Summary

Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Published: August 12, 2020
doi:

Summary

Neonatal farelerin biyolüminesans E. coli O1:K1:H7 ile enfeksiyonu, önemli pulmoner inflamasyon ve akciğer patolojisi ile septik enfeksiyona neden olur. Burada, sistemik bakteriyel yüklerin numaralandırılmasına paralel olarak uzunlamasına intravital görüntüleme, inflamatuar profilleme ve akciğer histopatolojisi ile birlikte neonatal sepsisin modellenmesi ve incelenmesi için yapılan prosedürleri açıklıyoruz.

Abstract

Neonates onlar yaşamın ilk aylarında görüntülemek benzersiz bağışıklık profili nedeniyle bakteriyel sepsis riski altındadır. Yeninelerde yüksek mortalite oranlarından sorumlu bir serotip olan E. coli O1:K1:H7 patogenezinin incelenmesi için bir protokol oluşturduk. Yöntemimizde enfeksiyonun ilerlemesi sırasında farklı zaman noktalarında yenidoğan yavrularının intravital görüntülemesi kullanılmaktadır. Kandaki bakterilerin ölçülmesi, inflamatuar profilleme ve doku histopatolojisi ile paralel lik gösteren bu görüntüleme, sepsis sırasında enfeksiyon dinamiklerini anlamak için titiz bir yaklaşım anlamına gelir. Mevcut raporda, bakteriyel yüklerin karşılaştırılması ve hastalığın şiddetini karşılaştırmak için iki enfeksiyöz inokül modellenmiştir. Subscapular enfeksiyonun enfeksiyon sonrası 10 saat ile yaygın enfeksiyona yol açtığını bulduk. 24 saat, Parlak E. coli enfeksiyonu kan, akciğerler ve diğer periferik dokularda bol oldu. Akciğerlerde inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu 24 saat önemlidir, ve bu hücresel infiltrasyon ve enfeksiyöz doz ile artar doku hasarı kanıt takip eder. İntravital görüntülemenin bazı sınırlamaları vardır. Bu bir Parlak sinyal eşiği ve anestezi sırasında neonates ile ortaya çıkabilecek bazı komplikasyonlar içerir. Bazı sınırlamalara rağmen, enfeksiyon modelimizin yenidoğan mürin sepsisi sırasında uzunlamasına enfeksiyon dinamiklerini anlamak için bir fikir verdiğini ve bugüne kadar iyice incelenmediğini görüyoruz. Biz bu model de erken yaşam sırasında diğer kritik bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir bekliyoruz.

Introduction

Bakteriyel sepsisenfeksiyonakarşı yeterli koruma sağlamaz yaşamın ilk günlerinde benzersiz bir bağışıklık profili sergileyen yeniler için önemli bir endişe 1 . Yenidoğan sepsis önemli bir ABD sağlık sorunu sadeceABD’deyılda 75.000 ‘den fazla vaka için muhasebe olmaya devam ediyor 2 . Bu enfeksiyonları derinlemesine incelemek için, insan hastalığının yönlerini özetleyen yeni hayvan modelleri gereklidir. Biz Escherichia colikullanarak bir neonatal fare enfeksiyonu modeli kurduk , O1:K1:H73. E. coli ABD’de yenidoğan sepsisin ikinci önde gelen nedenidir, ancak sepsis ilişkili mortalite çoğunluğu sorumlu4,5. Ancak, ön dönem ve çok düşük doğum ağırlığı (VLBW) bebekler bağımsızolarak5 olarak kabul edildiğinde önde gelen nedenidir. K1 serotipi en sık invaziv kan dolaşımı enfeksiyonları ve menenjit ile ilişkilidir6,7. Şu anda, antibiyotik ve destekleyici bakım dışında başka bir tedavi seçeneği vardır. Bu arada, antibiyotik direnci oranları birçok patojenik bakteriler için artmaya devam, E. coli bazı suşları ile yaygın tedavide kullanılan antibiyotik çok sayıda dirençli8. Bu nedenle, sepsis ve ev sahibi tepki mekanizmalarını yeniler üzerinde incelemek için yöntemler üretmeye devam etmek zorunludur. Bu sonuçlar mevcut tedaviler ve enfeksiyon sonuçları üzerine geliştirmek için yardımcı olabilir.

Neonatların bağışıklık durumu yetişkinlere göre hem henotibik hem de fonksiyonel farklılıklar ile karakterizedir. Örneğin, interlökin (IL)-10 ve IL-27 gibi anti-inflamatuar ve düzenleyici sitokinlerin yüksek seviyeleri, kordon kanı kaynaklı makrofajlar tarafından üretildiği gösterilmiştir ve9,10,11. Bu, yenidoğan hücrelerinden erişkin retlere göre sıklıkla bildirilen IFN-α, IFN-on, IL-12 ve TNF-α düzeylerinin daha düşük olması ile tutarlıdır10. Ayrıca, neonatal bağışıklık sistemi yetişkinlere göre bir Th2 ve düzenleyici T hücre yanıtı doğru çarpık12. Nötrofil, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve monositlerin yüksek sayıda da neonatlarda mevcuttur, ancak önemli fonksiyonel bozukluklar ile. Bu hücre yüzey belirteçleri ve immaturity13,14,15öneririz antijen sunumu ifade kusurları içerir. Ayrıca, neonatal nötrofiller kemotaktik faktörlere göç etme kabiliyetlerinde önemli ölçüde eksiktir16. Miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MKHK) da neonatlarda yüksek seviyelerde bulunur ve son zamanlarda IL-2711kaynağı olarak gösterilmiştir. MKh’ler T hücrelerine karşı son derece bastırıcıdır17. Bu veriler, yenidoğan bağışıklığında enfeksiyona karşı duyarlılığın artmasına neden olan sınırlamaları toplu olarak göstermektedir.

Neonatal sepsis sırasında bakteriyel yükün ilerlemesini incelemek ve koruyucu konak immün yanıtlarını incelemek için yeni bir enfeksiyon modeli geliştirdik. Yaşamın 3-4 gününde yenidoğan farelerin intraperitoneal uzaya veya kuyruk damarına enjekte etmesi zordur. Bizim modelinde, gün 3 veya 4 yavru skapular bölgeye bakteriyel inoculum veya PBS subkutan olarak uygulanır. Sistemik bir enfeksiyon gelişir ve lüminesanE E. coli O1:K1:H7 kullanarak, periferik dokularda yayılan bakteriyel yükü takip etmek için tek tek yenidoğan farelerini boylamsal olarak görüntüleyebiliriz. Bu, intravital görüntülemeyi kullanarak sepsis sırasında bakterilerin yayılmasının kinetiklerini anlamak için kullanılan ilk rapor edilen modeldir3.

Burada, yenidoğan farelerde septik E. coli enfeksiyonları neden bir protokol tarif3. Bakteriyel inokülün enjeksiyoniçin nasıl hazırlanacağını ve patolojinin değerlendirilmesi için dokunun nasıl hasat edilebildiğini, gen ekspresyonu analizi ile inflamatuar belirteçlerin ölçülmesini ve bakteri yükünün numaralandırmasını anlatıyoruz. Buna ek olarak, enfekte yenidoğan yenidoğanların intravital görüntüleme ve neonatal bağışıklık hücreleri tarafından bakteri öldürme niceliksel için lüminesan E. coli kullanımı da açıklanmıştır. Bu protokoller aynı zamanda yeniniler diğer önemli bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir. Burada sunulan veriler, translatable neonatal sepsis modelinde enfeksiyon dinamiklerini anlamak için genel bir yeni yaklaşımı temsil etmektedir.

Protocol

Tüm prosedürler West Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Araştırma Konseyi18tarafından Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’nun tavsiyeleri doğrultusunda yürütülmüştür. 1. Bakteriyel Inokül Hazırlanması Streak bir Tryptic soya agar (TSA) e. coli O1:K1:H7-lux bir dondurucu stok tek bir koloni izolasyon için bir aşılama döngü ile plaka bu stiferase i…

Representative Results

Bu protokol neonatal farelerde bakteriyel sepsise neden oldu ve hastalığın seyrini incelemek için uzunlamasına intravital görüntüleme, kandaki bakterilerin numaralandırılması, patolojinin histolojik değerlendirmeleri ve inflamatuar sitokin ekspresyon profilleri kullandık. Zaman içinde hem düşük (~2 x 106 CPU) hem de yüksek (~7 x 106 CPU) inokülleri ile enfekte olan yenidoğan yavrularında morbidite belirtileri gözlendi. Daha fazla inokül alan yavrular, hareket kabiliye…

Discussion

Neonatal farelerde bakteriyel sepsisi indükleyen subskapular enfeksiyon modelimiz, bakteriyel patojenlerin uzunlamasına yayılmasını gerçek zamanlı olarak incelemek için yeni bir yöntemdir. İntravital görüntüleme, bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak yenini keşfetme fırsatı sağlar. Bu bakteriyel yayma kinetik anlamak ve daha fazla hastalığın uygun aşamasında konak yanıt ve hasar çalışma için önemlidir. Fare yavrularına bakteriyel inokülin subskapular enjeksiyonu deri altı, subskapu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Kurumsal Fonlar tarafından C.M.R.’ye destek ve.M.

Materials

1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

References

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , 69 (2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Play Video

Cite This Article
Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

View Video