Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Coleta de Biópsias Musculares Esqueléticas do Compartimento Superior do Musculus Tibialis Anterior para Avaliação Mecânica

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61598
Automatic Translation
1,4, 1,2, 3
1Faculty of Sport Science, Human Movement Science, Ruhr University Bochum, 2School of Human Movement and Nutrition Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Sport Science, Sports Medicine and Sports Nutrition, Ruhr University Bochum, 4Institute of Physiology II, University of Muenster

Summary

Este relatório técnico descreve uma variação da técnica modificada de Bergström para a biópsia do musculus tibialis anterior que limita o dano da fibra.

Abstract

As propriedades mecânicas da contração de fibras esqueléticas são indicadores cruciais da saúde, função e desempenho muscular geral. Biópsias musculares esqueléticas humanas são frequentemente coletadas para esses esforços. No entanto, relativamente poucas descrições técnicas de procedimentos de biópsia, fora do musculus vastus lateralis comumente usado, estão disponíveis. Embora as técnicas de biópsia sejam frequentemente ajustadas para acomodar as características de cada músculo em estudo, poucos relatórios técnicos compartilham essas alterações para a comunidade maior. Assim, o tecido muscular dos participantes humanos é muitas vezes desperdiçado à medida que o operador reinventa a roda. Expandir o material disponível em biópsias de uma variedade de músculos pode reduzir o incidente de biópsias fracassadas. Este relatório técnico descreve uma variação da técnica bergström modificada no musculus tibialis anterior que limita o dano de fibra e fornece comprimentos de fibra adequados para avaliação mecânica. A cirurgia é um procedimento ambulatorial que pode ser concluído em uma hora. O período de recuperação deste procedimento é imediato para atividade leve (ou seja, caminhada), até três dias para a retomada da atividade física normal, e cerca de uma semana para cuidados com feridas. O tecido extraído pode ser usado para experimentos de força mecânica e aqui apresentamos dados de ativação representativos. Este protocolo é apropriado para a maioria dos propósitos de coleta, potencialmente adaptável a outros músculos esqueléticos, e pode ser melhorado por modificações na agulha de coleta.

Introduction

O estudo da fisiologia muscular humana para fins clínicos ou de pesquisa muitas vezes requer biópsias musculares. Por exemplo, um grande desafio na fisiologia muscular humana e na biomecânica é distinguir e entender as diversas adaptações do desempenho muscular ao exercício. As adaptações de desempenho não incluem apenas adaptações estruturais (por exemplo, mudanças nas proteínas contratuais, arquitetura muscular), mas também incluem adaptações neurais1, que são muito difíceis, se não impossíveis, de avaliar separadamente ao testar intactos nos músculos humanos. Experimentos de nível de fibra removem esses componentes de ordem mais alta e permitem uma avaliação mais direta da contração muscular e podem ser coletados através de técnicas de biópsia. Biópsias musculares foram coletadas desde pelo menos 18682. Hoje, a técnica predominante para coletar biópsias musculares é a técnica modificada bergström3,4,5, embora outras técnicas estejam disponíveis, incluindo o uso de um conchotome Weil-Blakesley6 ou a chamada agulha fina7,8. Todas essas técnicas usam instrumentos especiais semelhantes a agulhas que são projetados para passar para o músculo e cortar um pedaço de tecido. Especificamente, a técnica bergström modificada usa uma agulha grande modificada (tamanho de agulha de 5 mm aqui; Figura 1) que tem uma janela próxima à ponta da agulha e um trocarte interno menor que se move para cima e para baixo da agulha, cortando o músculo ao passar sobre a janela da agulha. Dentro deste trocariola está um ramrod que se move para cima e para baixo no eixo do trocarte e empurra a biópsia em direção à janela da agulha. Para puxar o músculo para dentro da janela da agulha, uma mangueira de sucção é anexada, que suga o ar da agulha e puxa o músculo para dentro da janela da agulha através de pressão negativa.

Biópsias musculares são frequentemente adquiridas para estudar mudanças no conteúdo proteico, expressão genética ou morfologia causadas por doença ou em resposta a um programa de exercícios1,,9,,10,11. Outro uso crítico para biópsias musculares são experimentos mecânicos como a medição da força contratil de fibra, rigidez da fibra muscular e propriedades musculares dependentes da história12,,13,,14,,15,16. A mecânica de feixe de fibra única ou fibra é medida pela fixação de fibras entre um motor de comprimento e transdutor de força em plataformas especializadas que controlam o comprimento da fibra ao mesmo tempo em que medem a força. Ao permeabilizar (por exemplo, esfolar) fibras, a membrana sarcolemma torna-se permeável aos produtos químicos na solução de banho, permitindo o controle de ativação por meio da concentração de cálcio variada. Além disso, o efeito das propriedades contratuais em produtos químicos/farmacêuticos/outras proteínas pode ser facilmente avaliado adicionando o reagente em questão à solução de banho. No entanto, embora essa técnica seja altamente utilizada em outros modelos animais, notavelmente menos estudos realizaram testes mecânicos em fibras esfoladas de biópsias musculares humanas17,,18,,19. Uma das razões é que as ferramentas e protocolos de biópsia são projetados para remover o máximo de tecido muscular possível com menos consideração pelo nível de dano estrutural sofrido durante a extração tecidual. De fato, um protocolo de biópsia recente sugere conduzir a agulha da biópsia para dentro do músculo e coletar 2-4 pedaços de músculo3. O processo em si faz pouco dano ao DNA ou material proteico, mas muitas vezes destrói fibras e estruturas sarcomericas de tal forma que a ativação de fibras musculares se torna instável ou impossível. Além disso, o comprimento relativo das fibras dentro da biópsia são tipicamente curtos (<2 mm) e não são facilmente manuseados para testes mecânicos. Para testes mecânicos, as fibras ideais são longas (3-5 mm) e não são estruturalmente danificadas.

