Summary
이 기술 보고서는 섬유 손상을 제한하는 근육 티비알리스 전방의 생검을 위한 수정된 Bergström 기술의 변형을 설명합니다.
Abstract
스켈레탈 섬유의 기계적 특성은 전반적인 근육 건강, 기능 및 성능의 중요한 지표입니다. 인간 골격 근 생검은 종종 이러한 노력에 대 한 수집. 그러나, 생검 절차의 상대적으로 몇몇 기술적인 설명은, 일반적으로 이용되는 근육 광자 측측의 외부에, 유효합니다. 생검 기술은 연구 하에 각 근육의 특성을 수용하기 위하여 수시로 조정됩니다, 몇몇 기술 보고는 더 중대한 지역 사회에 이 변경을 공유합니다. 따라서, 인간 참가자의 근육 조직은 종종 작업자가 바퀴를 재발견함에 따라 낭비됩니다. 다양한 근육에서 생검에 사용 가능한 물질을 확장하면 실패한 생검의 사고를 줄일 수 있습니다. 이 기술 보고서는 섬유 손상을 제한하고 기계적 평가에 적합한 섬유 길이를 제공하는 근육 티비알리스 전방에 변형된 Bergström 기술의 변형을 설명합니다. 수술은 한 시간 안에 완료될 수 있는 외래 환자 절차입니다. 이 절차의 회복 기간은 가벼운 활동 (즉, 걷기), 정상적인 신체 활동의 재개를위한 최대 3 일, 상처 치료를위한 약 1 주일 입니다. 추출된 조직은 기계적 힘 실험에 사용될 수 있으며 여기에서 우리는 대표적인 활성화 데이터를 제시합니다. 이 프로토콜은 대부분의 수집 목적에 적합하며, 잠재적으로 다른 골격 근육에 적응할 수 있으며, 수집 바늘을 수정하여 개선될 수 있다.
Introduction
임상 또는 연구 목적을 위한 인간 근육 생리학의 연구 결과는 수시로 근육 생검을 요구합니다. 예를 들어, 인간의 근육 생리학 및 생체 역학의 주요 과제는 운동에 근육 성능의 다양한 적응을 구별하고 이해하는 것입니다. 성능 적응은 단지 구조적 적응을 포함하지 않습니다 (예를 들어, 수축 단백질의 변화, 근육 아키텍처) 뿐만 아니라 신경 적응을 포함1,이는 매우 어렵다, 불가능하지는 않지만, 그 밖에 그대로 검사 할 때 별도로 평가하는 것은 인간의 근육에 그대로 테스트. 섬유 수준 실험은 이러한 고차 성분을 제거하고 근육 수축의 보다 직접적인 평가를 허용하고 생검 기술을 통해 수집 될 수있다. 근육 생검은 적어도 18682부터 수집되었습니다. 오늘날, 근육 생검을 수집하는 주된 기술은 변형된 Bergström 기술3,,4,,5이며,Weil-Blakesley 컨쵸톰6 또는 소위 미세 바늘7,,8의사용을 포함하는 다른 기술을 사용할 수 있지만. 이러한 모든 기술은 근육에 전달하고 조직의 조각을 잘라 하도록 설계 된 특수 바늘 같은 악기를 사용 하 여. 구체적으로, 변형된 Bergström 기술은 큰 변형 바늘(5mm 바늘 크기)을 이쪽; 그림 1) 바늘 끝과 바늘 을 위아래로 이동하는 작은 내부 트로카가 바늘 창을 통과 할 때 근육을 절단. 이 할로윈 트로카 내에서 트로카의 샤프트를 위아래로 이동하고 바늘 창을 향해 생검을 밀어 난폭이있다. 바늘 창으로 근육을 당기려면 흡입 호스가 부착되어 바늘에서 공기를 빨아 내고 부정적인 압력을 통해 바늘 창으로 근육을 당깁니다.
근육 생검은 종종 단백질 함량, 유전자 발현, 또는 질병에 의한 형태학의 변화를 연구하기 위해 획득되거나 운동 프로그램1,,9,,10,,11에대한 반응에서. 근육 생검에 대한 또 다른 중요한 용도는 섬유 수축력, 근육 섬유 강성 및 역사 의존근육 특성12,,13,,14,,15,,16등의 기계적 실험이다. 단일 섬유 또는 섬유 번들 역학은 길이 모터와 힘 트랜스듀서 사이에 섬유를 부착하여 섬유 길이를 동시에 측정하는 특수 리그에 부착하여 측정합니다. 섬유를 과미화(예: 스키닝) 섬유에 의해, 사르콜렘막은 목욕 용액의 화학 물질에 투과성이 되어 다양한 칼슘 농도로 활성화 제어를 가능하게 합니다. 또한, 화학물질/제약/기타 단백질에 대한 수축 특성의 효과는 문제의 시약을 목욕 용액에 추가하여 쉽게 평가될 수 있다. 그러나, 이 기술은 다른 동물 모형에서 높게 사용되는 동안, 눈에 띄게 적은 연구 결과는 인간 근육 생검에서 피부 섬유에 기계시험을실시17,,18,,19. 한 가지 이유는 생검 도구와 프로토콜조직 추출 중에 지속되는 구조적 손상 수준에 대한 관심없이 가능한 한 많은 근육 조직을 제거하도록 설계되었기 때문입니다. 실제로, 최근 생검 프로토콜은 생검 바늘을 근육으로 몰고 근육3의2-4 덩어리를 수집할 것을 제안합니다. 과정 자체는 DNA 또는 단백질 물질에 거의 손상을 주지 않지만 종종 근육 섬유의 활성화가 불안정하거나 불가능해지는 방식으로 섬유및 육종 구조를 파괴합니다. 더욱이, 생검 내의 섬유의 상대적인 길이는 일반적으로 짧고 (&2 mm) 기계적 테스트를 위해 쉽게 취급되지 않습니다. 기계적 테스트를 위해 이상적인 섬유는 길고(3-5mm) 길이이며 구조적으로 손상되지 않습니다.
보다 진보된 조직 추출 기술을 사용하여 섬유 손상을 제한할 수 있습니다. 예를 들어, 한그룹(20)은 근육이 완전히 노출되고 외과 의사가 근육 구조를 시각화하고 상대적으로 크고 구조적으로 손상되지 않은 근육 조직 샘플(15mm x 5mm x 5mm)을 신중하게 해부할 수 있었던 팔뚝의 이전에 계획된 "열린 수술"(예: 뼈 골절 수리)을 활용했습니다. 이 "오픈 생검"기술은 참가자가 이전에 계획된 절차를 겪고 있을 때 선호되며, 특히 수술이 일어나지 않는 건강한 성인을 위해 잠재적 인 참가자의 풀을 제한합니다. 따라서, 연구 목적으로 수행된 많은 생검은 외래 절차로 수행되고 절개 부위는 감염 위험, 흉터 및 치유 시간을 제한하기 위해 가능한 한 작게 유지됩니다. 따라서 대부분의 생검은 맹목적으로 수집됩니다 (즉, 작업자는 근막을 통과하여 근육으로 통과할 때 수집 바늘을 볼 수 없습니다). 이것은 생검의 질이 거의 전적으로 운영자의 기술과 경험을 기반으로한다는 것을 의미합니다. 모든 근육은 신경과 혈관을 위반하는 위험, 이상적인 수집 깊이 및 위치 선택, 가능한 한 여유 근육을 유지하기 위해 적절한 신체 위치를 결정할 때 조직을 수집 할 때 자체 어려움을 가지고 있습니다. 불행 하 게도, 근육 특정 기술 집합의 대부분은 기록 되지 않습니다 그리고 그래서 각 의사는 해야 "바퀴를 재발견" 그들에 게 새로운 근육에 생검을 수행 할 때. 경험의 이 부족은 일반적으로 의사가 그 근육에 생검을 위한 모범 사례를 식별할 때까지 낮은 질을 가진 몇몇 컬렉션으로 이끌어 냅니다. 초보자 의사는 종종 경험이 풍부한 동료와의 대화를 통해 기술을 배우지만, 특히 생검 수집에 전통적으로 사용되지 않는 근육에 대해 상대적으로 적은 유익하고 동료 검토 된 텍스트가 이 문제에 존재합니다. 위의 정보를 고려하면 생검을 위해 인간 자원 봉사자를 모집하는 어려움과 함께 모든 참가자가 성공 할 가능성을 극대화하는 더 많은 교육 정보가 필요하다는 것이 분명합니다.
따라서, 이 논문의 목적은 기계적 검사를 위한 길고 손상되지 않은 섬유 단편을 가진 근육 생검의 성공적인 수집을 위한 프로토콜을 제공하는 근육 생검 기술을 제시하는 것이었습니다. 인간 적인 근육 생검은 일반적으로 에 수행되고, 생검 훈련 자료의 대부분은, 근육 광상측측기. 피부에 비해 상대적으로 큰 근육 크기와 피상적 위치는 환자 불편과 신체적 외상1,,21을최소화하면서 적절한 근육 조직의 수집을 허용합니다. 그러나, 세로 훈련 연구에 대 한 광대 한 측면을 사용 하 여 몇 가지 제한이 있다. 예를 들어, 교육 프로그램을 포함하는 실험 프로토콜 동안, 참가자는 종종 2-6 개월에 걸쳐 기간 동안 연구 이외의 추가 교육을 자제해야합니다. 운동 선수의 경우, 광대 한 측면은 일반적으로 일반적인 운동 (예 : 스쿼트, 점프) 동안 훈련되거나 일반적으로 스포츠 (예 : 달리기, 사이클링)에 사용됩니다. 연구의 목표에서 이러한 별도 훈련 경험은 근육 역학을 변경 하는 근육 적응을 일으킬 수 있습니다., 건축, 그리고 근육 속성에 연구의 실험 프로토콜의 진정한 효과 알고 불가능 하는 방식으로 생리학. 연구의 이러한 유형에 대 한, 그것은 종종 훈련 연대의 초점이 아닌 대상 근육을 선택 하는 것이 좋습니다. 근육 티비알리스 전방 (TA)은 위의 요구 사항을 충족시키는 이상적인 표적 근육입니다. 또한, 훈련 내정간섭은 동력계의 사용과 같은 제어 가능한 접근법을 사용하여 TA를 대상으로 할 수 있다. TA 근육 생검에 관련 된 거의 훈련 자료가 있다. 따라서, 우리는 TA에서 상대적으로 손상되지 않은 근육 생검을 수집하기 위해 수정 된 프로토콜을 개발했다.
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Protocol
참고: 아래, 우리는 별도의 지속적인 연구에 등록 된 자원 봉사자의 TA에서 기계적으로 손상되지 않은 섬유를 수확하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 광대스 측삭에서 수정 된 Bergström 기술을 설명 한 Shanely 외3에의해 설명 된 것과 유사합니다. 여기에 제시된 정보는 연구 그룹에 의해 개선되었지만 모든 실험실 그룹 이나 조직 설정에 적합하지 않을 수 있습니다. 우리는 단지 지침을 주고, 강하게 어떤 인체 실험을 시도하기 전에 생검 수집에 새로운 실험실이 경험이 풍부한 실험실 단을 상담한다는 것을 건의합니다.
이 논문에서 수행 된 모든 연구는 루르 대학 보훔에서 스포츠 과학 학부의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 참가자들은 연구에 참여하기 전에 서면으로 통보된 무료 동의를 제공했습니다.
1. 실험 준비
- 참가자 상담 중에 참가자의 상세한 병력을 복용하는 동안 제외 기준을 평가합니다(아래 참조).
- 생검으로 이어지는 6주 동안 표적 근육에 부상을 입은 참가자를 제외합니다. 참가자가 일반적으로 건강, 아니 근육 또는 응고 장애를 인식, 혈액 숱이 발생 하는 약물에 현재 되지 않습니다 (예를 들어, 아스피린).
참고: 여기에서, 우리는 적당히 활동적인 참가자를 선택하고 생검 의 앞에 적어도 3 일 집중하거나 익숙하지 않은 다리 운동을 자제하도록 지시했습니다. 그러나 다른 연구 질문에서는 이러한 기준이 변경될 수 있습니다.
- 생검으로 이어지는 6주 동안 표적 근육에 부상을 입은 참가자를 제외합니다. 참가자가 일반적으로 건강, 아니 근육 또는 응고 장애를 인식, 혈액 숱이 발생 하는 약물에 현재 되지 않습니다 (예를 들어, 아스피린).
- 독일 법과 일반적인 관행에 의해 규제되고 팀 의사(22,,23)에의해 감독으로 살균 및 무균 기술을 준수합니다. 이 절차는 종종 "침대 옆"절차 또는 외래 수술 스위트 로 수행 될 수 있습니다. 현지 규제 기관에 문의하여 지침을 확인하십시오.
- 생검 팀을 구성합니다. 우리는 생검 팀이 4명의 사람들을 포함하는 것이 좋습니다. 의사 (또는 생검 수집에서 훈련 된 개인), 의사와 함께 일하는 한 의료 조수, 참가자를 모니터링하고 상호 작용하는 한 명의 조수, 추출 후 즉시 근육 생검을 처리하는 한 조수. 이 숫자로, 절차 도중 응급 사태가 생기는 경우에 빠른 참을성 있는 배려는 관리될 수 있습니다. 절차에 익숙해지면, 팀은 환자와 의료 조수, 함께 환자 치료와 조직 처리를 동시에 취할 두 사람으로 만들 수 있습니다.
- 참가자가 프로젝트 잠재 고객/의사와 만나 사용자 동의 양식을 검토하고 토론하고 서명하도록 합니다. 상세한 병력(알레르기, 부상 또는 수술후 하반신 및 TA)을 취하고 배제 기준을 충족하는 경우 참가자를 제외하십시오. 복구 및 절개 위생에 대해 철저히 논의합니다.
- 참가자에게 그들이 아멀리지만 절차 직후에 걸을 수 있다고 설명한다. 슬로프 나 계단을 걷는 것은 종종 처음 48 시간 동안 불편하며, 전체 활동은 일반적으로 72 시간 후에 돌아갑니다. 마지막으로, 감염과 기계적 찰과상을 제한하기 위해 절개 부위는 적어도 1 주일 동안 붕대를 감고 깨끗하게 유지되어야한다고 설명한다.
2. B 모드 초음파로 전방 티비아를 시각화
- 참가자에게 편안한 척추 자세로 누워 서 가능한 한 다리 근육을 이완하도록 지시하십시오. 사용자 정의 된 장치 (아래 참조)를 사용하거나 비서가 생검 중에 수행 될 것을 모방하기 위해 약간 dorsiflexed 위치에 발목을 잡고있다.
참고: 참가자는 절차 중에 근육 특성을 복제할 수 있도록 편안한 TA가 있는 것이 중요합니다. 시험 도중, 근육 건축에 있는 변경이 주의될 수 있도록 계약하고 근육을 이완하는 참가자를 요청하십시오. - 초음파 프로브를 사용하여 TA의 피상적이고 깊은 구획을 시각화하고 근육 아키텍처를 조사하고 삽입 깊이및 공격 각도(그림 2A-B)를결정합니다. 피부에 랜드마크를 표시합니다.
- 주요 정맥, 동맥 또는 신경을 피하는 표적 영역의 선택에 특별한주의를 기울이는.
- TA 근육 배 내의 중앙 aponeurosis를 식별하는 것을 목표로 근육의 단면을 평가합니다 (다리의 약 1/3, 무릎에 단면, 및 2cm 측점 문장)(그림2B). 중앙 아포뇌증(보통 1.5~3cm)의 위치와 깊이를 기록하여 수집(Bergström) 바늘을 이 지점을 지나가지 않도록 주의를 기울여야 합니다.
- 대상 위치 위에 상근-말단 방향으로 초음파 프로브를 배치하고 매시 펜션 및 근육두께(도 2A)를시각화합니다. 이 정보를 사용하여 수집 바늘을 근육 배로 성공적으로 구동(맹목적으로) 돕습니다. 수술 시 향후 참조를 위해 두 평면에 대상 부위의 이미지를 저장합니다.
- 이 정보를 사용하여 대상 영역을 향한 바늘 이동 계획을 수립하십시오.
- 대상 생검 부위에서 1-3cm 의 절개를 할 계획입니다. 바늘이 근육으로 전달된 후, 바늘을 ~45% 각도로 회전하여 팔다리의 긴 축을 따라 피부에 기울인 다음 생검 영역을 향해 근접하게 구동합니다. 이 전략은 바늘이 너무 세게 밀리면 바늘을 중앙 aponeurosis로 구동 할 수있는 기회를 제한합니다. 더욱이, 바늘은 바늘 연산자의 핸드에 따라, disormally 또는 근교로 구동될 수 있다.
3. 생검 절차
- 참가자에게 수술대에 척추를 놓고 다리 근육을 이완하도록 지시합니다. 생검 부위에 대한 참가자의 시야가 커튼에 의해 차단되었는지 확인하십시오.
- 약간 dorsiflexed 위치에 발목을 고정 하는 장치에 참가자의 팔다리를 배치 하 여 근육 배에서 수동 긴장을 제거 (중립에서 0-5°; 그림 3). 너무 많은 dorsiflexion 잠재적으로 긴장을 만들 수 있습니다 으로 그들은 여전히 그들의 근육을 이완 수 있는 경우 환자에 게 물어.
참고 : 우리는 dorsiflexed 발에서 생검을 수집하는 것을 발견했습니다, 중립의 5 ° 이하 (즉, 생크에 수직 발의 발바닥) 더 많은 발바닥 구부러진 발목 각도보다 더 일관되고 더 큰 생검을 생성합니다. 발목을 비정형으로 유지하는 장치는 맞춤형 장치입니다. 그러나 원하는 결과를 생성하는 수의 (저렴한) 장치를 조작할 수 있습니다.
- 약간 dorsiflexed 위치에 발목을 고정 하는 장치에 참가자의 팔다리를 배치 하 여 근육 배에서 수동 긴장을 제거 (중립에서 0-5°; 그림 3). 너무 많은 dorsiflexion 잠재적으로 긴장을 만들 수 있습니다 으로 그들은 여전히 그들의 근육을 이완 수 있는 경우 환자에 게 물어.
- 표준관행(24)에따라 선택한 절개 영역을 면도, 청소 및 소독한다.
참고: 참가자의 "클린" 영역은 제안된 절개 부위의 근위 실산 및 10cm 내측 측면입니다. 그러나 항상 이 주제에 대해 기관의 및/또는 국가 규정(있는 경우)을 참조하십시오. 소독 프로토콜은 피부를 깨끗하게 닦은 다음 의료 등급 소독 스프레이를 자유롭게 사용하여 4 번 소독하는 것을 포함합니다. 참가자가 어떤 이유로든 테이블을 떠나는 경우 소독 프로토콜을 다시 시작해야 합니다. - 국소 마취 및 혈관 수축기로 기능하는 생검 부위에 에피네프린과 함께 2 % 자일로키틴의 1.5 cc의 suprafascial 주사를 투여하십시오. 할당된 영향 시간 ~20-30분 기다립니다.
참고 : 이러한 약물은 근독성이므로 근육에 주입해서는 안되며 피하 조직만 주입해서는 안됩니다. 혈관 수축에 대한 반응으로, 주사 부위의 영역은 흰색 (밝은 피부 톤에) 또는 회색 (어두운 피부 톤)으로 변할 수 있습니다. - 피부 피치와 멸균 메스로 부드러운 찌르기로 약물 효과를 확인합니다.
- 이전에 표시된 생검 부위에서 피부와 근막을 잘라내고 근육 배를 노출시키는 멸균 메스로 1cm 근위실 절개를 합니다. 바늘이 무디고 근막을 통과하지 않기 때문에 근막을 완전히 자르십시오.
- 생검 바늘을 피부에 수직으로 0.5-1.0cm를 밀어 넣습니다(도2C, 2E).
참고 : 운영자는 다른 조직 유형을 통해 바늘을 구동하는 데 필요한 긴장의 변화를 느낄 것이다. 지방 조직은 쉽고 근막은 가장 강하며 근육은 그 사이에 있습니다 (그러나 참가자에 따라 변수가 될 수 있습니다). - 바늘을 다리에 ~45° 각도의 위치로 방향을 지정하고 다리의 긴축(도2D, 2F)을따라다듬습니다. 바늘 끝이 근육 내의 표적 위치에 될 때까지 바늘을 근육에 1-2cm 더 밀어 넣습니다.
참고 : 의사는 근육 치수의 개별 적인 변이를 설명하기 위해 저장된 초음파 이미지를 활용해야합니다. 절개는 바늘을 삽입 할 만큼 충분히 크기 때문에 의사는 피부를 통해 맹목적으로 바늘을 구동합니다. 생검 운영자가 경험으로 얻는 "느낌"이 있습니다. 초보자는 훈련 된 생검 연산자로부터 기술을 배워야합니다 (토론에서 이것에 대한 자세한 내용은). - 생검바늘(도 1G)에100mL 주사기및 호스를 부착한다. 주사기의 플런저를 약 15-20mL로 당겨 바늘에 있는 부정적인 압력을 생성하고 근육 조직을 바늘 창으로 빨아들이면 Bergström 바늘에 흡입을 적용하십시오. 그런 다음, 바늘 창 위에 트로카의 빠른 푸시 (es)에 의해 근육을 소비.
참고 : 흡입 전후, 바늘로 근육을 밀어 도움이 바늘 창 바로 위에 피부에 가벼운 압력을 배치하는 것이 때로는 도움이됩니다. - 다리에서 바늘을 부드럽게 제거하고 천천히 회전합니다. 바늘을 추출하는 동안 만 빛 저항이 있어야합니다. 더 많은 저항이 있는 경우에, 이것은 부분생검 절단을 나타낼 수 있습니다. 이 발생, 대상 위치에 필요성을 반환 하 고 조직 수집을 다시 시도.
- 절제된 조직을 내부 난동을 사용하여 바늘 창쪽으로 밀어 넣습니다.
- 조심스럽게 바늘에서 샘플을 제거합니다.
참고: 바늘을 수집 용액(섬유 준비 섹션 참조)으로 잠복하면 바늘에서 생검이 빠져나갑니다. 또한 주사기는 바늘을 통해 공기를 몰고 샘플을 밀어내는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 핀셋으로 생검을 물리적으로 만질 필요가 없으며 손상 가능성을 줄입니다. 공구, 손(장갑 여부) 또는 비멸용 용액이 바늘과 접촉하는 경우, 바늘은 시술 중에 추가로 사용할 수 없습니다. 따라서 두 번째 즉각적인 생검이 필요한 경우 새로운 멸균 바늘을 사용해야합니다. 이것은 수시로 생기기 때문에, 예비에 있는 몇몇 살균 바늘을 유지하는 것이 좋습니다. - 조직을 지방이나 결합 조직이 아닌 근육으로 식별합니다. 근육 조직은 깊은 붉은 색(도 4A)으로인해 다른 조직에서 쉽게 식별 할 수 있습니다. 때때로, 수집된 조직은 근육이 아니라 지방 또는 결합 조직입니다.
- 근육 조직의 적절 한 금액을 수집 하는 경우, 프로토콜을 계속. 근육이 충분하지 않으면 생검을 다시 시도하십시오.
- 두 번째 생검이 필요한 경우, 두 번째 바늘 푸시가 때때로 참가자를 첫 번째보다 더 불편하게 만들 때 참가자를 주의 깊게 모니터링하십시오.
- 수집 솔루션에서 즉시 근육 샘플을 세척하고 단일 섬유 실험을 준비합니다(근육 생검 처리 및 보관 참조).
- 숙련된 도우미가 샘플 품질을 확인하고(아래 참조) 두 번째 생검을 수행할 필요성을 평가합니다. 별도의 조수는 처리를 위해 생검을 취하고, 팀의 나머지는 참가자와 함께 계속하는 동안.
- 절개 사이트를 닫습니다.
- 멸균 된 Leukostrip 테이프로 절개 상처를 닫습니다. 하나 이상의 조각을 사용하여 절개 부위의 긴 축에 수직으로 배치한 다음 다방향 적재로부터 보호하기 위해 별 모양 패턴에 스트립을 더 배치합니다.
참고: 이 단계를 적절히 처리하면 흉터가 줄어듭니다. 상처를 봉합할 수는 있지만 필요하지 는 않습니다. 다른 옵션으로는 상처 접착제가 있습니다. - 감염으로부터 보호하기 위해 절개 부위에 멸균 상처 드레싱(예: Leucomed T plus)을 배치합니다.
- 신축성 있는 붕대(예: Unihaft)로 다리를 감싸 초기 출혈을 제한하고 외부 기계적 충격으로부터 보호합니다.
- 출혈을 방지하고 더 깊은 붕대가 느슨해지거나 파괴되는 것을 방지하기 위해 아크릴 성형식 압축 붕대로 다리를 감싸.
- 멸균 된 Leukostrip 테이프로 절개 상처를 닫습니다. 하나 이상의 조각을 사용하여 절개 부위의 긴 축에 수직으로 배치한 다음 다방향 적재로부터 보호하기 위해 별 모양 패턴에 스트립을 더 배치합니다.
4. 생검 후 치료
- 참가자에게 절차 직후 에 걸어 보라고 한다. 국소적인 아름도 있을 것입니다. 참가자에게 가능한 한 정상적으로 걷도록 지시합니다.
- 참가자에게 붕대를 제거하거나 붕대를 흡수하지 말라고 지시합니다. 그들은 적어도 유지해야합니다 : 아크릴 성형 붕대에 대한 1 일, 응집력탄붕붕3 일, 상처 드레싱7 일. 필요한 경우 다시 붕대를 감을 수 있음을 참가자에게 알립니다.
- 참가자의 생검 후 관리를 개인의 필요에 맞게 조정하십시오. 훈련 된 조수 또는 의사가 참가자를 평가하고 적절한 사후 생검 치료 계획을 세우십시오. 이 절차에 대 한, 우리는 TA의 생체 내 신경 근육 테스트에서 생검에서 적어도 일주일에 의해 분리 되는 것이 좋습니다.
5. 근육 생검 취급 및 저장
- 조직 추출 후, 즉시 엄격한 수집 용액을 포함하는 5mL 유리병에 조직을 배치 (mM에서 트리스 (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), 프로테아제 억제제 정제 (1), pH 7.0) 혈액을 씻어 4-6 분 가볍게 흔들어.
- 리거 용액을 신선한 엄격함으로 교환하고 4-6분 동안 가볍게 흔들어준 다음 4°C에 4-6h로 저장하여 프로테아제 억제제 저장 용액 및 혈액을 교환할 수 있도록 합니다.
- 하룻밤 리거 (mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), 프로테아제 억제제 정제 (1), 50:50 글리세롤, pH 7.0)에 대한 교환 리거 솔루션은 12-18 h4 °C에서 저장합니다.
- 50:50 수집 엄격에 대한 하룻밤 리금기를 교환 : 글리세롤은 최대 3 개월 동안 - 20 ° C에 저장, 또는 -80 ° C 냉동고에 1 년.
참고: 이 과정은 세포 안팎에서 칼슘을 수동으로 첨가할 수 있는 섬유막을 과미화합니다. 이 과정은 시간이 걸리고 다른 근육과 종 간에 다를 수 있습니다.
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Representative Results
참가자에 대한 전체 시간 약 1 시간 (상담 10 분 상담, 10 분 초음파, 20 분 수술 준비 및 마취 관리, 10 분 수술 및 10 분 회복)이었습니다. 종종, 참가자는 무의식적으로 그들의 TA를 활성화 하 고 가능한 한 편안 하 게 근육을 유지 하기 위해 일관 된 알림 필요. 생검 바늘이 근육 안에 있을 때, 참가자는 일반적으로 생검 바늘 의 주위에 있는 유일한 "압력" 감각을 보고했습니다, 강렬한 불편에 온건한 의 가끔 기간. 한 번, 참가자의 발가락은 절차 중에 약간 비좁아, 하지만 바늘을 제거 한 후 즉시 중지. 생검 크기는 일반적으로 ~50-100 mg (젖은 질량)이었다. 절차에 대한 참가자의 반응은 종종 예측할 수 없었습니다. 때때로, 참가자는 절차 도중 영향을 받지 않을 것으로 예상했습니다 그러나 그 때 실신의 표시를 보였습니다, 다른 사람은 긴장했지만 절차 도중 완전히 fazed 동안. 따라서, 우리는 그들의 전체 주의가 진행중인 절차에 집중되지 않도록, 대화로 바쁜 참가자를 유지하거나 휴대 전화를 사용하도록하는 것이 좋은 관행임을 발견했다. 참가자와 이야기 한 조수는 또한 고통, 고통 또는 실신의 징후를 모니터링했습니다. 때때로, 생검은 단지 지방 또는 결합 조직 (조직의 창백한 백색색에 의해 확인된, 도 4A)를포함했습니다. 이 경우에, 두 번째 생검은 즉시 취해졌습니다 (승인이 참가자에 의해 주어졌다 후에). 보통, 성공적인 생검은 수율 >80% 근육 조직(그림 4A).
수술 후 대부분의 참가자는 3-5 일 지속 된 절차 후 불편함을 느꼈습니다. 참가자들은 TA 의 아소움이 가파른 슬로프를 하이킹한 후 예상되는 것과 유사하다고 보고했습니다. 적어도 5일 동안 절개 부위에 기계적 압력을 가하거나 다시 열 수 없습니다. 참가자는 일반적으로 작은 흉터와 함께 남아 있었다, 하지만 우리는 피부에 제기 또는 그렇지 않으면 비정상적인 변화를 관찰 하지 않은. 또한, 어떤 참가자도 감염을 개발하지 않았습니다.
생검은 글리세롤 용액(글리세롤 의 1:1 혼합물: 리거 용액)에서 6주 동안 과미로 처리된 다음 실험 당일 기계적 테스트를 위해 준비되었습니다. 섬유의 글리세롤 퍼메아빌라이제이션은 목욕 용액을 섬유로 확산시킬 수 있으며, 이는 연구원의 활성화 제어를 제공하고 또한 제약이나 기타 화학 물질에 근육을 가하는 길을 제공한다. 또한, 글리세롤은 동결 방지 제로 기능, 장기 저장에 대 한 추운 온도에 배치 될 수 있도록, 제한 된 손상. 그러나 글리세롤이 시료를 관통할 수 있도록 시간이 필요하므로 처음에는 4°C에서 하룻밤 사이에 생검 샘플을 저장하는 것이 신중하다. 근육은 기능이 손상되기 전에 너무 오래 보관할 수 있습니다. 이 문제에 대한 일반적인 지침은 근육이 -20 °C 냉동고에서 적어도 3 개월 동안 글리세롤 용액 내에서 자신의 기능을 유지하거나 -80 ° C 냉동고에서 1 년 동안 유지된다는 것입니다.
근육 샘플은 해부 현미경으로 시각화되었습니다. 일부 근육 조각은 작거나 손상(그림 4B)제거하고 제거되었다. 다음으로, 섬유 그룹은 구조적 손상(시각적으로 부서지거나 분쇄된 섬유 사르콜렘, 도 4C)에대해 평가되었다. 이러한 번들로부터, 3-10 섬유의 작은 섬유 번들은 해부하고 기계 테스트장비(도 4D)의실험 챔버에 신중하게 배치되었다. 구조적으로 사용할 수 있는 섬유 길이는 전형적으로 3-5mm 길이였다. Bergström 바늘은 7mm의 수집 창을 가지고 있었기 때문에 생검은 최대 - 7mm 길이의 섬유를 최대로 얻을 수 있었습니다. 따라서, 우리가 수집한 구조적으로 사용할 수 있는 섬유는 가능한 한 오래 있었습니다. 전형적으로, 우리는 (수집된) 조직의 50 mg 당 5-10 섬유 번들을 준비합니다. 이러한,절차에 대한 자세한 내용은14,,15, 25에서확인할 수 있습니다.25 섬유의 내구성을 입증하기 위해, 우리는 당화 TA 섬유 번들(도 5)를사용하여 간단한 기계 프로토콜의 대표적인 데이터를 보여줍니다. 참가자 10명 중 40개의 섬유 번들은 활성화용액(26)에서2+활성화되었고(2.7 μm 사코머 길이에서 60초 동안 및 정상 상태 활성 응력은 100.71 ±11mN mm-2(±평균 SEM)으로 측정하였다.26
