Colección de biopsias de músculo esquelético del Compartimiento Superior del Musculus Humano Tibialis Anterior para la Evaluación Mecánica

Summary

Este informe técnico describe una variación de la técnica modificada de Bergstrom para la biopsia del musculus tibialis anterior que limita el daño de la fibra.

Abstract

Las propiedades mecánicas de la contraer fibras esqueléticas son indicadores cruciales de la salud muscular general, función, y el rendimiento. Las biopsias de músculo esquelético humano a menudo se recogen para estos esfuerzos. Sin embargo, hay disponibles relativamente pocas descripciones técnicas de los procedimientos de biopsia, fuera del musculus vastus lateralis comúnmente utilizado. Aunque las técnicas de biopsia a menudo se ajustan para adaptarse a las características de cada músculo en estudio, pocos informes técnicos comparten estos cambios a la comunidad en general. Por lo tanto, el tejido muscular de los participantes humanos a menudo se desperdicia a medida que el operador reinventa la rueda. La ampliación del material disponible en biopsias de una variedad de músculos puede reducir el incidente de biopsias fallidas. Este informe técnico describe una variación de la técnica modificada de Bergstrom en el musculus tibialis anterior que limita el daño de la fibra y proporciona longitudes de fibra adecuadas para la evaluación mecánica. La cirugía es un procedimiento ambulatorio que se puede completar en una hora. El período de recuperación de este procedimiento es inmediato para la actividad ligera (es decir, caminar), hasta tres días para la reanudación de la actividad física normal, y aproximadamente una semana para el cuidado de heridas. El tejido extraído se puede utilizar para experimentos de fuerza mecánica y aquí presentamos datos representativos de activación. Este protocolo es apropiado para la mayoría de los propósitos de recolección, potencialmente adaptable a otros músculos esqueléticos, y puede mejorarse mediante modificaciones en la aguja de recolección.

Introduction

El estudio de la fisiología muscular humana con fines clínicos o de investigación a menudo requiere biopsias musculares. Por ejemplo, un desafío importante en la fisiología muscular humana y la biomecánica es distinguir y entender las diversas adaptaciones del rendimiento muscular al ejercicio. Las adaptaciones de rendimiento no sólo incluyen adaptaciones estructurales (por ejemplo, cambios en las proteínas contráctiles, arquitectura muscular) sino que también incluyen adaptaciones neuronales^1,que son muy duras, si no imposibles, de evaluar por separado cuando se prueban intactos músculos humanos in situ. Los experimentos a nivel de fibra eliminan estos componentes de orden superior y permiten una evaluación más directa de la contracción muscular y se pueden recolectar mediante técnicas de biopsia. Las biopsias musculares se han recogido desde al menos 1868². Hoy en día, la técnica predominante para recoger biopsias musculares es la técnica modificada Bergstrom^3,4,5, aunque hay otras técnicas disponibles incluyendo el uso de un conchotóma Weil-Blakesley⁶ o la llamada aguja fina^7,8. Todas estas técnicas utilizan instrumentos especiales similares a agujas que están diseñados para pasar al músculo y cortar un pedazo de tejido. Específicamente, la técnica modificada de Bergstrom utiliza una aguja modificada grande (tamaño de aguja de 5 mm aquí; Figura 1) que tiene una ventana cerca de la punta de la aguja y un trocar interno más pequeño que se mueve hacia arriba y hacia abajo de la aguja, cortando el músculo al pasar por encima de la ventana de la aguja. Dentro de este trocar hallado hay una varilla que se mueve hacia arriba y hacia abajo en el eje del trocar y empuja la biopsia hacia la ventana de la aguja. Para tirar del músculo dentro de la ventana de la aguja, se une una manguera de succión, que succiona el aire de la aguja y tira del músculo hacia la ventana de la aguja a través de la presión negativa.

Las biopsias musculares a menudo se adquieren para estudiar los cambios en el contenido de proteínas, la expresión génica o la morfología causada por la enfermedad o en una respuesta a un programa de^{ejercicios 1,9,10,11}. Otro uso crítico para las biopsias musculares son experimentos mecánicos como la medición de la fuerza contráctil de fibra, rigidez de la fibra muscular y propiedades musculares dependientes de la historia^{12,,13,14,15,16}. La mecánica de un solo haz de fibra o fibra se mide mediante la unión de fibras entre un motor de longitud y un transductor de fuerza en plataformas especializadas que controlan la longitud de la fibra mientras miden simultáneamente la fuerza. Al permeabilizar (por ejemplo, despellejar) las fibras, la membrana sarcolemma se vuelve permeable a los productos químicos en la solución de baño, lo que permite el control de activación al variar la concentración de calcio. Además, el efecto de las propiedades contráctiles en los productos químicos/farmacéuticos/otras proteínas se puede evaluar fácilmente añadiendo el reactivo en cuestión a la solución de baño. Sin embargo, mientras que esta técnica es muy utilizada en otros modelos animales, notablemente menos estudios realizaron pruebas mecánicas en fibras despellejadas de biopsias musculares humanas^17,18,19. Una razón es que las herramientas y protocolos de biopsia están diseñados para eliminar tanto tejido muscular como sea posible con menos consideración por el nivel de daño estructural sufrido durante la extracción de tejido. De hecho, un protocolo de biopsia reciente sugiere conducir la aguja de la biopsia en el músculo y recoger 2-4 trozos de músculo^3. El proceso en sí hace poco daño al ADN o al material proteico, pero a menudo destruye la fibra y las estructuras sarcoméricas de tal manera que la activación de las fibras musculares se vuelve inestable o imposible. Además, la longitud relativa de las fibras dentro de la biopsia son típicamente cortas (<2 mm) y no se manejan fácilmente para pruebas mecánicas. Para pruebas mecánicas, las fibras ideales son largas (3-5 mm) y no están estructuralmente dañadas.

Se pueden utilizar técnicas de extracción de tejido más avanzadas para limitar el daño de la fibra. Por ejemplo, un grupo²⁰ se aprovechó de las “cirugías abiertas” previamente planificadas de antebrazos (por ejemplo, reparación de fracturas óseas), donde los músculos estaban completamente expuestos y un cirujano fue capaz de visualizar la estructura muscular y diseccionar cuidadosamente muestras relativamente grandes y estructuralmente intactas de tejido muscular (15 mm x 5 mm x 5 mm). Esta técnica de “biopsia abierta” se ve favorecida cuando los participantes se someten a un procedimiento previamente planeado, por lo que limita el grupo de participantes potenciales, especialmente para adultos sanos, donde de lo contrario no se realizarían cirugías. Por lo tanto, muchas biopsias realizadas con fines de investigación se realizan como un procedimiento ambulatorio y el sitio de incisión se mantiene lo más pequeño posible para limitar el riesgo de infección, cicatrices, y el tiempo de curación. Por lo tanto, la mayoría de las biopsias se recogen ciegamente (es decir, el operador no puede ver la aguja de recolección a medida que pasa a través de la fascia en el músculo). Esto implica que la calidad de la biopsia se basa casi en su totalidad en la habilidad y experiencia del operador. Cada músculo tiene sus propias dificultades al recolectar tejido, como los riesgos de violar los nervios y los vasos sanguíneos, la selección de una profundidad y ubicación de recolección ideal, y decidir una posición corporal adecuada para mantener el músculo lo más flojo posible. Desafortunadamente, la mayoría de los conjuntos de habilidades específicos del músculo no están escritos y por lo tanto cada médico debe “reinventar la rueda” al realizar biopsias en los músculos nuevos para ellos. Esta falta de experiencia generalmente conduce a varias colecciones con baja calidad hasta que el médico identifica las mejores prácticas para biopsias en ese músculo. Los médicos novatos a menudo aprenden la habilidad a través de conversaciones con sus colegas más experimentados, pero existen relativamente pocos textos informativos y revisados por pares sobre el asunto, especialmente para los músculos que no se utilizan tradicionalmente para la recolección de biopsias. Si consideramos la información anterior, junto con la dificultad de reclutar voluntarios humanos para biopsias, está claro que se necesita más información didáctica que maximice las posibilidades de éxito para cada participante.

Por lo tanto, el propósito de este artículo era presentar una técnica de biopsia muscular que proporciona protocolos para la recolección exitosa de biopsias musculares con fragmentos de fibra largos y no dañados para pruebas mecánicas. Las biopsias musculares humanas generalmente se llevan a cabo, y la mayor parte del material de entrenamiento de biopsia está en, el musculus vastus lateralis. Su tamaño muscular relativamente grande y su ubicación superficial en relación con la piel permite la acumulación de tejido muscular adecuado, minimizando al mismo tiempo el malestar del paciente y el trauma físico^1,,21. Sin embargo, hay algunas limitaciones en el uso de los vastus lateralis para estudios de entrenamiento longitudinal. Por ejemplo, durante los protocolos experimentales que incluyen un programa de capacitación, los participantes deben abstenerse de una formación adicional fuera del estudio durante un período que a menudo abarca 2-6 meses. Para los atletas, esto a menudo no es posible, ya que el vastus lateralis se entrena generalmente durante los ejercicios típicos (por ejemplo, sentadillas, saltos), o se utiliza generalmente para el deporte (por ejemplo, correr, ciclismo). Estas experiencias de entrenamiento separadas lejos del objetivo del estudio pueden causar adaptaciones musculares que alteran la mecánica muscular, la arquitectura y la fisiología de tal manera que es difícil o imposible conocer el verdadero efecto del protocolo experimental del estudio sobre las propiedades musculares. Para este tipo de estudios, sería ideal seleccionar un músculo objetivo que a menudo no es el foco de los regimientos de entrenamiento. El musculus tibialis anterior (TA) es un músculo objetivo ideal que satisface los requisitos anteriores. Además, las intervenciones de entrenamiento se pueden orientar hacia la TA mediante enfoques controlables, como con el uso de un dinamómetro. Casi no hay material de entrenamiento relacionado con una biopsia muscular TA. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo modificado para recoger biopsias musculares relativamente indesadas de la TA.

Protocol

NOTA: A continuación, delineamos un protocolo para cosechar fibras mecánicamente intactas de la TA de voluntarios que fueron inscritos en un estudio en curso separado. Este protocolo es similar al descrito por Shanely et al.3, que han descrito la técnica modificada de Bergstrom en vastus lateralis. La información presentada aquí ha sido refinada por nuestro grupo de investigación, pero puede no ser ideal para todos los grupos de laboratorio o configuraciones organizativas. Damos sólo pautas…

Representative Results

El compromiso de tiempo completo para un participante fue de aproximadamente una hora (consulta de 10 minutos, ultrasonido de 10 min, preparación de cirugía de 20 minutos y administración anestésica, cirugía de 10 minutos y recuperación de 10 minutos). A menudo, los participantes activan inconscientemente su TA y necesitaron recordatorios consistentes para mantener el músculo lo más relajado posible. Cuando la aguja de la biopsia estaba dentro del músculo, los participantes generalmente reportaron una sensación…

Discussion

En este informe, describimos una técnica para la biopsia de tejido muscular estructuralmente intacto de TA. Encontramos que este procedimiento produce un contenido aceptable de fibras musculares utilizables (5-10 preparaciones de haz de fibra por 50 mg de tejido recogido) para pruebas mecánicas. Además, tuvimos suficiente tejido para experimentos mecánicos, genéticos y proteómicos de seguimiento.

Hay varios métodos típicamente utilizados para la recolección de biopsias musculares<sup …

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction