Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica

Summary

Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata per la biopsia del musculus tibialis anteriore che limita i danni alle fibre.

Abstract

Le proprietà meccaniche di contrarre le fibre scheletriche sono indicatori cruciali della salute generale del muscolo, funzione, e le prestazioni. Le biopsie muscolari scheletriche umane sono spesso raccolte per questi sforzi. Tuttavia, sono disponibili relativamente poche descrizioni tecniche delle procedure di biopsia, al di fuori dei musculus vastus lateralis comunemente utilizzati. Anche se le tecniche di biopsia sono spesso regolate per adattarsi alle caratteristiche di ogni muscolo in fase di studio, pochi rapporti tecnici condividono questi cambiamenti alla comunità più grande. Così, tessuto muscolare da partecipanti umani è spesso sprecato come l’operatore reinventa la ruota. L’espansione del materiale disponibile sulle biopsie da una varietà di muscoli può ridurre l’incidente di biopsie fallite. Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata sul musculus tibialis anteriore che limita i danni alla fibra e fornisce lunghezze di fibra adeguate per la valutazione meccanica. L’intervento è una procedura ambulatoriale che può essere completata in un’ora. Il periodo di recupero per questa procedura è immediato per l’attività leggera (cioè camminare), fino a tre giorni per la ripresa della normale attività fisica e circa una settimana per la cura delle ferite. Il tessuto estratto può essere utilizzato per esperimenti di forza meccanica e qui presentiamo dati di attivazione rappresentativi. Questo protocollo è appropriato per la maggior parte degli scopi di raccolta, potenzialmente adattabile ad altri muscoli scheletrici, e può essere migliorato da modifiche all’ago di raccolta.

Introduction

Lo studio della fisiologia muscolare umana per scopi clinici o di ricerca spesso richiede biopsie muscolari. Ad esempio, una grande sfida nella fisiologia muscolare umana e nella biomeccanica è distinguere e comprendere i vari adattamenti delle prestazioni muscolari all’esercizio. Gli adattamenti delle prestazioni non includono solo adattamenti strutturali (ad esempio, cambiamenti nelle proteine contraili, architettura muscolare), ma includono anche adattamenti neurali¹, che sono molto difficili, se non impossibili, da valutare separatamente quando si testano intatti in situ muscoli umani. Gli esperimenti di livello in fibra rimuovono questi componenti di ordine superiore e consentono una valutazione più diretta della contrazione muscolare e possono essere raccolti tramite tecniche di biopsia. Le biopsie muscolari sono state raccolte almeno dal 1868². Oggi, la tecnica predominante per raccogliere le biopsie muscolari è la tecnica modificata Bergstrom^3,4,5, anche se sono disponibili altre tecniche tra cui l’uso di un conchotome Weil-Blakesley⁶ o il cosiddetto aghi sottili^7,8. Tutte queste tecniche utilizzano speciali strumenti aghi che sono progettati per passare nel muscolo e tagliare un pezzo di tessuto. In particolare, la tecnica modificata bergstrom utilizza un grande ago modificato (5 mm di ago; Figura 1) che ha una finestra vicino alla punta dell’ago e una trocar interna più piccola che si muove su e giù per l’ago, tagliando il muscolo quando si passa sopra la finestra dell’ago. All’interno di questo trocar hallow è un ramrod che si muove su e giù per l’albero della trocar e spinge la biopsia verso la finestra dell’ago. Per tirare il muscolo nella finestra dell’ago, viene attaccato un tubo di aspirazione, che aspira l’aria dall’ago e tira il muscolo nella finestra dell’ago tramite pressione negativa.

Le biopsie muscolari sono spesso acquisite per studiare i cambiamenti nel contenuto proteico, nell’espressione genica o nella morfologia causata dalla malattia o in risposta a un programma^{di esercizi 1,9,10,11}. Un altro uso critico per le biopsie muscolari sono gli esperimenti meccanici come la misurazione della forza contraili in fibra, la rigidità della fibra muscolare e le proprietà muscolari^{dipendenti dalla storia 12,13,14,15,16}. La meccanica del fascio di fibre singole o fibre viene misurata collegando fibre tra un motore di lunghezza e un trasduttore di forza su impianti specializzati che controllano la lunghezza della fibra e contemporaneamente misurano la forza. Permeabilizzando (ad esempio, la scuoiatura) le fibre, la membrana sarcolemma diventa permeabile alle sostanze chimiche nella soluzione del bagno, consentendo il controllo dell’attivazione variando la concentrazione di calcio. Inoltre, l’effetto delle proprietà contrattili sulle sostanze chimiche/prodotti farmaceutici/altre proteine può essere facilmente valutato aggiungendo il reagente in questione alla soluzione del bagno. Tuttavia, mentre questa tecnica è molto utilizzata in altri modelli animali, notevolmente meno studi condotti test meccanici su fibre scuoiate da biopsie muscolari umane^17,18,19. Uno dei motivi è che gli strumenti e i protocolli di biopsia sono progettati per rimuovere il maggior tessuto muscolare possibile con meno riguardo al livello di danni strutturali subiti durante l’estrazione dei tessuti. Infatti, un recente protocollo di biopsia suggerisce di guidare l’ago biopsia nel muscolo e raccogliere 2-4 pezzi di muscolo³. Il processo stesso fa pochi danni al DNA o al materiale proteico, ma spesso distrugge le strutture di fibre e sarcomerici in modo tale che l’attivazione delle fibre muscolari diventi instabile o impossibile. Inoltre, la lunghezza relativa delle fibre all’interno della biopsia è tipicamente breve (<2 mm) e non facilmente maneggiabile per le prove meccaniche. Per i test meccanici, le fibre ideali sono lunghe (3-5 mm) e non sono strutturalmente danneggiate.

Tecniche di estrazione dei tessuti più avanzate possono essere utilizzate per limitare i danni alle fibre. Ad esempio, un gruppo²⁰ ha approfittato di “interventi chirurgici aperti” precedentemente pianificati di avambracci (ad esempio, riparazione della frattura ossea), dove i muscoli sono stati completamente esposti e un chirurgo è stato in grado di visualizzare la struttura muscolare e analizzare attentamente campioni relativamente grandi e strutturalmente intatti di tessuto muscolare (15 mm x 5 mm x 5 mm). Questa tecnica di “biopsia aperta” è favorita quando i partecipanti sono sottoposti a una procedura precedentemente pianificata, e quindi limita il pool di potenziali partecipanti, soprattutto per gli adulti sani, dove nessun intervento chirurgico sarebbe altrimenti avvenuto. Così, molte biopsie condotte per scopi di ricerca sono fatte come una procedura ambulatoriale e il sito di incisione è mantenuto il più piccolo possibile per limitare il rischio di infezione, cicatrici, e il tempo di guarigione. Pertanto, la maggior parte blindly delle biopsie vengono raccolte alla cieca (cioè, l’operatore non è in grado di vedere l’ago di raccolta mentre passa attraverso la fascia nel muscolo). Ciò implica che la qualità della biopsia è quasi interamente basata sull’abilità e l’esperienza dell’operatore. Ogni muscolo ha le sue difficoltà durante la raccolta di tessuto, come i rischi di violare i nervi e vasi sanguigni, la selezione di una profondità di raccolta ideale e la posizione, e decidere su una posizione del corpo appropriata per mantenere il muscolo il più lento possibile. Sfortunatamente, la maggior parte delle competenze specifiche del muscolo non sono scritte e quindi ogni medico deve “reinventare la ruota” quando esegue biopsie sui muscoli nuovi per loro. Questa mancanza di esperienza di solito porta a diverse collezioni con bassa qualità fino a quando il medico identifica le migliori pratiche per le biopsie su quel muscolo. I medici alle prime armi spesso imparano l’abilità attraverso conversazioni con i loro colleghi più esperti, ma esistono relativamente pochi testi informativi e peer-reviewed sulla questione, soprattutto per i muscoli che non sono tradizionalmente utilizzati per la raccolta della biopsia. Se consideriamo le informazioni di cui sopra, insieme alla difficoltà di reclutare volontari umani per le biopsie, è chiaro che sono necessarie ulteriori informazioni didattiche che massimizzino le possibilità di successo per ogni partecipante.

Così, lo scopo di questo documento era quello di presentare una tecnica di biopsia muscolare che fornisce protocolli per la raccolta di successo di biopsie muscolari con lunghi frammenti di fibra non danneggiati per i test meccanici. Le biopsie muscolari umane sono di solito eseguite su, e la maggior parte del materiale di formazione biopsia è su, il musculus vastus lateralis. La sua dimensione muscolare relativamente grande e la posizione superficiale rispetto alla pelle consente la raccolta di un adeguato tessuto muscolare, riducendo al minimo il disagio del paziente e il trauma^{fisico 1,21}. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni all’utilizzo dei vastus lateralis per gli studi di formazione longitudinale. Ad esempio, durante i protocolli sperimentali che includono un programma di formazione, i partecipanti devono astenersi da una formazione aggiuntiva al di fuori dello studio per un periodo che spesso si estende per 2-6 mesi. Per gli atleti, questo spesso non è possibile, in quanto il vastus lateralis è di solito allenato durante gli esercizi tipici (ad esempio, squat, salti), o è generalmente utilizzato per lo sport (ad esempio, corsa, ciclismo). Queste esperienze di allenamento separate lontano dall’obiettivo dello studio possono causare adattamenti muscolari che alterano la meccanica muscolare, l’architettura e la fisiologia in modo tale che sia difficile o impossibile conoscere il vero effetto del protocollo sperimentale dello studio sulle proprietà muscolari. Per questi tipi di studi, sarebbe l’ideale per selezionare un muscolo bersaglio che spesso non è al centro dei reggimenti di formazione. Il musculus tibialis anteriore (TA) è un muscolo bersaglio ideale che soddisfa i requisiti di cui sopra. Inoltre, gli interventi di formazione possono essere mirati verso l’ATA utilizzando approcci controllabili, come ad esempio con l’uso di un dinamometro. Non c’è quasi nessun materiale di allenamento relativo a una biopsia muscolare TA. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo modificato per raccogliere biopsie muscolari relativamente intatte dall’TA.

Protocol

NOTA: Di seguito, delineamo un protocollo per raccogliere le fibre meccanicamente non danneggiate dal TA di volontari che sono stati arruolati in uno studio in corso separato. Questo protocollo è simile a quello descritto da Shanely et al.3, che hanno descritto la tecnica modificata bergstrom in vastus lateralis. Le informazioni qui presentate sono state perfezionate dal nostro gruppo di ricerca, ma potrebbero non essere ideali per tutti i gruppi di laboratorio o le configurazioni organizzative. …

Representative Results

L’impegno di tutto il tempo per un partecipante è stato di circa un’ora (10 min di consultazione, 10 min ultrasuoni, 20 min di preparazione chirurgica e somministrazione anestetica, 10 min di chirurgia e 10 minuti di recupero). Spesso, i partecipanti inconsciamente attivato il loro TA e aveva bisogno di promemoria coerenti per mantenere il muscolo il più rilassato possibile. Quando l’ago della biopsia era all’interno del muscolo, i partecipanti di solito hanno riportato una sensazione di “pressione” unica nella zona in…

Discussion

In questa relazione, abbiamo descritto una tecnica per la biopsia del tessuto muscolare strutturalmente intatto da TA. Abbiamo scoperto che questa procedura produce un contenuto accettabile di fibre muscolari utilizzabili (5-10 preparazioni di fascio di fibre per 50 mg di tessuto raccolto) per test meccanici. Inoltre, avevamo abbastanza tessuto per gli esperimenti meccanici, genetici e proteomici di follow-up.

Ci sono diversi metodi tipicamente utilizzati per la raccolta di biopsie muscolari<s…

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction