Coleta de Biópsias Musculares Esqueléticas do Compartimento Superior do Musculus Tibialis Anterior para Avaliação Mecânica

Summary

Este relatório técnico descreve uma variação da técnica modificada de Bergström para a biópsia do musculus tibialis anterior que limita o dano da fibra.

Abstract

As propriedades mecânicas da contração de fibras esqueléticas são indicadores cruciais da saúde, função e desempenho muscular geral. Biópsias musculares esqueléticas humanas são frequentemente coletadas para esses esforços. No entanto, relativamente poucas descrições técnicas de procedimentos de biópsia, fora do musculus vastus lateralis comumente usado, estão disponíveis. Embora as técnicas de biópsia sejam frequentemente ajustadas para acomodar as características de cada músculo em estudo, poucos relatórios técnicos compartilham essas alterações para a comunidade maior. Assim, o tecido muscular dos participantes humanos é muitas vezes desperdiçado à medida que o operador reinventa a roda. Expandir o material disponível em biópsias de uma variedade de músculos pode reduzir o incidente de biópsias fracassadas. Este relatório técnico descreve uma variação da técnica bergström modificada no musculus tibialis anterior que limita o dano de fibra e fornece comprimentos de fibra adequados para avaliação mecânica. A cirurgia é um procedimento ambulatorial que pode ser concluído em uma hora. O período de recuperação deste procedimento é imediato para atividade leve (ou seja, caminhada), até três dias para a retomada da atividade física normal, e cerca de uma semana para cuidados com feridas. O tecido extraído pode ser usado para experimentos de força mecânica e aqui apresentamos dados de ativação representativos. Este protocolo é apropriado para a maioria dos propósitos de coleta, potencialmente adaptável a outros músculos esqueléticos, e pode ser melhorado por modificações na agulha de coleta.

Introduction

O estudo da fisiologia muscular humana para fins clínicos ou de pesquisa muitas vezes requer biópsias musculares. Por exemplo, um grande desafio na fisiologia muscular humana e na biomecânica é distinguir e entender as diversas adaptações do desempenho muscular ao exercício. As adaptações de desempenho não incluem apenas adaptações estruturais (por exemplo, mudanças nas proteínas contratuais, arquitetura muscular), mas também incluem adaptações neurais¹, que são muito difíceis, se não impossíveis, de avaliar separadamente ao testar intactos nos músculos humanos. Experimentos de nível de fibra removem esses componentes de ordem mais alta e permitem uma avaliação mais direta da contração muscular e podem ser coletados através de técnicas de biópsia. Biópsias musculares foram coletadas desde pelo menos 1868². Hoje, a técnica predominante para coletar biópsias musculares é a técnica modificada bergström^3,4,5, embora outras técnicas estejam disponíveis, incluindo o uso de um conchotome Weil-Blakesley⁶ ou a chamada agulha fina^7,8. Todas essas técnicas usam instrumentos especiais semelhantes a agulhas que são projetados para passar para o músculo e cortar um pedaço de tecido. Especificamente, a técnica bergström modificada usa uma agulha grande modificada (tamanho de agulha de 5 mm aqui; Figura 1) que tem uma janela próxima à ponta da agulha e um trocarte interno menor que se move para cima e para baixo da agulha, cortando o músculo ao passar sobre a janela da agulha. Dentro deste trocariola está um ramrod que se move para cima e para baixo no eixo do trocarte e empurra a biópsia em direção à janela da agulha. Para puxar o músculo para dentro da janela da agulha, uma mangueira de sucção é anexada, que suga o ar da agulha e puxa o músculo para dentro da janela da agulha através de pressão negativa.

Biópsias musculares são frequentemente adquiridas para estudar mudanças no conteúdo proteico, expressão genética ou morfologia causadas por doença ou em resposta a um programa de exercícios^1,,9,,10,11. Outro uso crítico para biópsias musculares são experimentos mecânicos como a medição da força contratil de fibra, rigidez da fibra muscular e propriedades musculares dependentes da história^{12,,13,,14,,15,16}. A mecânica de feixe de fibra única ou fibra é medida pela fixação de fibras entre um motor de comprimento e transdutor de força em plataformas especializadas que controlam o comprimento da fibra ao mesmo tempo em que medem a força. Ao permeabilizar (por exemplo, esfolar) fibras, a membrana sarcolemma torna-se permeável aos produtos químicos na solução de banho, permitindo o controle de ativação por meio da concentração de cálcio variada. Além disso, o efeito das propriedades contratuais em produtos químicos/farmacêuticos/outras proteínas pode ser facilmente avaliado adicionando o reagente em questão à solução de banho. No entanto, embora essa técnica seja altamente utilizada em outros modelos animais, notavelmente menos estudos realizaram testes mecânicos em fibras esfoladas de biópsias musculares humanas^17,,18,,19. Uma das razões é que as ferramentas e protocolos de biópsia são projetados para remover o máximo de tecido muscular possível com menos consideração pelo nível de dano estrutural sofrido durante a extração tecidual. De fato, um protocolo de biópsia recente sugere conduzir a agulha da biópsia para dentro do músculo e coletar 2-4 pedaços de músculo³. O processo em si faz pouco dano ao DNA ou material proteico, mas muitas vezes destrói fibras e estruturas sarcomericas de tal forma que a ativação de fibras musculares se torna instável ou impossível. Além disso, o comprimento relativo das fibras dentro da biópsia são tipicamente curtos (<2 mm) e não são facilmente manuseados para testes mecânicos. Para testes mecânicos, as fibras ideais são longas (3-5 mm) e não são estruturalmente danificadas.

Técnicas mais avançadas de extração de tecidos podem ser usadas para limitar danos de fibras. Por exemplo, um grupo²⁰ aproveitou as “cirurgias abertas” previamente planejadas de antebraços (por exemplo, reparação de fratura óssea), onde os músculos foram totalmente expostos e um cirurgião foi capaz de visualizar a estrutura muscular e dissecar cuidadosamente amostras relativamente grandes e estruturalmente intactas de tecido muscular (15 mm x 5mm x 5 mm). Essa técnica de “biópsia aberta” é favorecida quando os participantes estão passando por um procedimento previamente planejado, e assim limita o pool de potenciais participantes, especialmente para adultos saudáveis, onde não ocorreria cirurgias de outra forma. Assim, muitas biópsias realizadas para fins de pesquisa são feitas como procedimento ambulatorial e o local de incisão é mantido o menor possível para limitar o risco de infecção, cicatrizes e tempo de cura. Portanto, a maioria das biópsias são coletadas cegamente (ou seja, o operador não consegue ver a agulha de coleta à medida que passa pela fáscia para dentro do músculo). Isso implica que a qualidade da biópsia é quase inteiramente baseada na habilidade e experiência do operador. Cada músculo tem suas próprias dificuldades ao coletar tecidos, como riscos de violar nervos e vasos sanguíneos, seleção de uma profundidade e localização de coleta ideal, e decidir uma posição corporal adequada para manter o músculo o mais frouxo possível. Infelizmente, a maioria das habilidades específicas dos músculos não são escritas e, portanto, cada médico deve “reinventar a roda” ao realizar biópsias em músculos novos para eles. Essa falta de experiência geralmente leva a várias coleções de baixa qualidade até que o médico identifique as melhores práticas para biópsias nesse músculo. Médicos iniciantes frequentemente aprendem a habilidade através de conversas com seus colegas mais experientes, mas relativamente poucos textos informativos e revisados por pares existem sobre o assunto, especialmente para músculos que não são tradicionalmente usados para coleta de biópsia. Se considerarmos as informações acima, juntamente com a dificuldade de recrutar voluntários humanos para biópsias, fica claro que são necessárias mais informações de ensino que maximizam as chances de sucesso para cada participante.

Assim, o objetivo deste artigo foi apresentar uma técnica de biópsia muscular que fornece protocolos para a coleta bem sucedida de biópsias musculares com fragmentos de fibras longas e não danificados para testes mecânicos. Biópsias musculares humanas são geralmente realizadas, e a maior parte do material de treinamento de biópsia está ligado, o musculus vastus lateralis. Seu tamanho muscular relativamente grande e localização superficial em relação à pele permite a coleta de tecido muscular adequado, minimizando o desconforto do paciente e o trauma físico^1,21. No entanto, existem algumas limitações para o uso da vasto lateralis para estudos de treinamento longitudinal. Por exemplo, durante protocolos experimentais que incluem um programa de treinamento, os participantes devem abster-se de treinamento adicional fora do estudo por um período que muitas vezes se estende por 2-6 meses. Para os atletas, isso muitas vezes não é possível, pois a vasto lateralis geralmente é treinada durante exercícios típicos (por exemplo, agachamentos, saltos), ou geralmente é usada para o esporte (por exemplo, corrida, ciclismo). Essas experiências de treinamento separadas longe do objetivo do estudo podem causar adaptações musculares que alteram a mecânica muscular, a arquitetura e a fisiologia de tal forma que é difícil ou impossível saber o verdadeiro efeito do protocolo experimental do estudo sobre as propriedades musculares. Para esses tipos de estudos, seria ideal selecionar um músculo alvo que muitas vezes não é o foco dos regimentos de treinamento. O musculus tibialis anterior (TA) é um músculo alvo ideal que satisfaz os requisitos acima. Além disso, intervenções de treinamento podem ser direcionadas para o TA utilizando abordagens controláveis, como com o uso de um dinamômetro. Quase não há material de treinamento relativo a uma biópsia muscular. Por isso, desenvolvemos um protocolo modificado para coletar biópsias musculares relativamente intactas do TA.

Protocol

NOTA: Abaixo, delineamos um protocolo para colher fibras mecanicamente intactas do TA de voluntários que estavam inscritos em um estudo em andamento separado. Este protocolo é semelhante ao descrito por Shanely et al.3, que descreveram a técnica modificada de Bergström em vasto lateralis. As informações aqui apresentadas foram refinadas pelo nosso grupo de pesquisa, mas podem não ser ideais para todos os grupos de laboratório ou configurações organizacionais. Nós damos apenas diretrizes…

Representative Results

Todo o compromisso para um participante foi de cerca de uma hora (consulta de 10 minutos, ultrassom de 10 min, 20 min de preparação para cirurgia e administração anestésico, 10 min de cirurgia e recuperação de 10 min). Muitas vezes, os participantes ativavam inconscientemente seu TA e precisavam de lembretes consistentes para manter o músculo o mais relaxado possível. Quando a agulha da biópsia estava dentro do músculo, os participantes geralmente relatava uma sensação única de “pressão” na área ao redor …

Discussion

Neste relatório, descrevemos uma técnica para a biópsia de tecido muscular estruturalmente intacto da TA. Verificou-se que este procedimento produz um conteúdo aceitável de fibras musculares utilizáveis (preparações de 5-10 fibras por 50 mg de tecido coletado) para testes mecânicos. Além disso, tínhamos tecido suficiente para acompanhamento de experimentos mecânicos, genéticos e proteômicos.

Existem vários métodos tipicamente utilizados para a coleta de biópsias musculares<sup…

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction