn zeker mogelijk en vaak uitgevoerd32,33,34. Er zijn echter meestal verschillende wijzigingen aangebracht in de procedure. Een kleinere maatnaald en bewuste sedatie zijn vaak vereist, en de procedure vindt plaats in een ziekenhuisomgeving. In het algemeen kan de ervaring traumatisch zijn voor een kind en onderzoeksgroepen die gezonde pediatrische deelnemers willen opnemen, moeten dit zorgvuldig afwegen tegen de potentiële verdiensten van de studie.
Vezelbundels of ongebruikt materiaal kunnen worden overgedragen naar andere experimenten voor of na vezelmechanica. Technieken die bijvoorbeeld het sarcomerische eiwitgehalte beoordelen of het isoforme type classificeren, kunnen35worden uitgevoerd. Om de afbraak van eiwitten te beperken en het succes van de analyse te verbeteren, moet weefsel echter na de oorspronkelijke extractie, onmiddellijk na mechanische evaluatie, in vloeibare stikstof worden ingevroren of onmiddellijk worden verwerkt voor eiwitanalyse. Vezels kunnen ook worden voorbereid op immunohistochemie of andere beeldvormingstechnieken36 die het mogelijk maken voor de beoordeling van de eiwitpositie in de vezel. In dit geval kunnen vezels in een fixatieve oplossing worden geplaatst (bijvoorbeeld 4% paraformaldehyde/0,25% glutaraldehyde in fysiologische buffer bij pH 7; geen glutaraldehyde voor immunohistochemie) terwijl het nog op het mechanische testapparaat zit, waarbij de sarcomerische structuren op een gewenste sarcomerelengte behouden blijven. Indien mogelijk kan een klein stukje van de oorspronkelijke biopsie worden geoogst, krachtig gewassen in de inzameloplossing gedurende 10 minuten en vervolgens in fixatieve oplossing worden geplaatst. Veel groepen geven er de voorkeur aan om onmiddellijk vers uitgesneden monsters in isopentane te flashen, wat de vorming van schadelijke ijskristallen beperkt en de beeldkwaliteit verbetert voor visuele beoordelingen. Dit is inderdaad de gouden standaard voor flash bevriezing; We stellen echter vast dat de schade aan het ijskristal door het bevriezen van stikstof alleen gericht is op extra-myofibrilstructuren. We hebben een bevredigende structurele integriteit van sarcomerische componenten in monsters die ook in vloeibare stikstof zijn ingevroren, en dus denken we dat stikstof een mogelijkheid is, vooral als het gemakkelijker beschikbaar is, of het chirurgisch team /lokale chemische autoriteit niet bereid is om isopentane te gebruiken. Een belangrijk en vaak ongemeld probleem met het voorbereiden van monsters voor het bekijken is dat de sarcomeres vaak worden gecontracteerd / kort, met de I-band regio van de sarcomere kort of niet waarneembaar. Om dit te overwinnen, moet de onderzoeker handmatig rekken de vezel monsters (door het testapparaat of met de hand met behulp van fijne pincet) voor de vaststelling. Als algemene regel, we rekken tot ~ 3,2 μm sarcomere lengte (gemeten via laser diffractie), of rekken tot ~ 150% van de slappe lengte, in een laag calcium fysiologische ontspannen oplossing. Ten slotte, als submonsters worden gezocht voor RNA-expressieanalyse, heeft de methode van flash-freezing geen invloed op de resultaten, maar monsters moeten onmiddellijk na de oorspronkelijke extractie worden ingevroren en in een vriezer van -80 °C worden geplaatst, omdat RNA zeer instabiel is. Er zijn een aantal RNA-bescherming opslag oplossingen op de markt, maar we hebben gemengde resultaten gevonden met het gebruik ervan, en alleen flash bevriezen verse monsters.
Om de hoeveelheid informatie die tijdens één proef wordt verzameld te maximaliseren, kan gelijktijdig verzamelen van andere gegevens worden voltooid tijdens het uitvoeren van mechanische tests. Zo kan de studie van sarcomerische structuren worden uitgevoerd tijdens mechanische tests met behulp van lage-hoek riffractiebeeldvorming, zoals bij andere dieren37,38. Voor genetische experimenten moet de uitgesneden spier onmiddellijk voor dat doel worden verwerkt of geflitst worden omdat DNA/RNA relatief minder stabiel is dan eiwitten.
Sommige beperkingen zijn hierboven al beschreven. Hier bespreken we de procedure zelf. Een grote beperking voor de meeste groepen is het hebben van een teamlid dat op de juiste manier is opgeleid in biopsie collectie. Ongeacht het beroep van de persoon (arts, medisch assistent, technicus, of anderszins), deze procedure is moeilijk omdat de onderzoeker rijdt de naald blindelings en moet vertrouwen op "gevoel"3,28 om de naald venster nauwkeurig te lokaliseren. Fouten zijn niet aanvaardbaar omdat instemmende menselijke deelnemers voor biopten schaars zijn, een biopsie is beter dan veel, en fouten kunnen leiden tot vasculaire of zenuwschade. Daarom moeten alle trainingsmogelijkheden worden voltooid voordat een menselijke biopsie wordt uitgevoerd. Bijvoorbeeld, om een "gevoel" te krijgen voor het besturen van de naald, varkensvlees met de huid nog steeds bevestigd kan worden gekocht bij de meeste supermarkten en gebruikt als een proxy voor de menselijke huid en spieren. Een andere waardevolle ervaring is het schaduwen van een getrainde onderzoeksgroep.
We beoordeelden de pijn/het ongemak van de deelnemers kwalitatief, op basis van de ervaring van de arts en gesprekken met de deelnemer om waargenomen pijn te beoordelen. Echter, de beoordeling van pijn en post-biopsie ongemak kan meer gekwantificeerd en vergelijkbaar over individuen en studies door het gebruik van gevalideerde pijn / ongemak enquêtes. Deze punten hebben verrassend weinig behandeling in de literatuur. Echter, een recente studie presenteerde een manier om de pijn / ongemak van de deelnemer te kwantificeren voor, tijdens en na biopsieën, door gebruik te maken van goed ingeburgerde enquêtes naar pijn39. We merken op dat dit papier de vastus lateralis als doelspier gebruikte, en dus zijn vervolgstudies nodig om pijnbeoordelingen tussen spieren te vergelijken.
Ongeacht de extractiemethode kan de Bergström-techniek de totale lengte van de vezel in de spier niet uitbouwen omdat vezels te lang zijn (~6-8 cm in TA40, ~ 6,5-8 cm in vastus lateralis40). Daarom is het onvermijdelijk dat voor een lang stuk verzamelde vezels de uiteinden worden vernietigd door de biopsietechniek. Vaak is het bruikbare centrale gedeelte van een vezel klein en dus is het moeilijk om mechanisch te testen. Hoewel de techniek redelijk lange centrale gebieden (3-5 mm) biedt, moet de onderzoeker de kwaliteit van de vezelbundels zorgvuldig controleren tijdens de dissectie, omdat het gebruik van beschadigde vezels passieve of actieve krachtuitgangen zal veranderen. Visuele observatie van succesvolle biopten toont een deel van de vezels die onbeschadigd zijn van de biopsieprocedure. Wanneer bekeken vanuit een traditionele dissectie lichtmicroscoop, zal het oppervlak van vezels er glad uitzien, zonder gaten of scheuren(figuur 4). Bovendien moeten vezels er cilindrisch uitzien en geen afgeplatte gebieden hebben. Hoewel niet zichtbaar, zal de spier zelf na verloop van tijd degraderen vanwege natuurlijk voorkomende proteasen die de spiereiwitten vrijwel onmiddellijk na de extractie beginnen af te breken. Het is dus van cruciaal belang om proteaseremmers toe te voegen aan alle oplossingen die met de vezels worden gebruikt. Verder stellen we ook extra wasbeurten van de biopten voor om zoveel mogelijk bloed te verwijderen.
Zelfs met een zorgvuldige voorbereiding, vezel schade kan optreden en leiden tot slechte vezel activeringen. Er zijn vele redenen voor vezelschade omdat vezels zijn zeer gevoelig voor bijna elk deel van de procedure. Bijvoorbeeld, tijdens de biopsie, als de trocar niet scherp genoeg is, kan het duwen in het spierweefsel tijdens de extractie in plaats van snijden door het, die kan rekken en vernietigen van de vezels. De inzameloplossing moet op de juiste manier worden voorbereid omdat vezels gevoelig zijn voor osmotische veranderingen, pH en temperatuur. Bij het hanteren van de vezels, moet grote zorg worden genomen om volledig te beperken druk op de vezels. In plaats daarvan moeten pincet worden gebruikt om de biopsie te grijpen door zijn bindweefsel. Een ander alternatief is het gebruik van een maat 0-7 zijde hechting om een onbruikbaar einde van de biopsie wrap en dan pak dit bij het hanteren. Ten slotte dient de glycerol twee rollen: de eerste is om de spier te houden van bevriezing, terwijl op -20 °C en de tweede is om een mild wasmiddel voor de vezel. Dat wil zeggen, glycerol permeabiliseert de vezel naar externe oplossingen, waardoor de instroom van calcium (via een activeringsoplossing). Voor de meeste spieren duurt dit proces ~10 dagen. Echter, afhankelijk van de hoeveelheid collageen inhoud en de grootte van het monster, dit kan duren tot 6 weken. Vezels moeten worden doordarmd voor een hoge calcium activering optreden tijdens mechanische experimenten. Vezels zijn over het algemeen bruikbaar voor ten minste 3 maanden. Om vezelafval te beperken, wordt een langere permeabilisatie wachttijd (4-6 weken) voorgesteld voor TA spiervezels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Michaela Rau, Lea-Fedia Rissmann, Michael Marsh, Janina-Sophie Tennler, Kilian Kimmeskamp en Wolfgang Linke voor hun assist bij het project. De financiering voor dit project werd verstrekt door de MERCUR Foundation (ID: An-2016-0050) aan DH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe | B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany |
4606027V | Drug administration |
| 5mm Berstöm needle | homemade | N/A | Tissue collection. Similar to other Berstöm needles |
| Acrylastic | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
269700 | elastic compression bandage |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11836145001 | Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue. |
| Cutasept | PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany |
9805630 | Disenfectant spray for the skin |
| Leucomed T plus | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
7238201 | Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection |
| Leukostrip | Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain |
66002876 | wound closure |
| Surgical disposable scalpels | Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany |
BA200 series | Incision |
| Unihaft cohesive elastic bandage | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
4589600 | cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact |
| Xylocitin 2% with Epinephrin | Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany |
N/A | Controlled substance anesthesia, vasoconstriction |
References
- Franchi, M., et al. Architectural, functional and molecular responses to concentric and eccentric loading in human skeletal muscle. Acta Physiologica. 210 (3), 642-654 (2014).
- Duchene, G. B. A. De la paralysie musculaire pseudo-hypertrophique, ou paralysie myo-sclérosique / par le Dr Duchenne (de Boulogne). Archives of General Internal Medicine. 11 (30), (1868).
- Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified Bergström technique. Journal of Visualized Experiments. (91), e51812 (2014).
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine and Science in Sports and Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35 (7), 609-616 (1975).
- Baczynska, A. M., et al. Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome. Journal of Visualized Experiments. (109), e53075 (2016).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Buck, E., et al. High-resolution respirometry of fine-needle muscle biopsies in pre-manifest Huntington's disease expansion mutation carriers shows normal mitochondrial respiratory function. Plos One. 12 (4), 01175248 (2017).
- Murgia, M., et al. Single Muscle Fiber Proteomics Reveals Fiber-Type-Specific Features of Human Muscle Aging. Cell Reports. 19 (11), 2396-2409 (2017).
- Friedmann-Bette, B., et al. Effects of strength training with eccentric overload on muscle adaptation in male athletes. European Journal of Applied Physiology. 108 (4), 821-836 (2010).
- McPhee, J. S., et al. The contributions of fibre atrophy, fibre loss, in situ specific force and voluntary activation to weakness in sarcopenia. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (10), 1287-1294 (2018).
- Nocella, M., Cecchi, G., Bagni, M. A., Colombini, B. Force enhancement after stretch in mammalian muscle fiber: no evidence of cross-bridge involvement. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (12), 1123-1129 (2014).
- Patel, J. R., McDonald, K. S., Wolff, M. R., Moss, R. L. Ca2+ binding to troponin C in skinned skeletal muscle fibers assessed with caged Ca2+ and a Ca2+ fluorophore. Invariance of Ca2+ binding as a function of sarcomere length. The Journal of Biological Chemistry. 272 (9), 6018-6027 (1997).
- Hessel, A. L., Joumaa, V., Eck, S., Herzog, W., Nishikawa, K. C. Optimal length, calcium sensitivity and twitch characteristics of skeletal muscles from mdm mice with a deletion in N2A titin. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 12 (2019).
- Joumaa, V., Herzog, W. Calcium sensitivity of residual force enhancement in rabbit skinned fibers. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (4), 395-401 (2014).
- Joumaa, V., Rassier, D. E., Leonard, T. R., Herzog, W. The origin of passive force enhancement in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 294 (1), 74-78 (2008).
- Hilber, K., Galler, S. Mechanical properties and myosin heavy chain isoform composition of skinned skeletal muscle fibres from a human biopsy sample. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 434 (5), 551-558 (1997).
- Miller, M. S., et al. Chronic heart failure decreases cross-bridge kinetics in single skeletal muscle fibres from humans. The Journal of Physiology. 588, Pt 20 4039-4053 (2010).
- Pinnell, R. A. M., et al. Residual force enhancement and force depression in human single muscle fibres. Journal of Biomechanics. 91, 164-169 (2019).
- Einarsson, F., Runesson, E., Fridén, J. Passive mechanical features of single fibers from human muscle biopsies--effects of storage. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 3, 22 (2008).
- Flann, K. L., LaStayo, P. C., McClain, D. A., Hazel, M., Lindstedt, S. L. Muscle damage and muscle remodeling: no pain, no gain. The Journal of Experimental Biology. 214, Pt 4 674-679 (2011).
- Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention (KRINKO), Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM). Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten [Hygiene requirements for the reprocessing of medical devices]. Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz. 55 (10), 1244-1310 (2012).
- Koch-Institut, R. Ergänzung zur Empfehlung Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten. RKI-Bib1. , Robert Koch-Institut. (2018).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Disinfection and sterilization in healthcare facilities. Practical Healthcare Epidemiology. , 58-81 (2018).
- Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Sarcomere length-dependence of activity-dependent twitch potentiation in mouse skeletal muscle. BMC Physiology. 2, 19 (2002).
- Mounier, Y., Holy, X., Stevens, L. Compared properties of the contractile system of skinned slow and fast rat muscle fibres. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 415 (2), 136-141 (1989).
- Henriksson, K. G. Semi-open muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurologica Scandinavica. 59 (6), 317-323 (1979).
- Dietrichson, P., et al. Conchotome and needle percutaneous biopsy of skeletal muscle. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 50 (11), 1461-1467 (1987).
- Iachettini, S., et al. Tibialis anterior muscle needle biopsy and sensitive biomolecular methods: a useful tool in myotonic dystrophy type 1. European Journal of Histochemistry. 59 (4), 2562 (2015).
- Cotter, J. A., et al. Suction-modified needle biopsy technique for the human soleus muscle. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 84 (10), 1066-1073 (2013).
- Edwards, R. H., Round, J. M., Jones, D. A. Needle biopsy of skeletal muscle: a review of 10 years experience. Muscle & Nerve. 6 (9), 676-683 (1983).
- Gibreel, W. O., et al. Safety and yield of muscle biopsy in pediatric patients in the modern era. Journal of Pediatric Surgery. 49 (9), 1429-1432 (2014).
- Cuisset, J. M., et al. Muscle biopsy in children: Usefulness in 2012. Revue Neurologique. 169 (8-9), 632-639 (2013).
- Nilipor, Y., et al. Evaluation of one hundred pediatric muscle biopsies during a 2-year period in mofid children and toos hospitals. Iranian Journal of Child Neurology. 7 (2), 17-21 (2013).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Wang, K., Wright, J. Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z line. The Journal of Cell Biology. 107 (6), 2199-2212 (1988).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin head configurations in resting and contracting murine skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Ma, W., Gong, H., Kiss, B., Lee, E. J., Granzier, H., Irving, T. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Bonafiglia, J. T., et al. A comparison of pain responses, hemodynamic reactivity and fibre type composition between Bergström and microbiopsy skeletal muscle biopsies. Current Research in Physiology. 3, 1-10 (2020).
- Wickiewicz, T. L., Roy, R. R., Powell, P. L., Edgerton, V. R. Muscle architecture of the human lower limb. Clinical Orthopaedics and Related Research. (179), 275-283 (1983).