그림 1: 베르그스트롬 바늘. 본 연구에서 사용되는 Bergström 바늘은 바늘자체(A-F),흡입호스(G),및 주사기(F)로 구성된다.F Bergström 바늘은 바늘 끝에 가까운 창이있는 외부 바늘(A),바늘 창을 통과 할 때 바늘을 위아래로 이동하고 근육을 자르는 작은 중공 내부 트로카(B)와트로챈터(C)로구성되어 있어 바늘에서 근육을 제거하는 데 도움이됩니다. 이 조각들은 바늘을 밀폐시키는와셔(D)에의해 분리되고, 막대와 트로카 사이에 스페이서(E)가 근육생검의 분쇄로부터 보호한다.E 마지막으로 흡입 호스 어댑터가 부착됩니다. 바늘 창으로 근육을 당기려면 흡입 호스(G)가바늘 어댑터 및 주사기에 부착됩니다. 이것은 바늘에서 공기를 빨아 와 부정적인 압력을 통해 바늘 창으로 근육을 당겨, 샘플 수집을 허용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 초음파 이미징 및 바늘 배치. TA는 aponeuroses에 의해 정의되는 피상적이고 깊은 구획으로 구성되어 있습니다. TA는 TA의 3D 형상을 인식할 수 있도록 탈구계측(A)및 내측측(B) 원점에서 지향되는 초음파 프로브로 이미지화된다.B 수집을위한 이상적인 바늘 깊이는 수평 파선 사이에 있습니다. 바늘 삽입의 만화 표현은 패널 C와 D에 표시됩니다. 절개가 만들어진 후, 바늘은 먼저 근육에 수직으로 배치되고 바늘 창이 근육(C)에될 때까지 근육으로 밀어 넣습니다. 바늘은 다리의 긴 축을 따라 ~45° 각도로 방향을 전환하고 근육으로 더 밀어 넣고 바늘이 깊은 aponeurosis(D)를관통하지 않는다는 주의깊은 주의를 기울입니다. 라이브 사진(E, F)절차 동안 만화(C, D)를참조하여 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 참가자 배치. 참가자는 수술 테이블에 있는 척추 위치에 놓습니다. 머리를 위로 할 수 있습니다. 오른발은 발을 약간 도는 사용자 정의 장치에 배치되어 근육 긴장을 줄입니다. 커튼은 참가자 앞에 배치되어 절차를 볼 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 근육 조직의 대표적인 이미지. (A)생검 직후, 근육 샘플은 지방 조직 및 결합 조직(패널에 표지된)을 포함한 다른 조직보다 더 어두운 빨간색이 될 것이다. (B)손상/짧은(상단) 및 가능한(아래) 섬유 번들이 있는 시료의 해부. (C)손상의 징후를 표면을 검사하는 실행 가능한 섬유 그룹의 배율. (D)6 섬유 번들이 섬유 번들에서 해부되었다 (쉬운 움직임을 위해 6-0 봉합사로 끝에 묶여 기계 장치에 부착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 섬유 번들 준비의 대표적인 힘 출력. 섬유의 내구성을 입증하기 위해, 우리는 당화 TA 섬유 번들 (3 섬유)를 사용하여 간단한 기계 프로토콜의 대표적인 응력 데이터를 보여줍니다. 총, 10명의 참가자의 생검에서 40개의 섬유 묶음이 느슨에서 2.7 μm sarcomere 길이로 뻗어 있고 스트레스 이완을 허용하기 위하여 개최되었습니다. 다음으로, 섬유는 활성화용액(26)에서 활성화되었다(샤드 영역; 높은 [Ca2+],pCa & lt; 4.2) 2.7 μm 사코머 길이에서 60초 동안 정상 상태 활성 응력은 100.71 ±11 mNmm-2(평균 ±SEM)로 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고에서는, 우리는 TA에서 구조적으로 손상되지 않은 근육 조직의 생검을 위한 기술을 기술했습니다. 우리는이 절차는 기계적 테스트를 위해 사용 가능한 근육 섬유 (수집 된 조직의 50 mg 당 5-10 섬유 번들 제제)의 허용 가능한 함량을 산출한다는 것을 발견했습니다. 또한, 우리는 후속 기계, 유전 적 및 proteomic 실험을위한 충분한 조직을 가지고 있었습니다.
일반적으로 근육 생검 의 수집에 사용되는 몇 가지 방법이 있습니다33,4,,6,,27,,28. 소위 오픈 생검20 외과 의사가 근육을 완전히 노출하고 샘플을 해부하기 때문에 최고 품질의 섬유를 생산합니다. 물론, 개방 수술은 매우 침략적인 절차이며, 오픈 수술과 관련된 잠재적 인 위험 때문에 연구 질문에 관계없이 건강한 참가자를 제출하는 적절한 절차가 아닙니다. 가장 침습적 생검 방법은 조직을 수집하기 위해 상대적으로 작은 바늘을 사용하는 미세 바늘 생검29,,30입니다. 미세 한 바늘 생검은 섬유30,,31의유전 / 화학 / 단백질 성분에 대한 실험을 수행하기에 충분하지만 섬유 질이 매우 좋지 않아 기계적 검사가 어렵거나 불가능합니다. Bergström 바늘 기술은 수술이 개방생검 보다는 더 적게 침략적이기 때문에 위에서 설명한 두 절차 사이 좋은 타협입니다 그러나 아직도 더 크고 (잠재적으로) 미세한 바늘 생검 보다는 더 구조적으로 온전한 근육 견본을 수집합니다. Bergström 바늘 절차3의이전 보고서3,5 기술을 배우는 사람들을 위한 훌륭한 자원 이지만 광대 한 측면에 대 한 프로토콜만 존재. 우리의 보고서는 기계적 테스트를 위한 구조적으로 그대로 남아 있는 섬유의 높은 수율의 수집에 초점을 맞춘 TA의 기술을 보여줍니다.
우리의 지식에 TA 생검의 컬렉션에 대한 자세한 간행물이 없습니다. 그럼에도 불구하고, 표준 관행은 참가자 supine을 배치하고 가능한 한 많은 다리를 휴식을 취하는 것입니다. 이 위치의 편안한 발은 자연스럽게 발바닥이 되어 TA를 길게 하고 긴장감을 더합니다. 우리는 어떤 근육 긴장도 생검 바늘로 근육을 운전하는 것이 더 어렵게 된다는 것을 것을을 발견합니다, 부정적인 압력으로조차, 그래서 긴장은 가능한 한 많이 최소화되어야 합니다. 이를 위해 간단하지만 중요한 수정 사항은 발목을 약간 도지한 위치(중립에서 0 - 5°)로 유지하여 TA 여유를 유지하고 수집을 개선하는 맞춤형 풋 플레이트를 사용하는 것이었습니다. 임상의는 TA가 통제 할 수없는 활성화되어 긴장을 증가시키기 때문에 발목을 과도하게 도비하지 않도록주의해야합니다. 참가자는 일반적으로이 근육 활성화를 느낄 수 있습니다., 그래서 의사 소통은 키. 프로토콜에서, TA는 더 일반적으로 사용되는 vastus 측면염에 비해 단지 ~ 25 % 조직을 산출, ~100 mg과 ~400 mg, 각각. 따라서, TA 조직 샘플이 원하는 연구 프로젝트에 충분히 큰지 고려하면서 조직 수집 크기를 최대화하는 것이 중요하다. 우리는 첫 번째 직후 두 번째 샘플을 복용하면 참가자에게 추가 합병증이나 치유 시간을 일으키지 않는다는 것을 발견했습니다.