Técnicas mais avançadas de extração de tecidos podem ser usadas para limitar danos de fibras. Por exemplo, um grupo20 aproveitou as "cirurgias abertas" previamente planejadas de antebraços (por exemplo, reparação de fratura óssea), onde os músculos foram totalmente expostos e um cirurgião foi capaz de visualizar a estrutura muscular e dissecar cuidadosamente amostras relativamente grandes e estruturalmente intactas de tecido muscular (15 mm x 5mm x 5 mm). Essa técnica de "biópsia aberta" é favorecida quando os participantes estão passando por um procedimento previamente planejado, e assim limita o pool de potenciais participantes, especialmente para adultos saudáveis, onde não ocorreria cirurgias de outra forma. Assim, muitas biópsias realizadas para fins de pesquisa são feitas como procedimento ambulatorial e o local de incisão é mantido o menor possível para limitar o risco de infecção, cicatrizes e tempo de cura. Portanto, a maioria das biópsias são coletadas cegamente (ou seja, o operador não consegue ver a agulha de coleta à medida que passa pela fáscia para dentro do músculo). Isso implica que a qualidade da biópsia é quase inteiramente baseada na habilidade e experiência do operador. Cada músculo tem suas próprias dificuldades ao coletar tecidos, como riscos de violar nervos e vasos sanguíneos, seleção de uma profundidade e localização de coleta ideal, e decidir uma posição corporal adequada para manter o músculo o mais frouxo possível. Infelizmente, a maioria das habilidades específicas dos músculos não são escritas e, portanto, cada médico deve "reinventar a roda" ao realizar biópsias em músculos novos para eles. Essa falta de experiência geralmente leva a várias coleções de baixa qualidade até que o médico identifique as melhores práticas para biópsias nesse músculo. Médicos iniciantes frequentemente aprendem a habilidade através de conversas com seus colegas mais experientes, mas relativamente poucos textos informativos e revisados por pares existem sobre o assunto, especialmente para músculos que não são tradicionalmente usados para coleta de biópsia. Se considerarmos as informações acima, juntamente com a dificuldade de recrutar voluntários humanos para biópsias, fica claro que são necessárias mais informações de ensino que maximizam as chances de sucesso para cada participante.

Assim, o objetivo deste artigo foi apresentar uma técnica de biópsia muscular que fornece protocolos para a coleta bem sucedida de biópsias musculares com fragmentos de fibras longas e não danificados para testes mecânicos. Biópsias musculares humanas são geralmente realizadas, e a maior parte do material de treinamento de biópsia está ligado, o musculus vastus lateralis. Seu tamanho muscular relativamente grande e localização superficial em relação à pele permite a coleta de tecido muscular adequado, minimizando o desconforto do paciente e o trauma físico1,21. No entanto, existem algumas limitações para o uso da vasto lateralis para estudos de treinamento longitudinal. Por exemplo, durante protocolos experimentais que incluem um programa de treinamento, os participantes devem abster-se de treinamento adicional fora do estudo por um período que muitas vezes se estende por 2-6 meses. Para os atletas, isso muitas vezes não é possível, pois a vasto lateralis geralmente é treinada durante exercícios típicos (por exemplo, agachamentos, saltos), ou geralmente é usada para o esporte (por exemplo, corrida, ciclismo). Essas experiências de treinamento separadas longe do objetivo do estudo podem causar adaptações musculares que alteram a mecânica muscular, a arquitetura e a fisiologia de tal forma que é difícil ou impossível saber o verdadeiro efeito do protocolo experimental do estudo sobre as propriedades musculares. Para esses tipos de estudos, seria ideal selecionar um músculo alvo que muitas vezes não é o foco dos regimentos de treinamento. O musculus tibialis anterior (TA) é um músculo alvo ideal que satisfaz os requisitos acima. Além disso, intervenções de treinamento podem ser direcionadas para o TA utilizando abordagens controláveis, como com o uso de um dinamômetro. Quase não há material de treinamento relativo a uma biópsia muscular. Por isso, desenvolvemos um protocolo modificado para coletar biópsias musculares relativamente intactas do TA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: Abaixo, delineamos um protocolo para colher fibras mecanicamente intactas do TA de voluntários que estavam inscritos em um estudo em andamento separado. Este protocolo é semelhante ao descrito por Shanely et al.3, que descreveram a técnica modificada de Bergström em vasto lateralis. As informações aqui apresentadas foram refinadas pelo nosso grupo de pesquisa, mas podem não ser ideais para todos os grupos de laboratório ou configurações organizacionais. Nós damos apenas diretrizes, e sugere fortemente que os laboratórios novos na coleta de biópsia consultem grupos de laboratório experientes antes de tentar qualquer teste em humanos.

Todos os estudos realizados neste artigo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciência do Esporte da Universidade Ruhr Bochum. Os participantes deram consentimento livre por escrito informado antes de participarem do estudo.

1. Preparação experimental

  1. Avalie os critérios de exclusão ao mesmo tempo em que leva o histórico médico detalhado do participante durante a consulta ao participante (veja abaixo).
    1. Exclua os participantes se sofrerem uma lesão no músculo alvo durante as 6 semanas que antecederam a biópsia. Certifique-se de que os participantes são geralmente saudáveis, conscientes de nenhum distúrbio muscular ou de coagulação, e não estão atualmente sob medicação que causa afinamento do sangue (por exemplo, aspirina).
      NOTA: Aqui, selecionamos os participantes que eram moderadamente ativos e os instruímos a se absterem de exercícios intensivos ou não desacostumados nas pernas pelo menos 3 dias antes da biópsia. No entanto, para outras questões de pesquisa, esses critérios podem mudar.
  2. Aderir à esterilização e técnicas assépticas, conforme regulamentado pela lei alemã e prática comum e supervisionado pelo médico da equipe22,23. Este procedimento pode muitas vezes ser conduzido como um procedimento de "cabeceira" ou em uma suíte cirúrgica ambulatorial. Consulte o órgão regulador local para obter orientação.
  3. Componha a equipe de biópsia. Sugerimos que a equipe de biópsia inclua 4 pessoas. Um médico (ou indivíduo treinado na coleta de biópsia), um assistente médico trabalhando com o médico, um assistente que monitora e interage com o participante, e um assistente que cuida da biópsia muscular imediatamente após a extração. Com esses números, o atendimento rápido ao paciente pode ser administrado se ocorrer uma emergência médica durante o procedimento. Se confortável com o procedimento, a equipe poderia ser feita de apenas duas pessoas: o médico e o assistente médico, que juntos assumiriam o atendimento ao paciente e o processamento de tecidos simultaneamente.
  4. Que o participante se reúte com o líder/médico do projeto para revisar, discutir e assinar o formulário de consentimento do usuário. Pegue um histórico médico detalhado (alergias, lesões ou cirurgias no membro inferior e TA) e exclua o participante se atender a algum dos critérios de exclusão. Discuta minuciosamente a higiene da recuperação e incisão.
    1. Explique ao participante que eles ficarão doloridos, mas capazes de andar imediatamente após o procedimento; descer encostas ou escadas é muitas vezes desconfortável durante as primeiras 48 horas, com atividade completa geralmente retornando após 72 horas. Por fim, explique que, para limitar a infecção e as escoriações mecânicas, o local da incisão deve permanecer enfaixado por pelo menos 1 semana e mantido limpo.

2. Visualize a Tibialis Anterior com ultrassom no modo B

  1. Instrua o participante a se deitar em uma posição supina confortável e relaxar os músculos das pernas o máximo possível. Use um dispositivo feito sob medida (veja abaixo) ou peça ao assistente para segurar o tornozelo em uma posição ligeiramente dorsiflexed para imitar o que será feito durante a biópsia.
    NOTA: É importante que o participante tenha um TA relaxado para que ele replique as características musculares durante o procedimento. Durante o exame, peça ao participante para contrair e relaxar o músculo para que as mudanças na arquitetura muscular possam ser notadas.
  2. Use uma sonda de ultrassom para visualizar os compartimentos superficiais e profundos do TA, para examinar a arquitetura muscular e decidir sobre a profundidade de inserção e ângulo de agulha de ataque(Figura 2A-B). Indique marcos na pele.
    1. Dê especial atenção à seleção de uma área alvo que evite veias, artérias ou nervos principais.
    2. Avalie a seção transversal do músculo, com o objetivo de identificar a aponeurose central dentro da barriga muscular ta (aproximadamente 1/3 da perna, distal ao joelho, e 2 cm lateral da crista tibial) (Figura 2B). Registre a localização e a profundidade da aponeurose central (geralmente 1,5-3 cm) para que se possa tomar cuidado para não conduzir a agulha de coleta (Bergström) além deste ponto.
    3. Posicione a sonda de ultrassom na orientação proximal-distal sobre o local alvo e visualize a cunhada de fascícula e espessura muscular(Figura 2A). Use essas informações para ajudar a conduzir com sucesso (cegamente) a agulha de coleta para dentro da barriga muscular. Salve imagens do local alvo em ambos os planos para referência futura durante o procedimento cirúrgico.
  3. Com essas informações, crie um plano para o movimento da agulha em direção à área alvo.
    1. Planeje fazer a incisão 1-3 cm distal da área de biópsia alvo. Depois que a agulha é passada para dentro do músculo, gire a agulha para um ângulo de ~45% para a pele ao longo do eixo longo do membro, e, em seguida, conduzido proximalmente em direção à área de biópsia. Esta estratégia limita a chance de conduzir a agulha para a aponeurose central, se a agulha for empurrada com muita força. Além disso, a agulha pode ser conduzida de forma distral ou proximicamente, dependendo da entrega do operador da agulha.

3. Procedimento de biópsia

  1. Instrua o participante a colocar supino na mesa de cirurgia e relaxar os músculos das pernas. Certifique-se de que a linha de visão do participante para o local da biópsia está bloqueada por uma cortina.
    1. Remova a tensão passiva da barriga muscular colocando o membro do participante em um dispositivo que fixa o tornozelo em uma posição ligeiramente dorsiflexed (0-5° de neutro; Figura 3). Pergunte ao paciente se eles ainda podem relaxar seus músculos, pois muita dorsiflexão pode potencialmente dificultar a relaxamento.
      NOTA: Descobrimos que a coleta de biópsias a partir de um pé dorsiflexed, não mais do que 5° de neutro (ou seja, a sola do pé perpendicular à haste) produz biópsias mais consistentes e maiores do que ângulos de tornozelo flexionados mais plantares. O dispositivo que mantém o tornozelo dorsiflexado é um dispositivo personalizado. No entanto, qualquer número de dispositivos (baratos) pode ser fabricado que ainda produza o resultado desejado.
  2. Barbear, limpar e desinfetar a área de incisão selecionada, conforme as práticas padrão24.
    NOTA: A área "limpa" do participante é de cerca de 20 cm proximal-distal e 10 cm medial-lateral do local de incisão proposto. No entanto, consulte sempre as normas da instituição e/ou nacionais (se houver) sobre este tema. O protocolo de desinfecção inclui esfregar a pele limpa e, em seguida, desinfetar quatro vezes com o uso liberal de spray de desinfecção de grau médico. Se o participante sair da mesa por qualquer motivo, o protocolo de desinfecção deve ser reiniciado.
  3. Administre uma injeção suprafascial de 1,5 cc de 2% de Xilocitina com Epinefrina no local da biópsia, que funciona como um anestésico local e vasoconstrictor. Aguarde o tempo de afeto alocado de ~20-30 min.
    NOTA: Estas drogas são miotóxicos e, portanto, nunca devem ser injetadas no músculo, apenas o tecido subcutâneo. Como reação à vasoconstrição, a área do local da injeção pode ficar branca (em tons de pele mais claros) ou cinza (tons de pele mais escuros).
  4. Confirme o efeito da droga com arremessos de pele e cutucas suaves com um bisturi estéril.
  5. No local da biópsia previamente marcada, faça uma incisão proximal-distal de 1 cm com um bisturi estéril que corta a pele e a fáscia, expondo a barriga muscular. Tome cuidado para cortar a fáscia completamente porque a agulha é cega e não vai passar pela fáscia.
  6. Empurre a agulha da biópsia 0,5-1,0 cm no músculo com uma orientação perpendicular à pele(Figura 2C, 2E).
    NOTA: O operador sentirá uma mudança na tensão necessária para conduzir a agulha através dos diferentes tipos de tecido. O tecido gorduroso é fácil, a fáscia é a mais resistente, e o músculo está no meio (mas pode ser variável, com base no participante).
  7. Oriente a agulha a uma posição de ângulo ~45° para a pele, ao longo do longo eixo da perna (Figura 2D, 2F). Empurre a agulha mais 1-2 cm no músculo até que a ponta da agulha esteja no local alvo dentro do músculo.
    NOTA: O médico deve utilizar as imagens de ultrassom salvas para explicar a variação individual das dimensões musculares. Como a incisão só é grande o suficiente para inserir a agulha, o médico conduz a agulha cegamente através da pele. Há uma "sensação" que o operador de biópsia ganha com experiência. Um novato deve aprender a habilidade com um operador de biópsia treinado (mais sobre isso na discussão).
  8. Conecte a seringa de 100 mL e a mangueira à agulha de biópsia(Figura 1G). Aplique sucção à agulha de Bergström puxando o êmbolo da seringa por cerca de 15-20 mL para produzir uma pressão negativa na agulha e sugando o tecido muscular para dentro da janela da agulha. Em seguida, extirpre o músculo por um rápido empurrão(es) do trocarte sobre a janela da agulha.
    NOTA: Antes e durante a sucção, às vezes é útil colocar pressão leve na pele imediatamente acima da janela da agulha para ajudar a empurrar o músculo para dentro da agulha.
  9. Retire suavemente a agulha da perna, girando lentamente. Só deve haver resistência à luz ao extrair a agulha. Se houver mais resistência, isso pode indicar um corte parcial da biópsia. Isso ocorre, retornar a necessidade ao local alvo e ressarcia a coleta de tecidos.
  10. Empurre o tecido excisado em direção à janela da agulha usando o ramrod interno.
  11. Remova cuidadosamente a amostra da agulha.
    NOTA: Submergir a agulha na solução de coleta (ver seção de preparação de fibras) muitas vezes desaloja a biópsia da agulha. Além disso, a seringa pode ser usada para conduzir o ar através da agulha e empurrar a amostra para fora. Essas técnicas removem a necessidade de tocar fisicamente a biópsia com pinças e reduz a possibilidade de dano. Se ferramentas, mãos (luvas ou não) ou soluções não estéreis entrarem em contato com a agulha, a agulha não pode ser usada para promover durante o procedimento. Assim, se for necessária uma segunda biópsia imediata, uma nova agulha estéril deve ser usada. Isso ocorre frequentemente, por isso é uma prática recomendada manter várias agulhas estéreis na reserva.
  12. Identifique o tecido como músculo e não adiposo ou tecido conjuntivo. O tecido muscular é facilmente identificado a partir de outro tecido devido à sua cor vermelha profunda(Figura 4A). Às vezes, o tecido coletado não é músculo, mas gordura ou tecido conjuntivo.
    1. Se uma quantidade adequada de tecido muscular for coletada, continue o protocolo. Se não houver músculo suficiente, tente a biópsia novamente.
    2. Se for necessária uma segunda biópsia, monitore cuidadosamente o participante, pois um segundo empurrão de agulha ocasionalmente deixa o participante mais desconfortável que o primeiro.
  13. Lave amostras musculares imediatamente em uma solução de coleta e prepare-se para experimentos de fibra única (veja o manuseio e armazenamento da biópsia muscular).
    1. Faça um assistente experiente verificar a qualidade da amostra (veja abaixo) e avaliar a necessidade de realizar uma segunda biópsia. Um assistente separado faz a biópsia para processamento, enquanto o resto da equipe continua com o participante.
  14. Feche o local da incisão.
    1. Feche a ferida de incisão com fita leukostrip estéril. Use uma ou mais peças para unir as bordas do local da incisão, colocando-as perpendiculares ao longo eixo da incisão, e, em seguida, coloque mais tiras em um padrão estrelado para proteger contra o carregamento multi-direcional.
      NOTA: O manuseio adequado desta etapa reduzirá as cicatrizes. Suturar a ferida pode ser feito, mas não é necessário. Outras opções incluem cola de ferida.
    2. Coloque o curativo estéril da ferida (por exemplo, Leucomed T plus) sobre o local de incisão para proteger contra infecções.
    3. Enrole a perna com ataduras elásticas coesas (por exemplo, Unihaft) para limitar o sangramento inicial e proteger contra impacto mecânico externo.
    4. Enrole a perna com ataduras de compressão acrílica para evitar sangramento e proteger as ataduras mais profundas de ficarem soltas ou destruídas.

4. Cuidados pós-biópsia

  1. Peça ao participante para andar imediatamente após o procedimento. Haverá dor localizada. Instrua o participante a caminhar o mais normal possível.
  2. Instrua o participante a não remover as ataduras ou deixar a água absorver as ataduras. Eles devem ser mantidos por pelo menos: um dia para o curativo acrítmico, três dias para o curativo elástico coeso, e sete dias para o curativo da ferida. Informe o participante que eles podem ser rebandeado se necessário.
    1. Adapte o cuidado pós-biópsia de um participante às necessidades do indivíduo. Tenha um assistente ou médico treinado para avaliar o participante e fazer um plano de cuidados pós-biópsia adequado. Para este procedimento, sugerimos que qualquer outro teste neuromuscular in vivo do TA seja separado por pelo menos uma semana da biópsia.

5. Manipulação e armazenamento de biópsia muscular

  1. Após a extração do tecido, coloque imediatamente o tecido em um frasco de 5 mL contendo solução de coleta de rigor (em mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), comprimido inibidor de protease (1), pH 7.0) e levemente agitar por 4-6 min para lavar o sangue.
  2. Troque a solução Rigor por rigor fresco, agite levemente por 4-6 min e, em seguida, armazene a 4 °C por 4-6 h para permitir a troca de solução de armazenamento inibidor de protease e sangue.
  3. Solução de Rigor de Troca para o rigor noturno (em mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), comprimido inibidor de protease (1), 50:50 glicerol, pH 7.0) e armazenar a 4 °C para 12-18 h.
  4. Troque o rigor durante a noite por 50:50 rigor de coleta:glicerol e armazenado a -20 °C por até 3 meses, ou um ano em um congelador de -80 °C.
    NOTA: Este processo permeabiliza a membrana de fibra que permite a adição manual de cálcio dentro e fora da célula. Esse processo leva tempo e pode ser diferente entre diferentes músculos e espécies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Todo o compromisso para um participante foi de cerca de uma hora (consulta de 10 minutos, ultrassom de 10 min, 20 min de preparação para cirurgia e administração anestésico, 10 min de cirurgia e recuperação de 10 min). Muitas vezes, os participantes ativavam inconscientemente seu TA e precisavam de lembretes consistentes para manter o músculo o mais relaxado possível. Quando a agulha da biópsia estava dentro do músculo, os participantes geralmente relatava uma sensação única de "pressão" na área ao redor da agulha de biópsia, com períodos ocasionais de desconforto moderado a intenso. Uma vez, os dedos dos dedos do participante ligeiramente apertados durante o procedimento, mas imediatamente parou depois que a agulha foi removida. Os tamanhos da biópsia eram geralmente ~50-100 mgs (massa molhada). As reações dos participantes ao procedimento eram muitas vezes imprevisíveis. Às vezes, o participante esperava não ser afetado durante o procedimento, mas depois apresentava sinais de desmaio, enquanto outros estavam nervosos, mas completamente inquietos durante o procedimento. Assim, descobrimos que era uma boa prática manter o participante ocupado com uma conversa ou deixá-lo usar seu celular, de modo que sua atenção total não estava focada no procedimento em andamento. O assistente que conversou com o participante também os monitorou em busca de sinais de angústia, dor ou desmaio. Às vezes, uma biópsia continha apenas adiposo ou tecido conjuntivo (identificado por uma cor branca-pálida do tecido, Figura 4A). Nesses casos, uma segunda biópsia foi imediatamente feita (após a aprovação do participante). Normalmente, uma biópsia bem sucedida produzirá >80% tecido muscular(Figura 4A).

No pós-operatório, a maioria dos participantes sentiu desconforto após o procedimento que durou de 3 a 5 dias. Os participantes relataram que a dor do TA era semelhante à esperada após um dia de caminhadas íngremes. Nenhuma pressão mecânica deve ser colocada no local da incisão por pelo menos 5 dias, ou pode reabrir. Os participantes geralmente eram deixados com uma pequena cicatriz, mas não observamos alterações levantadas ou anormais na pele. Além disso, nenhum participante desenvolveu infecções.

As biópsias foram permeabilizadas (ou seja, esfoladas) em uma solução de glicerol (mistura 1:1 de glicerol: solução de rigor) por 6 semanas e depois preparadas para testes mecânicos no dia dos experimentos. A permeabilização do glicerol das fibras permite a difusão da solução de banho nas fibras, o que dá ao pesquisador o controle de ativação e também fornece uma avenida para submeter o músculo a medicamentos ou outros produtos químicos. Além disso, o glicerol funciona como um agente anti-congelamento, permitindo que o músculo seja colocado em temperaturas frias para armazenamento a longo prazo, com danos limitados. No entanto, algum tempo é necessário para permitir que o glicerol penetre as amostras, e por isso inicialmente armazenar amostras de biópsia durante a noite a 4 °C (idealmente em uma placa de shake) é prudente. Os músculos só podem ser armazenados por muito tempo antes de sua função ser comprometida. A orientação geral sobre o assunto é que os músculos manterão sua função dentro da solução de glicerol por pelo menos 3 meses em um congelador de -20 °C, ou um ano em um congelador de -80 °C.

Amostras musculares foram visualizadas sob um microscópio de dissecção. Algumas peças musculares foram pequenas ou danificadas(Figura 4B) e foram removidas. Em seguida, foram avaliados grupos de fibras para qualquer dano estrutural (sarcolemma de fibra visualmente quebrada ou esmagada, Figura 4C). A partir desses feixes, feixes menores de fibras de 3-10 fibras foram dissecados e cuidadosamente colocados na câmara experimental da plataforma de teste mecânico(Figura 4D). Os comprimentos de fibra estruturalmente utilizáveis eram tipicamente de 3-5 mm de comprimento. A agulha bergström tinha uma janela de coleta de 7 mm, de modo que a biópsia só poderia produzir máximamente ~7 mm de fibras longas. Assim, as fibras estruturalmente utilizados que coletamos eram quase o maior tempo possível. Normalmente, preparamos 5-10 feixes de fibras por 50 mg de tecido (coletado). Os detalhes completos desses procedimentos podem ser encontrados em outros lugares14,15,25. Para demonstrar a durabilidade das fibras, mostramos dados representativos de um simples protocolo mecânico utilizando feixes de fibra TA glicados(Figura 5). 40 feixes de fibras das biópsias de 10 participantes foram ativados na solução de ativação26 (alto [Ca2+], pCa < 4,2) a 2,7 μm de comprimento sarcomere por 60 segundos e o estresse ativo de estado estável foi medido como 100,71 ± 11 mN mm-2 (média ± SEM).

Figure 1
Figura 1: A agulha bergström. A agulha bergström utilizada neste estudo consiste na própria agulha(A-F),mangueira de sucção(G)e seringa(F). A agulha bergström consiste em uma agulha externa (A) que tem uma janela próxima à ponta da agulha, um trocante interno oco menor(B)que se move para cima e para baixo da agulha e corta o músculo ao passar sobre a janela da agulha, e uma vara (C) que se move para cima e para baixo do trochanter para ajudar a remover o músculo da agulha. Estas peças são separadas por uma arruela (D)que torna a agulha hermética, e um espaçador (E) entre a haste e o trocarte protege contra esmagamento da biópsia muscular. Finalmente, um adaptador de mangueira de sucção é anexado. Para puxar o músculo para dentro da janela da agulha, uma mangueira de sucção(G)é presa ao adaptador da agulha e à seringa. Isso suga o ar da agulha e puxa o músculo para dentro da janela da agulha através de pressão negativa, permitindo a coleta de amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem de ultrassom e colocação de agulha. O TA é composto por compartimentos superficiais e profundos que são definidos por aponeuses. O TA é imageado com a sonda de ultrassom orientada nas perspectivas distal-proximal (A) e medial-lateral(B)para que a forma 3D do TA possa ser reconhecida. A profundidade ideal da agulha para coleta está entre as linhas horizontais tracejadas. Uma representação de desenho animado da inserção da agulha é mostrada nos painéis C e D. Após a incisão, a agulha é posicionada pela primeira vez perpendicular ao músculo e empurrada para dentro do músculo até que a janela da agulha esteja no músculo(C). A agulha é então reorientada para um ângulo ~45° ao longo do eixo longo da perna, e empurrada para dentro do músculo ainda mais, prestando atenção para que a agulha não penetre na aponeurose profunda(D). Imagens ao vivo(E, F) durante o procedimento são dadas em referência ao desenho animado (C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Colocação do participante. O participante coloca uma posição supina na mesa de operação. A cabeça pode ser elevada para o conforto. O pé direito é colocado em um dispositivo personalizado que mantém o pé ligeiramente dorsiflexado, reduzindo a tensão muscular. Uma cortina é colocada na frente do participante para que eles não possam assistir ao procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagens representativas do tecido muscular. (A) Imediatamente após a biópsia, a amostra muscular será um vermelho mais escuro do que outros tecidos, incluindo tecido adiposo e tecido conjuntivo (rotulado no painel). (B) Dissecção de amostras com feixes de fibras danificados/curtos (superiores) e viáveis (abaixo). (C) Ampliação de um agrupamento viável de fibras para inspecionar a superfície em busca de sinais de dano. (D) Um feixe de 6 fibras foi dissecado longe deste feixe de fibras (amarrado nas extremidades com sutura 6-0 para fácil movimento e ligado ao aparelho mecânico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Saídas de força representativas de uma preparação de feixe de fibras. Para demonstrar a durabilidade das fibras, mostramos dados representativos de estresse de um simples protocolo mecânico utilizando feixe de fibras TA glicadas (3 fibras). No total, 40 feixes de fibras das biópsias de 10 participantes foram estendidos de folga para 2,7 μm de comprimento sarcomere e mantidos para permitir o relaxamento do estresse. Em seguida, as fibras foram ativadas na solução de ativação26 (área sombreada; alta [Ca2+], pCa < 4,2) a 2,7 μm de comprimento sarcomere por 60 segundos e o estresse ativo de estado estável foi medido em 100,71 ± 11 mN mm-2 (média ± SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neste relatório, descrevemos uma técnica para a biópsia de tecido muscular estruturalmente intacto da TA. Verificou-se que este procedimento produz um conteúdo aceitável de fibras musculares utilizáveis (preparações de 5-10 fibras por 50 mg de tecido coletado) para testes mecânicos. Além disso, tínhamos tecido suficiente para acompanhamento de experimentos mecânicos, genéticos e proteômicos.

Existem vários métodos tipicamente utilizados para a coleta de biópsias musculares3,4,6,27,28. A chamada biópsia aberta20 produz fibras da mais alta qualidade porque um cirurgião expõe totalmente o músculo e disseca a amostra. É claro que a cirurgia aberta é um procedimento bastante invasivo e não é um procedimento adequado para submeter participantes saudáveis, independentemente da questão da pesquisa, devido aos potenciais riscos associados a cirurgias abertas. O método de biópsia menos invasivo é a biópsia da agulha fina29,30, que usa uma agulha relativamente menor para coletar tecido. As biópsias finas da agulha são suficientes para realizar experimentos nos componentes genéticos/químicos/proteicos das fibras30,31, mas muitas vezes a qualidade das fibras é muito ruim, o que torna os testes mecânicos difíceis ou impossíveis. A técnica da agulha bergström é um bom compromisso entre os dois procedimentos explicados acima porque a cirurgia é menos invasiva do que a biópsia aberta, mas ainda coleta amostras musculares maiores e (potencialmente) mais estruturalmente intactas do que biópsias de agulha fina. Relatórios anteriores do procedimento da agulha bergström3,5 são ótimos recursos para quem aprende a técnica, mas apenas apresentam protocolos para a vasto lateralis. Nosso relatório demonstra a técnica para o TA que se concentra na coleta de altos rendimentos de fibras estruturalmente intactas para testes mecânicos.

Até onde sabemos, não há publicações detalhadas sobre a coleta de biópsias de TA. No entanto, a prática padrão é colocar o participante supino e fazê-los relaxar a perna o máximo possível. O pé relaxado nesta posição é naturalmente plantarflexed, o que consequentemente alonga o TA e o coloca em tensão. Descobrimos que qualquer tensão muscular torna mais difícil conduzir os músculos para a agulha da biópsia, mesmo com pressão negativa, e por isso a tensão deve ser minimizada o máximo possível. Para isso, a modificação simples, mas importante aqui, foi usar uma placa de pé personalizada que mantinha o tornozelo em uma posição ligeiramente dorsiflexed (0 - 5° de neutro), mantendo o TA folgado e melhorando a coleta. Os médicos devem ter cuidado para não sobre-dorsiflex o tornozelo, pois o TA será incontrolavelmente ativado, aumentando a tensão, o que é naturalmente contrário ao procedimento em primeiro lugar. O participante normalmente pode sentir essa ativação muscular, por isso a comunicação é fundamental. A partir dos protocolos, o TA produz apenas ~25% de tecido em comparação com o vasto lateralis mais usado, ~100 mgs e ~400 mgs, respectivamente. Assim, é importante maximizar o tamanho da coleta de tecidos, considerando também se a amostra de tecido TA será grande o suficiente para o projeto de pesquisa desejado. Descobrimos que tomar uma segunda amostra imediatamente após a primeira não causa complicações extras ou tempo de cura para os participantes.

Embora o protocolo dê algumas orientações para outras biópsias musculares, a seleção muscular ditará o procedimento adequado. Assim, sugerimos fortemente a outros pesquisadores e médicos que publiquem, na íntegra, seus métodos de biópsia. Pela experiência, identificamos alguns fatores importantes para a seleção muscular, fora da questão da pesquisa. Primeiro, sugerimos considerar músculos que são superficiais à pele e têm artérias/nervos principais que são profundos ou facilmente evitáveis. Em segundo lugar, como os participantes estão acordados durante o procedimento, é importante considerar se o procedimento de biópsia será muito desconfortável para o paciente, seja por causa do posicionamento inicial do paciente, seja por causa da pressão da agulha biópsia, que também empurra os músculos mais profundos de forma desconfortável. Tivemos sucesso com a vasto lateralis e peitoralis. Outras opções potenciais são o trapézio, latissimus dorsi e gastrocnemius (embora altamente vascularizados e propensos a sangramento). Os músculos do tendão são possíveis, mas desconfortáveis para o paciente, e difíceis porque se movem lateralmente ao coletar a biópsia.

Embora as agulhas bergström possam ser compradas de manufaturas, alguns laboratórios fazem suas próprias. Pequenos, mas inteligentes, ajustes no design podem aumentar o rendimento de fibras musculares longas e não danificadas. Por exemplo, a janela de coleta da agulha usada aqui era de 7 mm x 5 mm (comprimento x largura). Isso é apropriado para capturar um cubo de músculo. No entanto, se o objetivo é coletar fibras longas e não danificadas (do mesmo volume), então o comprimento pode ser aumentado, e a largura diminuiu (ou seja, 10 mm x 3,5 mm). Se a agulha for orientada ao longo da direção do fascicle, então é provável que esta agulha colecione seções de fibras mais longas.

Biópsias musculares são frequentemente coletadas com segurança sem a orientação de uma imagem de ultrassom, especialmente para músculos maiores como a grande lateral. Nesta situação, um médico devidamente experiente pode facilmente palpar o músculo para encontrar o melhor local de incisão. No entanto, quando o médico é menos experiente com o músculo alvo, ou o cuidado extra é justificado para evitar nervos graves ou vasos sanguíneos, o ultrassom é uma ferramenta grande e simplesmente aplicada. Finalmente, o monitoramento pós-operatório da área de biópsia pode ser realizado rapidamente com o auxílio de um ultrassom.

Biópsias pediátricas são certamente possíveis e comumente realizadas32,,33,34. No entanto, normalmente há várias alterações feitas no procedimento. Muitas vezes são necessárias uma agulha de bitola menor e sedação consciente, e o procedimento ocorre em ambiente hospitalar. Em geral, a experiência pode ser traumática para uma criança e grupos de pesquisa que desejam incluir participantes pediátricos saudáveis devem pesar cuidadosamente isso contra os potenciais méritos do estudo.

Pacotes de fibras ou material nãouxido podem ser transferidos para outros experimentos antes ou depois da mecânica da fibra. Por exemplo, técnicas que avaliam o teor de proteína sarcomerica ou classificam o tipo isoforme podem ser conduzidas35. No entanto, para limitar a degradação da proteína e melhorar o sucesso da análise, o tecido deve ser congelado em nitrogênio líquido após a extração original, imediatamente após avaliação mecânica, ou processado imediatamente para análise de proteínas. As fibras também podem ser preparadas para a imunohistoquímica ou outras técnicas de imagem36 que permitem a avaliação da posição proteica dentro da fibra. Neste caso, as fibras podem ser colocadas em uma solução fixativa (por exemplo, 4% paraformaldeído/0,25% glutaraldeído em tampão fisiológico no pH 7; sem glutaraldeído para imunohistoquímica) enquanto ainda está no aparelho de teste mecânico, preservando as estruturas sarcomericas em um comprimento sarcomere desejado. Se possível, um pequeno pedaço da biópsia original pode ser colhido, lavado vigorosamente em solução de coleta por 10 minutos e, em seguida, colocado em solução fixativa. Muitos grupos preferem congelar imediatamente amostras recém-extirpadas em isopentane, o que limita a formação de cristais de gelo prejudiciais, e melhora a qualidade da imagem para avaliações visuais. Este é, de fato, o padrão-ouro para congelamento de flash; no entanto, descobrimos que o dano do cristal de gelo do congelamento de nitrogênio é focado apenas em estruturas extra-myofibril. Temos integridade estrutural satisfatória de componentes sarcomericos em amostras também congeladas em nitrogênio líquido, e por isso pensamos que o nitrogênio é uma possibilidade, especialmente se estiver mais facilmente disponível, ou a equipe cirúrgica/autoridade química local não está disposta a usar isoponentane. Um problema importante e muitas vezes não relatado na preparação de amostras para visualização é que os sarcomeres são muitas vezes contratados/curtos, com a região de banda I do sarcomere curto ou inobservável. Para superar isso, o pesquisador deve esticar manualmente as amostras de fibra (pelo aparelho de teste ou à mão usando pinças finas) antes de fixar. Como regra geral, estendemos até ~3,2 μm de comprimento sarcomere (medido via difração a laser), ou alongamos para ~150% de comprimento de folga, em uma solução de relaxamento fisiológico de baixo cálcio. Finalmente, se subamostras forem desejadas para análise de expressão de RNA, o método de congelamento de flash não afeta os resultados, mas as amostras devem ser congeladas imediatamente após a extração original e colocadas em um congelador de -80 °C, pois o RNA é muito instável. Existem algumas soluções de armazenamento de proteção de RNA no mercado, mas encontramos resultados mistos com seu uso, e apenas amostras frescas de flash freeze.

Para maximizar a quantidade de informações coletadas durante um ensaio, a coleta simultânea de outros dados pode ser concluída durante a realização de testes mecânicos. Por exemplo, o estudo de estruturas sarcomericas pode ser realizado durante testes mecânicos usando imagens de difração de raios-X de baixo ângulo, como é feito em outros animais37,38. Para experimentos genéticos, o músculo excisado deve ser imediatamente processado para esse fim ou congelado por flash congelado porque o DNA/RNA são relativamente menos estáveis do que as proteínas.

Algumas limitações já estão descritas acima. Aqui discutimos o procedimento em si. Uma grande limitação para a maioria dos grupos é ter um membro da equipe que é devidamente treinado na coleta de biópsia. Independentemente da profissão da pessoa (médico, assistente médico, técnico ou não), esse procedimento é difícil porque o investigador conduz a agulha cegamente e deve contar com "sentir"3,28 para localizar a janela da agulha com precisão. Erros não são toleráveis porque os participantes humanos para biópsias são escassos, uma biópsia é preferível a muitos, e erros podem levar a danos vasculares ou nervosos. Portanto, qualquer possibilidade de treinamento deve ser concluída antes da realização de uma biópsia humana. Por exemplo, para ganhar uma "sensação" para conduzir a agulha, a carne de porco com a pele ainda presa pode ser comprada na maioria dos supermercados e usada como proxy para pele e músculo humano. Outra experiência valiosa é sombrear um grupo de pesquisa treinado.

Avaliou-se a dor/desconforto dos participantes de forma mais qualitativa, contando com a experiência do médico e conversas com o participante para avaliar a dor percebida. No entanto, a avaliação da dor e do desconforto pós-biópsia pode ser mais quantificada e comparável entre indivíduos e estudos através do uso de inquéritos validados de dor/desconforto. Esses pontos têm surpreendentemente pouco tratamento na literatura. No entanto, um estudo recente apresentou uma maneira de quantificar a dor/desconforto dos participantes antes, durante e depois das biópsias, utilizando pesquisas bem estabelecidas de dor39. Notamos que este artigo usou a vasto lateralis como músculo alvo e, portanto, são necessários estudos de acompanhamento para comparar avaliações de dor entre músculos.

Independentemente do método de extração, a técnica bergström não pode extirpara o comprimento total da fibra no músculo porque as fibras são muito longas (~6-8 cm em TA40, ~6,5-8 cm na lateral vastus40). Portanto, é inevitável que para um longo pedaço de fibra coletada, as extremidades sejam destruídas pela técnica de biópsia. Muitas vezes, a porção central utilizável de uma fibra é pequena e por isso é difícil testar mecanicamente. Embora a técnica forneça regiões centrais razoavelmente longas (3-5 mm), o pesquisador deve verificar cuidadosamente a qualidade dos feixes de fibras durante a dissecção, pois o uso de fibras danificadas alterará as saídas passivas ou de força ativa. A observação visual de biópsias bem sucedidas mostrará uma porção de fibras que não estão danificadas do procedimento de biópsia. Quando vista a partir de um microscópio tradicional de luz de dissecção, a superfície das fibras ficará lisa, sem furos ou lágrimas(Figura 4). Além disso, as fibras devem parecer cilíndricas e não ter áreas achatadas. Embora não visível, o próprio músculo se degradará ao longo do tempo por causa de proteases que ocorrem naturalmente que começam a quebrar as proteínas musculares quase imediatamente após a extração. Assim, é fundamental adicionar inibidores de protease a todas as soluções utilizadas com as fibras. Além disso, também sugerimos lavagens extras das biópsias para remover o máximo de sangue possível.

Mesmo com uma preparação cuidadosa, danos causados por fibras podem ocorrer e levar a ativações de fibras ruins. Há muitas razões para danos de fibras porque as fibras são muito sensíveis a quase todas as partes do procedimento. Por exemplo, durante a biópsia, se o trocarte não for afiado o suficiente, ele pode empurrar para o tecido muscular durante a extração em vez de cortá-lo, que pode esticar e destruir as fibras. A solução de coleta deve ser adequadamente preparada porque as fibras são sensíveis a alterações osmóticas, pH e temperatura. Ao manusear as fibras, deve-se ter muito cuidado para limitar completamente a pressão sobre as fibras. Em vez disso, a pinça deve ser usada para pegar a biópsia pelo seu tecido conjuntivo. Outra alternativa é usar uma sutura de seda tamanho 0-7 para embrulhar uma extremidade inutilizável da biópsia e, em seguida, agarrá-lo ao manusear. Por fim, o glicerol serve a dois papéis: o primeiro é evitar que o músculo congele enquanto está a -20 °C e o segundo é ser um detergente leve para a fibra. Ou seja, o glicerol permeabiliza a fibra para soluções externas, permitindo o afluxo de cálcio (através de uma solução de ativação). Para a maioria dos músculos, esse processo leva ~10 dias. No entanto, dependendo da quantidade de conteúdo de colágeno e tamanho da amostra, isso pode levar até 6 semanas. As fibras devem ser permeabilizadas para que qualquer ativação de cálcio ocorra durante experimentos mecânicos. As fibras são geralmente utilizáveis por pelo menos 3 meses. Para limitar o desperdício de fibras, sugere-se um tempo de espera de permeabilização mais longo (4-6 semanas) para as fibras musculares ta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Michaela Rau, Lea-Fedia Rissmann, Michael Marsh, Janina-Sophie Tennler, Kilian Kimmeskamp e Wolfgang Linke por ajudarem no projeto. O financiamento para este projeto foi fornecido pela Fundação MERCUR (ID: An-2016-0050) à DH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe B. Braun Melsungen AG
Carl-Braun-Straße 1
34212 Melsungen, Hessen
Germany
 		 4606027V Drug administration
5mm Berstöm needle homemade N/A Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 269700 elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11836145001 Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept PAUL HARTMANN AG
Paul-Hartmann-Straße 12
89522 Heidenheim
Germany		 9805630 Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 7238201 Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road,
Hull
Great Britain		 66002876 wound closure
Surgical disposable scalpels Aesculap AG
Am Aesculap-Platz
78532 Tuttlingen
Germany		 BA200 series Incision
Unihaft cohesive elastic bandage BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 4589600 cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin Milbe GmbH
Münchner Straße 15
06796 Brehna
Germany		 N/A Controlled substance anesthesia, vasoconstriction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franchi, M., et al. Architectural, functional and molecular responses to concentric and eccentric loading in human skeletal muscle. Acta Physiologica. 210 (3), 642-654 (2014).
  2. Duchene, G. B. A. De la paralysie musculaire pseudo-hypertrophique, ou paralysie myo-sclérosique / par le Dr Duchenne (de Boulogne). Archives of General Internal Medicine. 11 (30), (1868).
  3. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified Bergström technique. Journal of Visualized Experiments. (91), e51812 (2014).
  4. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine and Science in Sports and Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  5. Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35 (7), 609-616 (1975).
  6. Baczynska, A. M., et al. Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome. Journal of Visualized Experiments. (109), e53075 (2016).
  7. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  8. Buck, E., et al. High-resolution respirometry of fine-needle muscle biopsies in pre-manifest Huntington's disease expansion mutation carriers shows normal mitochondrial respiratory function. Plos One. 12 (4), 01175248 (2017).
  9. Murgia, M., et al. Single Muscle Fiber Proteomics Reveals Fiber-Type-Specific Features of Human Muscle Aging. Cell Reports. 19 (11), 2396-2409 (2017).
  10. Friedmann-Bette, B., et al. Effects of strength training with eccentric overload on muscle adaptation in male athletes. European Journal of Applied Physiology. 108 (4), 821-836 (2010).
  11. McPhee, J. S., et al. The contributions of fibre atrophy, fibre loss, in situ specific force and voluntary activation to weakness in sarcopenia. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (10), 1287-1294 (2018).
  12. Nocella, M., Cecchi, G., Bagni, M. A., Colombini, B. Force enhancement after stretch in mammalian muscle fiber: no evidence of cross-bridge involvement. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (12), 1123-1129 (2014).
  13. Patel, J. R., McDonald, K. S., Wolff, M. R., Moss, R. L. Ca2+ binding to troponin C in skinned skeletal muscle fibers assessed with caged Ca2+ and a Ca2+ fluorophore. Invariance of Ca2+ binding as a function of sarcomere length. The Journal of Biological Chemistry. 272 (9), 6018-6027 (1997).
  14. Hessel, A. L., Joumaa, V., Eck, S., Herzog, W., Nishikawa, K. C. Optimal length, calcium sensitivity and twitch characteristics of skeletal muscles from mdm mice with a deletion in N2A titin. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 12 (2019).
  15. Joumaa, V., Herzog, W. Calcium sensitivity of residual force enhancement in rabbit skinned fibers. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (4), 395-401 (2014).
  16. Joumaa, V., Rassier, D. E., Leonard, T. R., Herzog, W. The origin of passive force enhancement in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 294 (1), 74-78 (2008).
  17. Hilber, K., Galler, S. Mechanical properties and myosin heavy chain isoform composition of skinned skeletal muscle fibres from a human biopsy sample. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 434 (5), 551-558 (1997).
  18. Miller, M. S., et al. Chronic heart failure decreases cross-bridge kinetics in single skeletal muscle fibres from humans. The Journal of Physiology. 588, Pt 20 4039-4053 (2010).
  19. Pinnell, R. A. M., et al. Residual force enhancement and force depression in human single muscle fibres. Journal of Biomechanics. 91, 164-169 (2019).
  20. Einarsson, F., Runesson, E., Fridén, J. Passive mechanical features of single fibers from human muscle biopsies--effects of storage. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 3, 22 (2008).
  21. Flann, K. L., LaStayo, P. C., McClain, D. A., Hazel, M., Lindstedt, S. L. Muscle damage and muscle remodeling: no pain, no gain. The Journal of Experimental Biology. 214, Pt 4 674-679 (2011).
  22. Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention (KRINKO), Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM). Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten [Hygiene requirements for the reprocessing of medical devices]. Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz. 55 (10), 1244-1310 (2012).
  23. Koch-Institut, R. Ergänzung zur Empfehlung Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten. RKI-Bib1. , Robert Koch-Institut. (2018).
  24. Rutala, W. A., Weber, D. J. Disinfection and sterilization in healthcare facilities. Practical Healthcare Epidemiology. , 58-81 (2018).
  25. Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Sarcomere length-dependence of activity-dependent twitch potentiation in mouse skeletal muscle. BMC Physiology. 2, 19 (2002).
  26. Mounier, Y., Holy, X., Stevens, L. Compared properties of the contractile system of skinned slow and fast rat muscle fibres. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 415 (2), 136-141 (1989).
  27. Henriksson, K. G. Semi-open muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurologica Scandinavica. 59 (6), 317-323 (1979).
  28. Dietrichson, P., et al. Conchotome and needle percutaneous biopsy of skeletal muscle. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 50 (11), 1461-1467 (1987).
  29. Iachettini, S., et al. Tibialis anterior muscle needle biopsy and sensitive biomolecular methods: a useful tool in myotonic dystrophy type 1. European Journal of Histochemistry. 59 (4), 2562 (2015).
  30. Cotter, J. A., et al. Suction-modified needle biopsy technique for the human soleus muscle. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 84 (10), 1066-1073 (2013).
  31. Edwards, R. H., Round, J. M., Jones, D. A. Needle biopsy of skeletal muscle: a review of 10 years experience. Muscle & Nerve. 6 (9), 676-683 (1983).
  32. Gibreel, W. O., et al. Safety and yield of muscle biopsy in pediatric patients in the modern era. Journal of Pediatric Surgery. 49 (9), 1429-1432 (2014).
  33. Cuisset, J. M., et al. Muscle biopsy in children: Usefulness in 2012. Revue Neurologique. 169 (8-9), 632-639 (2013).
  34. Nilipor, Y., et al. Evaluation of one hundred pediatric muscle biopsies during a 2-year period in mofid children and toos hospitals. Iranian Journal of Child Neurology. 7 (2), 17-21 (2013).
  35. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  36. Wang, K., Wright, J. Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z line. The Journal of Cell Biology. 107 (6), 2199-2212 (1988).
  37. Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin head configurations in resting and contracting murine skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  38. Ma, W., Gong, H., Kiss, B., Lee, E. J., Granzier, H., Irving, T. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
  39. Bonafiglia, J. T., et al. A comparison of pain responses, hemodynamic reactivity and fibre type composition between Bergström and microbiopsy skeletal muscle biopsies. Current Research in Physiology. 3, 1-10 (2020).
  40. Wickiewicz, T. L., Roy, R. R., Powell, P. L., Edgerton, V. R. Muscle architecture of the human lower limb. Clinical Orthopaedics and Related Research. (179), 275-283 (1983).

Tags

Biologia Edição 163 Tibialis anterior biópsia muscular ultrassom mecânica de fibras humanas biomecânica técnica modificada de Bergström
Coleta de Biópsias Musculares Esqueléticas do Compartimento Superior do Musculus Tibialis Anterior para Avaliação Mecânica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hessel, A. L., Hahn, D., de… More

Hessel, A. L., Hahn, D., de Marées, M. Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation. J. Vis. Exp. (163), e61598, doi:10.3791/61598 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter