Förbereda och injicera embryon från Culex myggor för att generera nullmutationer med CRISPR / Cas9

Summary

CRISPR/Cas9 används i allt högre grad för att karakterisera genfunktionen i icke-modellorganismer. Detta protokoll beskriver hur man genererar knock-out linjer av Culex pipiens, från att förbereda injektionsblandningar, till att erhålla och injicera myggembryon, liksom hur man bak, korsar och screen injicerade myggor och deras avkomma för önskade mutationer.

Abstract

Culex myggor är de viktigaste vektorerna av flera sjukdomar som negativt påverkar människors och djurs hälsa inklusive West Nile virus och sjukdomar som orsakas av filarial nematoder som hund hjärtmask och elefantasis. Nyligen har CRISPR / Cas9 genomredigering använts för att inducera platsstyrda mutationer genom att injicera ett Cas9-protein som har komplexerats med en guide RNA (gRNA) till nylagda embryon av flera insektsarter, inklusive myggor som tillhör släktena Anopheles och Aedes. Att manipulera och injicera Culex myggor är något svårare eftersom dessa myggor lägger sina ägg upprätt i flottar snarare än individuellt som andra myggarter. Här beskriver vi hur man designar gRNAs, komplex dem med Cas9-protein, inducerar kvinnliga myggor av Culex pipiens att lägga ägg och hur man förbereder och injicerar nylagda embryon för mikroinjektion med Cas9 / gRNA. Vi beskriver också hur man bak och screen injicerade myggor för önskad mutation. De representativa resultaten visar att denna teknik kan användas för att inducera platsstyrda mutationer i arvsmassan hos Culex myggor och, med små modifieringar, kan användas för att generera null-mutanter även hos andra myggarter.

Introduction

Culex myggor distribueras över de tempererade och tropiska regionerna i världen och överför flera dödliga virus inklusive West Nile virus¹, St. Louis encefalit² samt filarial nematoder som orsakar hund hjärtmask³ och elefantiasis⁴. Medlemmar av Culex pipiens komplex, som inkluderar Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens och Cx. pipiens molestus, visar slående variationer i många aspekter av deras biologi. Till exempel, medan Cx. quinquefasciatus och Cx. pipiens molestus är oförmögna att komma in i en övervintrande^{vilande 5,6}, Cx. pipiens pipiens visar robusta säsongssvar och går in i diapause som svar på korta^{dagar 7,8}. Dessutom tenderar Cx. pipiens molestus att vara mer antropofila medan Cx. pipiens och Cx. quinquefasciatus är mer zoofila⁶. Men i USA och på många andra platser i världen interbreed dessa arter, vilket har starka konsekvenser för sjukdomsöverföring som hybrider av Cx. pipiens pipiens och Cx. pipiens molestus är opportunistiska matare och kommer att bita både fåglar och människor⁹, och därmed fungera som brovektorer för West Nile virus. Att studera dessa och andra fascinerande aspekter av Culex myggors biologi har hämmats, delvis för att Culex myggor är något svårare att föda upp i labbet än Aedes myggor, som producerar quiescenta och uttorkningsbeständiga ägg¹⁰ och eftersom funktionella molekylära verktyg inte är lika välutvecklade för Culex arter.

CRISPR / Cas9 genomredigering är en kraftfull teknik som har använts för att utvärdera biologin hos flera viktiga myggarter^11,12,13, inklusive södra husmyggan, Culex quinquefasciatus^14,15,16. Denna teknik, utvecklad av Jennifer Doudna och Emmanuelle Charpentier, utnyttjar ett naturligt bakteriellt försvar mot virus av bakteriellt härledda, CRISPR-associerade endonukleaser (Cas-proteiner; se granskning av Van der Oost et al.¹⁷). När de injiceras i djurembryon kan Cas9-proteinerna i kombination med en lämplig guide-RNA producera dubbelsträngade pauser i genomet. Detta görs oftast genom att använda Cas9-proteinet som är komplext med guide RNAs, som leder endonukleasaktivitet till en specifik region i genomet. Efter att Cas9-proteinet har skapat en platsspecifik dubbelsträngad paus försöker cellulära maskiner reparera avbrottet med hjälp av en av två mekanismer. Den första innebär att ligating de två slutar tillsammans genom icke-homolog end joining (NHEJ), som är felbenägen och ofta producerar utramning och borttagningar i genomet som kan resultera i icke-funktionella proteiner, vilket genererar en knock-out mutation. Alternativt kan cellulära maskiner använda homologistyrd reparation (HDR) genom att hitta liknande sekvenser för att korrekt reparera pausen. Den liknande sekvensen får tillhandahållas av den andra kromosomen i skadegöraren (se översyn¹⁸). Men om den reparerade sekvensen exakt matchar den ursprungliga sekvensen, kommer Cas9-proteinet att kunna skära DNA igen. Alternativt kan forskare också inkludera en donatorplasmid som innehåller homologa sekvenser på vardera sidan av målsekvensens snittplats med en alternativ reparationssekvens - ofta ett fluorescerande markörprotein, modifierad version av den ursprungliga genen eller annan modifiering - som kan kopieras och sättas in i genomet eller "slås in".

Timing är avgörande vid injektion av embryon, och detta är särskilt fallet när man använder CRISPR / Cas9 genomredigering för att skapa mutationer i insekter. Detta beror på att Cas9-proteinet och gRNAs har störst kapacitet att generera mutationer endast när embryot är i sitt synytialtillstånd, innan cellmembran har bildats och när flera atomkärnor är tillgängliga i embryot. För myggor når atomkärnor periferin ~ 2-4 timmar efter oviposition, beroende på temperatur¹⁹, och därför måste framgångsrik mikroinjektion ske före denna tid. Dessutom kommer Cas9-proteinet att skära allt nukleärt DNA som det kan komma åt, så att individen som härrör från injektionen kommer att innehålla en mosaik av celler, vissa har önskad mutation och andra inte. För att dessa mutationer ska kunna ärvas måste Cas9-proteinet skära DNA som finns i bakterien som kommer att ge upphov till framtida ägg och spermier. För att säkerställa att mutationer genereras i bakterien är det bäst att injicera alla material nära polcellernas placering i embryot, som är insektsgroddars föregångare. Polcellerna ligger nära den bakre änden av Culex embryon²⁰. Förutom att injicera embryon är det absolut nödvändigt att utveckla en noggrann plan för att korsa och screening avkommor för att upptäcka önskad mutation.

Detta protokoll beskriver hur man genererar gRNAs och komplexa dem med Cas9-protein för att förbereda injektionsblandningar, liksom hur man inducerar kvinnliga myggor av Culex pipiens att lägga ägg och hur man förbereder och injicerar dessa ägg för CRISPR / Cas9-medierad genomredigering. Dessutom beskriver vi hur man bak- och skärmin injicerade embryon och deras avkomma för att bekräfta att den önskade mutationen har erhållits. Med hjälp av detta protokoll genererade vi nullmutationer för en gen av intresse, cykel, i Buckeye-stammen av Culex pipiens. Denna stam etablerades ursprungligen 2013 från fältinsamlade myggor i Columbus, Ohio och underhålls av Meuti-labbet. Detta protokoll kan användas för ytterligare studier som kräver CRISPR / Cas9 genomredigering i Culex myggor, liksom andra myggarter, och mer allmänt är relevant för att använda CRISPR / Cas9 genomredigering till alla insektsarter.

Protocol

I de flesta forskningsinstitutioner måste ett godkänt biosäkerhetsprotokoll finnas på plats innan transgena insekter genereras eller upprätthålls för att säkerställa att genetiskt modifierade organismer inte kommer att fly eller avlägsnas från laboratorieanläggningen. Ytterligare statliga bestämmelser kan också gälla. Innan du påbörjar ett projekt av detta slag, kontrollera alla institutionella riktlinjer och förfaranden för att avgöra vilka dokument och godkännanden som krävs.