프로토콜은 다른 근육 생검에 대한 몇 가지 지침을 제공하지만, 근육 선택은 적절한 절차를 지시합니다. 따라서, 우리는 강력하게 다른 연구자와 임상의에게 출판을 제안, 전체, 그들의 생검 방법. 경험에서, 우리는 근육 선택에 몇 가지 중요 한 요소를 식별, 연구 질문 의 외부. 첫째, 우리는 피부에 피상적이고 깊고 쉽게 피할 수있는 주요 동맥 / 신경이있는 근육을 고려하는 것이 좋습니다. 둘째, 참가자는 시술 도중 깨어 있기 때문에, 생검 절차가 환자의 초기 위치 때문에, 또는 생검 바늘의 압력 때문에 환자에게 아주 불편할 지, 또한 불편한 방법으로 더 깊은 근육에 밀어 붙일 지 고려하는 것이 중요합니다. 우리는 광대 한 측면 과 가슴마비와 성공을 했다. 그밖 잠재적인 선택권은 사다리꼴, latissimus dorsi 및 위장혈증입니다 (고도로 혈관이 있고 출혈하기 쉬운 비록). 햄스트링 근육은 환자에게 는 불편하지만 생검을 수집 할 때 측면으로 움직이기 때문에 어렵습니다.
Bergström 바늘은 제조에서 구입할 수 있지만, 일부 실험실은 자신의 맞춤 제작. 작지만 영리한 디자인 조정은 길고 손상되지 않은 근육 섬유의 수율을 증가시킬 수 있습니다. 예를 들어, 여기서 사용된 바늘의 수집 창은 7mm x 5mm(길이 x 너비)였다. 이것은 근육의 큐브를 캡처하는 것이 적절합니다. 그러나, 길고 손상되지 않은 섬유를 수집하는 것이 목표인 경우(동일한 부피의) 길이가 증가하고 폭이 감소할 수 있습니다(즉, 10mm x 3.5 mm). 바늘이 근막 방향을 따라 지향되는 경우,이 바늘은 더 긴 섬유 섹션을 수집 할 가능성이 높습니다.
근육 생검은 종종 초음파 이미지의 지도없이 안전하게 수집되며, 특히 광대 한 측면과 같은 더 큰 근육에 대해. 이 상황에서, 제대로 숙련 된 의사는 쉽게 최고의 절개 사이트를 찾기 위해 근육을 만지출 할 수 있습니다. 그러나 의사가 표적 근육에 경험이 적거나 주요 신경이나 혈관을 피하기 위해 추가 치료가 보장되면 초음파는 훌륭하고 단순히 적용 된 도구입니다. 마지막으로, 생검 부위의 수술 후 모니터링은 초음파의 도움으로 신속하게 수행 될 수 있습니다.
소아 생검은 확실히 가능하고 일반적으로수행 32,,33,,34. 그러나 일반적으로 절차에 몇 가지 변경 사항이 있습니다. 더 작은 게이지 바늘과 의식적인 침전이 수시로 요구되고, 절차는 병원 환경에서 일어납니다. 일반적으로, 경험은 건강한 소아 참가자를 포함하고자하는 아이와 연구 그룹에 대한 외상이 될 수 있습니다 신중하게 연구의 잠재적 인 장점에 대해이 무게해야합니다.
섬유 번들 또는 사용하지 않은 물질은 섬유 역학 전이나 후에 다른 실험으로 옮길 수 있습니다. 예를 들어, 육종 단백질 함량을 평가하거나 동소형 유형을 분류하는 기술은35를수행할 수 있다. 그러나, 단백질 분해를 제한하고 분석 성공을 향상시키기 위해, 조직은 원래 추출 후, 기계적 평가 직후, 또는 단백질 분석을 위해 즉시 처리된 액체 질소에서 동결되어야 한다. 섬유는 또한 섬유 내의 단백질 위치 평가를 허용하는 면역 조직화학 또는 기타 이미징기술(36)에 대비할 수 있다. 이 경우, 섬유는 고정용액(예를 들어, pH 7에서 생리적 완충에서 4% 파라포름데히드/0.25% 글루타랄데히드, 면역히스토케화학을 위한 글루타랄데히드 없음)에 배치될 수 있으며, 원하는 육종길이로 육종 구조를 보존한다. 가능하면 원래 생검의 작은 조각을 수확하고 10 분 동안 수집 용액으로 적극적으로 세척 한 다음 고정 용액에 배치 할 수 있습니다. 많은 그룹은 손상 얼음 결정의 형성을 제한하고 시각적 평가를위한 이미지 품질을 향상시키는 isopentane에서 갓 절제 된 샘플을 즉시 플래시 동결하는 것을 선호합니다. 이것은 실제로 플래시 동결에 대 한 금 표준; 그러나 질소 동결로 인한 얼음 결정 손상은 초대형 근시릴 구조에만 초점을 맞추고 있음을 발견합니다. 우리는 액체 질소에서 또한 동결 된 샘플에 육종 성분의 만족스러운 구조적 무결성을 가지고, 그래서 우리는 질소가 가능성이 라고 생각, 특히 그것은 더 쉽게 사용할 수 있는 경우, 또는 외과 팀/지역 화학 당국은 isopentane를 사용 하 여 기꺼이. 보기를 위해 샘플을 준비하는 데 있어 중요하고 종종 보고되지 않은 문제는 사코레가 종종 계약/짧은, sarcomere의 I 밴드 영역 짧은 또는 관찰 할 수없는. 이를 극복하기 위해 연구원은 고정하기 전에 섬유 샘플을 수동으로 늘려야합니다 (테스트 장치 또는 미세 핀셋을 사용하여 손으로) 고정해야합니다. 일반적으로, 우리는 ~ 3.2 μm sarcomere 길이 (레이저 회절을 통해 측정)로 스트레칭, 또는 낮은 칼슘 생리적 이완 용액에, 여유 길이의 ~ 150 %로 스트레칭. 마지막으로, 서브샘플이 RNA 발현 분석을 원할 경우, 플래시 동결 방법은 결과에 영향을 미치지 않지만, RNA가 매우 불안정하기 때문에 원래 추출 후 즉시 샘플을 동결하고 -80°C 냉동고에 배치해야 한다. 시장에는 몇 가지 RNA 보호 저장 솔루션이 있지만 사용과 혼합 된 결과를 발견했으며 플래시만 신선한 샘플을 동결합니다.
한 번의 평가판 동안 수집된 정보의 양을 최대화하기 위해 기계 테스트를 수행하는 동안 다른 데이터의 동시 수집을 완료할 수 있습니다. 예를 들어, 육종 구조의 연구는 다른 동물37,,38에서수행되는 것처럼 저각 X 선 회절 이미징을 사용하여 기계적 테스트 중에 수행 될 수있다. 유전자 실험의 경우, DNA/RNA가 단백질보다 상대적으로 덜 안정적이기 때문에 절제된 근육은 그 목적을 위해 즉시 처리되거나 동결된 플래시를 처리해야 합니다.
일부 제한 사항은 이미 위에 설명되어 있습니다. 여기서 우리는 절차 자체에 대해 논의합니다. 대부분의 그룹에 대 한 큰 제한은 생검 수집에 적절 하 게 훈련 된 팀 멤버를 가지고. 사람의 직업 (의사, 의료 조수, 기술자, 또는 다른 달리)에 관계없이, 이 절차는 조사관이 맹목적으로 바늘을 운전하고 정확하게 바늘 창을 찾기 위해"느낌"3,,28에 의존해야하기 때문에 어렵다. 생검에 대한 인간의 참가자를 동의하는 것은 희소하기 때문에 실수는 견딜 수 없으며, 한 생검은 많은 사람에게 바람직하며 실수는 혈관이나 신경 손상으로 이어질 수 있습니다. 따라서 인간의 생검이 수행되기 전에 모든 훈련 가능성을 완료해야합니다. 예를 들어, 바늘을 운전하기 위한 "느낌"을 얻으려면, 피부가 여전히 부착된 돼지고기 고기는 대부분의 식료품점에서 구입하여 인간의 피부와 근육의 대리자로 사용될 수 있습니다. 또 다른 귀중한 경험은 훈련된 연구 그룹을 그림자로 하는 것입니다.
우리는 참가자의 고통/불편을 보다 질적으로 평가, 의사의 경험과 인식 된 통증을 평가 하기 위해 참가자와 대화에 의존. 그러나, 통증과 생검 후 불편의 평가는 검증 된 통증 / 불편 설문 조사의 사용을 통해 개인과 연구에 걸쳐 더 정량화하고 비교 될 수 있습니다. 이 점은 문헌에 있는 의외로 작은 처리가 있습니다. 그러나, 최근 한 연구는 고통의 잘 확립 된 설문 조사를 활용하여, 생검 전, 도중, 그리고 후에 참가자 고통/불편을 정량화하는 방법을제시했습니다 39. 우리는이 논문은 대상 근육으로 광대 한 측면을 사용, 그래서 후속 연구는 근육 사이의 통증 평가를 비교 하는 데 필요한.
추출 방법에 관계없이 Bergström 기술은 섬유가 너무 길기 때문에 근육의 섬유의 총 길이를 소비할 수 없습니다(TA 40에서~6-8cm, ~6.5-8cm는 광수40측측(40).40 따라서, 수집된 섬유의 긴 조각에 대 한, 끝생검 기술에 의해 파괴 되는 것은 피할 수 없다. 종종 섬유의 사용 가능한 중앙 부분은 작기 때문에 기계적으로 테스트하기가 어렵습니다. 이 기술은 합리적으로 긴 중앙 영역 (3-5 mm)을 제공하지만, 조사관은 손상된 섬유의 사용이 수동 또는 활성 힘 출력을 변경하기 때문에 해부 동안 섬유 번들의 품질을 주의 깊게 확인해야합니다. 성공적인 생검의 시각적 관찰은 생검 절차에서 손상되지 않은 섬유의 일부를 보여줍니다. 전통적인 해부 광 현미경에서 볼 때, 섬유의 표면은 구멍이나 눈물없이 매끄럽게 보일 것입니다(그림 4). 또한 섬유는 원통형으로 보이고 평평한 영역이 없어야합니다. 보이지 는 않지만, 근육 자체는 추출 후 거의 즉시 근육 단백질을 분해하기 시작하는 자연발생 적인 프로테아제 때문에 시간이 지남에 따라 저하됩니다. 따라서 섬유와 함께 사용되는 모든 솔루션에 프로테아제 억제제를 추가하는 것이 중요합니다. 또한, 우리는 또한 가능한 한 많은 혈액을 제거하기 위해 생검의 여분의 세차를 제안한다.
신중한 준비에도 섬유 손상이 발생하여 섬유 활성화가 불량할 수 있습니다. 섬유는 절차의 거의 모든 부분에 매우 민감하기 때문에 섬유 손상에 대한 많은 이유가 있습니다. 예를 들어, 생검 중에 트로카가 충분히 날카롭지 않으면 섬유를 스트레칭하고 파괴 할 수있는 대신 추출 중에 근육 조직으로 밀어 넣을 수 있습니다. 섬유가 삼투성 변화, pH 및 온도에 민감하기 때문에 수집 솔루션이 적절하게 준비되어야 합니다. 섬유를 취급할 때는 섬유에 대한 압력을 완전히 제한하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 대신, 핀셋은 결합 조직에 의해 생검을 잡기 위해 사용되어야한다. 또 다른 대안은 생검의 사용할 수없는 끝을 포장하고 처리 할 때 이를 잡아 크기 0-7 실크 봉합사를 사용하는 것입니다. 마지막으로, 글리세롤은 두 가지 역할을 한다: 첫 번째는 근육이 동결되는 것을 막는 것이고 두 번째는 -20°C이고 두 번째는 섬유에 가벼운 세제가 된다. 즉, 글리세롤은 외부 용액에 섬유를 퍼메아빌화하여 칼슘의 유입을 허용합니다(활성화 용액을 통해). 대부분의 근육에 대 한, 이 과정 소요 ~10 일. 그러나 콜라겐 함량의 양과 샘플 크기에 따라 최대 6주가 걸릴 수 있습니다. 기계적 실험 중에 발생하는 고칼슘 활성화를 위해 섬유질을 과미로 하여져야 합니다. 섬유는 일반적으로 적어도 3 개월 동안 사용할 수 있습니다. 섬유 폐기물을 제한하기 위해 TA 근육 섬유에 대해 더 긴 투과화 대기 시간(4-6주)이 제안됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
마이클라 라우, 레아 페디아 리스만, 마이클 마쉬, 자니나 소피 테너러, 킬리안 킴메캄프, 볼프강 링케에게 이 프로젝트를 지원해 주신 것에 감사드립니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 MERCUR 재단 (ID : An-2016-0050)이 DH에 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe | B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany |
4606027V | Drug administration |
| 5mm Berstöm needle | homemade | N/A | Tissue collection. Similar to other Berstöm needles |
| Acrylastic | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
269700 | elastic compression bandage |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11836145001 | Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue. |
| Cutasept | PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany |
9805630 | Disenfectant spray for the skin |
| Leucomed T plus | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
7238201 | Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection |
| Leukostrip | Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain |
66002876 | wound closure |
| Surgical disposable scalpels | Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany |
BA200 series | Incision |
| Unihaft cohesive elastic bandage | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
4589600 | cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact |
| Xylocitin 2% with Epinephrin | Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany |
N/A | Controlled substance anesthesia, vasoconstriction |
References
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