1. Designa gRNAs och förbereda injektionsblandningar

1. Designa 2-5 gRNAs för varje målgen eftersom vissa gRNAs fungerar bättre än andra. gRNAs som riktar sig mot en gen av intresse kan antingen utformas manuellt eller gratis program, till exempel Chop-Chop, kan användas.
2. Designa och beställa primers som kommer att förstärka 100-200 bp fragment runt varje gRNA. Helst bör den skurna platsen placeras ungefär i mitten av tredjedelen till hälften av PCR-produkten. Observera hur många bp på varje plats i snittet som kommer att produceras.
3. Skaffa gRNAs.
   1. Köp gRNAs från kommersiella företag som Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript och andra. Detta är det enklaste alternativet.
   2. Alternativt kan du skapa gRNAs i labbet med PCR-förstärkning för att generera mallarna för efterföljande isotermisk syntes. Se protokollet som beskrivs i port et al.²¹ och Kistler et al.²².
   3. Ge gRNAs via plasmid som injiceras i embryon. I detta fall bör gRNA drivas av U6-promotorn (se ^23,24 för detaljer).
4. Få Cas9-proteinet.
   1. Beställ Cas9 kommersiellt från flera företag inklusive Fisher Scientific. Detta är det enklaste alternativet.
   2. Gör Cas9 protein och rena i labbet enligt Basu et al.²⁵ och Kistler et al.²².
   3. Injicera Cas9 mRNA i embryon, där det senare kommer att översättas till aktivt Cas9-protein. Cas9 mRNA kan antingen syntetiseras i labbet med in vitro-transkription²² eller köpas från leverantörer som Sigma.
      OBS: Det översatta Cas9-proteinet måste innehålla en nukleär lokaliseringssignal (NLS) på C-ändstationen, och därför måste NLS också finnas i det injicerade Cas9 mRNA.
   4. Express Cas9 protein in vivo genom plasmid-baserade uttryck. I det här fallet är det bäst att ha Cas9-uttrycket på plasmiden driven av en embryonal promotor som har varit väl karakteriserad i målarten.
      OBS: Hittills har embryonala promotors inte varit väl karakteriserade i Culex myggor, och därför injicerar renade protein eller Cas9 mRNA rekommenderas.
5. Komplex gRNAs med Cas9 proteinet, anpassat från Kistler et al.²².
   1. Om du injicerar Cas9-protein med gRNA tillsammans (rekommenderas), se till att de slutliga koncentrationerna av Cas9-protein är 300 ng/μL och den slutliga koncentrationen av ett enda gRNA är 80 μg/μL. Blanda proteinet och ett enskilt gRNA i ett 0,2 ml PCR-rör.
   2. Inkubera i 20 minuter på is.
6. Testa gRNAs med en in vitro-analys (t.ex. Guide-it sgRNA Screening Kit).
   1. Förstärk fragmenten runt den skurna platsen för varje gRNA med PCR.
   2. Kör PCR-produkterna på en gel för att säkerställa att de är rätt storlek. Rena sedan PCR-produkter och sekvensera dem för att säkerställa att de riktar in sig på rätt genregion.
   3. Blanda 200 ng av den överblivna renade PCR-produkten med 1 μL Cas9-reaktionsbuffert, 1 μL BSA, 1,5 μL komplex Cas9:gRNA och för den totala reaktionsvolymen till 15 μL. Inkubera i 5 min vid 37 °C.
   4. Kör produkten på en gel igen. Om Cas9-proteinet framgångsrikt skär PCR-produkten, bör det primära bandet verka vara svagare och ytterligare mindre band bör finnas. Observera minskningen av storleken på den ursprungliga PCR-produkten och beräkna, om så önskas, minskningen av bandets intensitet för att approximera skäreffektiviteten.
7. Förbereda den slutliga injektionsblandningen
   1. För varje gRNA som framgångsrikt skär sin riktade PCR-produkt, blanda volymer av varje Cas9 och gRNA i ett 0,5 ml-rör så att den slutliga volymen förblir 300 ng/μL Cas9-protein och 80 ng/μL av varje gRNA.
   2. Förvara den komplexa Cas9 och gRNAs vid -80 °C tills de behövs för injektion.

2. Dra och avfasa nålar

OBS: Framgångsrika injektioner och embryo överlever kräver vassa nålar (figur 1).

1. Använd antingen 1 mm borosilikat eller kvartsglasmikrokaljar. Silikonisera mikrokapillärerna i en kemisk rökhuv innan du dras.
   1. I korthet, placera 3 ml Sigmacote i en glasbägare och vakuumdrag i en andra bägare som innehåller glasmikrokalyerna i minst 4 timmar, så att silikoniseringslösningen kan förångas och sätta sig på alla ytor i mikrokapillärerna.
   2. Därefter, låt långsamt vakuumkammaren utjämna till omgivningstryck genom att gradvis öppna kranventilen och låta luft återvända in i kammaren. Nålarna är sedan redo att dras.
   3. Läs alltid bruksanvisningen för nåldragare före användning.
      OBS: Instruktionerna nedan beskriver hur du använder en P-2000 Laser Needle Puller för att dra glasnålar. Det är viktigt att notera att alla nåldragare även av samma märke inte är kalibrerade för att dra exakt samma nål över olika enheter. Nyckeln till att få bra nålar är att börja med en viss uppsättning parametrar och sedan dra nålar med parametrar som ligger över och under dessa värden. Testa nålarna vid var och en av dessa parametrar genom att utvärdera hur väl nålen genomborrar embryon och hur väl injektionsblandningen strömmar från nålen. Förfina parametrarna tills en nål erhålls som är lätt att öppna eller avfasa, som genomborrar embryon smidigt och som ger injektionsblandning lätt.
2. Dra nålar med P-2000 lasernåldragare
   1. Slå på lasernålsdragaren och låt lasern värmas upp i 15 minuter innan första dragningen.
   2. Programmera maskinen för typen av mikrokapillärrör i glas (Kom ihåg att alla nåldragarparametrar är en utgångspunkt eftersom nåldragare inte är kalibrerade för att producera samma nål över alla dragmaskiner):
      Kvarts: Värme = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
   3. Efter programmering av nåldragaren, ladda ett mikrokapilleri och kläm fast det på plats, var noga med att bara röra änden av mikrokapillärröret och inte det område som kommer att värmas upp av lasern.
   4. Efter fastspänning av mikrokapilleriet, placera tummen och pekfingret på fingerstängerna och släpp sedan dragstängerna genom att trycka på fjäderutlösningen en i taget.
   5. Tryck tumme och pekfinger för att dra ihop stängerna helt.
   6. Placera den andra sidan av mikrokapillärröret i klämman så att en liten del av röret sträcker sig från båda sidor. Dra åt klämmorna och se till att båda klämmorna är fingertäta och att de håller "dragstängerna" ordentligt på plats.
   7. Stäng skyddshöljet på pullern.
   8. Tryck på pull-knappen så börjar lasern värma upp glaset, vilket indikeras av det röda "laser på"-ljuset som sitter under svepningen. Dragningen slutförs när dragstängerna är helt separerade, åtföljda av en metallisk duns.
   9. Se till att "laser på"-lampan inte tänds innan du lyfter svepningen.
   10. Håll den lilla änden av mikrokapillärröret som sträcker sig bortom klämman med tumme och pekfinger och lossa klämman. Lyft sedan ut mikrokapillärröret ur klämman.
   11. Använd tång för att försiktigt placera mikrokapillärröret i en fyrkantig Petri-skål fodrad med dubbelsidig tejp. Se till att nålen placeras i hållboxen så att nålens baksida först och nålen försiktigt sänks på plats så att den vassa spetsen inte skadas.
3. Dra nålar med en PC-10/PC-100 nåldragare
   1. Ställ in PC-10-pullern med 4 vikter och ställ in tempen på 50,4 °C för en enkelstegsdragning.
   2. Placera en borosilikatglasmikrokalj i den övre klämman. Lyft sedan upp den viktade bottenklämman på plats och kläm fast den nedre delen av mikrokapillären och se till att kapillären är i position för att dra två bra nålar. Detta är en ganska lång dragcykel, men det ger bra nålar för avfasning.
4. Avfasande nålar.
   OBS: Denna metod för våtfasning ger feedback i realtid om nålens relativa öppningsstorlek.
   1. Montera slipplattan och hållareringen på nålens faser. Se till att den grå sidan av slipplattan är orienterad uppåt mellan den övre och nedre låsringen. Dra åt skruvarna på låsringen, växla från skruv till skruv för att säkerställa att varje skruv dras åt jämnt. Slipplattan och låsringarna kommer nedan att kallas slipenheten.
   2. Placera 13 droppar (~ 520 μL) piedestalolja på den optiska plana ytan och placera sedan slipenheten ovanpå plattan. Placera monteringen under ett dissekerande mikroskop och slå sedan på fasaren. Lite extra olja jämfört med Sutters rekommendation används, eftersom detta håller slipplattan snurrande under en längre period när den används i samband med denna våta avfasningsmetod.
   3. Tillsätt 1% Photo-Flo-lösning till slipytan och flytta veken på plats så att den är nedsänkt i Photo-Flo-lösningen.
   4. Slå på luften vid huvudkällan. Placera sedan en dragen borosilikatnål i hållaren och dra åt låsringen. Slå på luften vid regulatorn och öka tills trycket har nått 26 PSI.
   5. Titta från sidan, sänk nålen med den grovjusteringsratten tills den nästan vidrör Photo-Flo flytande yta.
   6. Justera mikroskopet för att hitta nålen i synfältet. Börja med den lägsta förstoringen och öka förstoringen. Justera försiktigt nålens position med hjälp av den grovjusteringsratten tills den bara vidrör ytan på Photo-Flo-vätskan.
   7. Använd den grovjusteringsratten och fortsätt att titta under mikroskopet, sänk nålen tills den är nära slipytan men rör den inte.
   8. Använd den fina justeringsratten, sänk försiktigt och långsamt nålen, var uppmärksam på nålen och skuggan den lämnar på faserns slipande yta. När nålen och dess skugga ser ut som om de är på väg att röra vid slipytan, fortsätt att sänka nålen ännu långsammare och mer noggrant.
   9. Växla mellan att låta nålen "avfasa" genom att sänka den på slipytan och sedan höja den. Innan nålen höjas, notera snabbt inställningen på mikrometern på finjusteringsratten så att nålen kan sänkas till samma läge eller vid behov till ett något lägre läge. Kom ihåg att hålla nålen under det flytande skiktet Photo-Flo. När nålen har höjts över slipytan, stoppa och starta snabbt om fasningsens rotation för att kontrollera om det finns bubblor. Om nålen har fasats ut på lämpligt sätt ska luftbubblor strömma ut från nålen och in i Photo-Flo. Om plattan inte stoppas kommer bubblor sannolikt inte att bli synliga förrän nålöppningen är för stor.
   10. Om inga bubblor uppstår när nålen höjs över slipytan och fasaren har stannat, upprepa avfasningsproceduren, sänk nålen till ett något lägre läge på mikrometern som sitter på den fina justeringsknappen, höja nålen, stoppa fasningsplattan och kontrollera luftbubblor. Upprepa tills en liten men stadig ström av bubblor visas.
   11. När luftbubblor finns, kontrollera den relativa öppningsstorleken genom att stoppa slipplattan och sänka lufttrycket, och notera den PSI vid vilken bubbelbildningen stannar, eftersom detta är en relativ indikation på storleken på öppningen av de fasade nålarna. Ju lägre tryck vid vilket luft slutar fly från nålspetsen, desto större blir nålöppningen. Nålar som avfasas till den punkt där bubblor slutar fly från nålen vid 18-20 PSI indikerar att nålen har en relativt liten öppning och bör orsaka minimal skada på ett embryo när det används för mikroinjektioner.
   12. När du har kontrollerat nålöppningen, öka lufttrycket till 26 PSI för att förhindra att vätska kommer in i nålen. Lyft sedan nålen upp och ut ur Photo-Flo-skiktet med hjälp av den grovjusteringsratten. Det är viktigt att notera att så länge luft strömmar ut ur nålen kommer Photo-Flo inte in i nålen, och därför är nålens insida skyddad från förorening.
   13. När nålen är ute ur Photo-Flo, stäng av luften och ta bort nålen från nålhållaren.
   14. Använd tång, placera den nyfasade nålen i en petriskål som antingen har dubbelsidig tejp eller modelleringslera för att hålla den på plats. Upprepa processen tills 10-20 avfasade nålar har producerats.

3. Blodmatning föräldragenerationen av myggor

1. Bakre larver av Cx. pipiens myggor under otvetydiga långa dagförhållanden (>13 h ljus / dag) vid 25-27 ° C för att säkerställa att myggor inte kommer in i sin övervintrande vilande vilande eller diapause.
2. Sju till tio dagar efter topp vuxen uppkomst, förbered Hemotek Membrane utfodringssystem genom att ansluta värmeenheterna i strömförsörjningen. Justera temperaturen för varje enhet till 37 °C (inre kroppstemperatur för människa) eller 41 °C (kycklingens inre kroppstemperatur) med hjälp av justeringsskruven på enhetens överdel. Se till att rätt temperatur har uppnåtts med hjälp av en elektrisk termometer.
3. Förbered blodmjölsbehållaren för utfodring.
   1. Skär en kvadrat parafilm för varje blodmatande cylinder och gnugga parafilm mot bara fötter. Detta ger dofter som är attraktiva för myggorna.
   2. Sträck parafilmen så tunt som möjligt och linda kanterna tätt runt måltidsbehållaren. Om så önskas, säkra på plats med en O-ring av gummi.
   3. Tillsätt cirka 200 μL 0,1 M ATP-lösning till 15 ml färskt eller tinat helt, natriumcitratbehandlat kycklingblod. ATP hjälper till att stimulera blodmatning, och natriumcitrat förhindrar att blodet koagulerar.
   4. Håll behållaren så att parafilmsidan är vänd nedåt och använd försiktigt en engångspipett för att fylla behållaren. Varje reservoar rymmer ~ 3 ml blod. Försegla påfyllningsportarna med plastpluggar.
   5. Skruva in måltidsreservoarerna i värmeenheterna och placera ovanpå myggburen så att parafilmsidan är vänd nedåt och myggorna kan mata genom nätet.
4. Täck burarna med svarta soppåsar för att simulera skymning och blåsa kraftigt in i varje bur eftersom den ökade CO_{2-koncentrationen} stimulerar blodmatning.
5. Håll mataren på buret i 2-8 timmar för att maximera blodmatningen. Kontrollera regelbundet och notera andelen kvinnor som har tagit en blodmåltid (uppenbart genom deras röda och distended bukar).

4. Inducera äggläggning i vuxna myggor

1. Fyra till fem dagar efter blodmatning, förbered ett 50 ml koniskt rör för myggoviposition.
   1. Skapa ett ~20 mm hål nära botten av det koniska röret.
   2. Täck hålet med två rutor (35 mm²⁾tanddammgummi, en med en horisontell slits och en annan med en vertikal slits. Använd tejp för att fästa tanddammens rutor på det koniska röret.
   3. Placera ett filterpapper på 4,25 cm på en petriskål på 35 mm x 10 mm och blöta filterpapperet med 750 μL destillerat vatten.
   4. Vänd det koniska röret på filterpapperet och vrid fram och tillbaka några gånger för att säkerställa att det är säkert.
2. Använd en munaspirator för att försiktigt ta bort ~ 10 honor av Cx. pipiens från sin bur och överföra dem till det beredda koniska röret.
3. Placera en ogenomskinlig cylinder över det koniska röret för att ge myggen mörker eftersom detta stimulerar äggläggning och väntar 20-25 minuter.

5. Mikromanipulera nylagda Culex-ägg

1. Förbered bilden för att fästa myggembryon för mikroinjektion.
   1. Fäst en bit dubbelsidig tejp på bredden på ett täckglas.
   2. Fäst en tunn remsa av genomskinlig medicinsk förband (t.ex. Tegaderm, 2-3 mm bred) på den dubbelsidiga tejpen så att den löper parallellt med täckglasets korta ände och placeras ca 5 mm från lockets ände.
   3. Ta bort överflödig dubbelsidig tejp med ett vasst rakblad och ta bort 2-3 mm medicinsk dressing och dubbelsidig tejp från varje ände av täckglaset. Detta gör att ett lager olja kan förbli på glid efter att äggen har monterats på täckglaset.
   4. Använd en vaxpenna och rita en "D"-form runt det dubbelsidiga tejpen och remsan av medicinsk dressing. Detta kommer att fungera som ett hinder för att hålla vattnet runt äggen efter injektionen.
2. När rutschkanan har förberetts och 20-25 minuter har gått, ta bort det ogenomskinliga röret och bestäm om myggorna har lagt några ägg eller inte.
   1. Om inte, täck dem i ytterligare 5-10 minuter.
   2. Om myggorna har lagt ägg, lyft försiktigt men snabbt det koniska röret och täck med ett lock. Placera myggorna i en separat bur och registrera tiden då ägg samlades in på ett kalkylblad. Tillsätt sedan 50-100 μL DI-vatten till filterpapperet som innehåller äggflottarna.
3. Under ett dissekerande mikroskop rada upp äggen.
   1. Placera ett filterpapper (10 mm x 30 mm rektanglar avskurna från grovfilterpapper med snabb flödeshastighet) under ett 24 mm x 40 mm täckglas så att täckglaset täcker 50-60% av filterpapperets vänstra sida.
   2. Blöt filterpapperet med 50 μL DI-vatten. Vattnet sprids långsamt under täckglaset, vilket skapar en reservoar för att hålla filterpapperet och äggen våta under mikromanipulation. En menisk bildas mellan täckglaset och filterpapperet när rätt mängd vatten appliceras.
   3. Separera äggen från sina äggflottar med en fin pensel och placera så att embryots smala, bakre ände vidrör täckglaset (vänster) och den bredare, främre änden är till höger.
   4. Justera ägg i 20 minuter, observera noggrant förändringen av deras färg från en mjölkvit till en mycket ljusgrå. Inspektera rutinmässigt vattenfilmen under täckglaset för att säkerställa att det finns en tillräcklig mängd vatten. Om äggen verkar torka ut, tillsätt en liten mängd DI-vatten (20-30 μL) till filterpapperet.
   5. Efter 20 min, kassera alla återstående ägg.
4. Överför äggen till mikroinjektionsrutschbanan.
   1. Använd ett litet (10 mm x 30 mm) stycke grovfilterpapper för att transportera vatten från sidan av det mättade filterpapperet och ta bort det onda filterpapperet med tång. Upprepa 2-3 gånger för att säkerställa att filterpapperet med äggen är så torrt som möjligt.
   2. Lägg en frisk, torr rektangel av filterpapper och håll den på plats med ett par tångar. Dra försiktigt bort täckglaset till vänster, bort från de justerade äggen.
   3. Torka överskottsvattnet på scenen utan att störa det lilla filterpapperet som innehåller de justerade äggen. Fortsätt att torka det våta filterpapperet med äggen flera gånger till och tryck på filterpappers små rektanglar med tummar och/eller tång, för att säkerställa att äggen är så torra som möjligt innan de överförs till injektionsrutschbanan.
   4. Använd tång, ta bort papperet som backar av remsan av medicinskt förband från monteringsrutschbanan.
   5. Håll monteringsrutschbanan med tumme och långfinger och den exponerade medicinska förbandet vänd nedåt och sänk i 45° vinkel på linjen med justerade ägg. Placera glidningen så att äggens bredare, främre ände (vänster) hänger något från slutet av det medicinska förbandet, eftersom detta förbättrar Culex larvernas förmåga att framgångsrikt kläcka från de monterade äggen.
   6. Tryck pekfingret mot täckglasets undersida, samtidigt som du fortsätter att hålla täckglaset mellan tummen och långfingret, för att säkerställa att alla justerade ägg är ordentligt fastsatta på det medicinska förbandet.
   7. Vänd omedelbart täckglaset så att äggen är vända uppåt och applicera ett tunt lager olja Halocarbonolja (2-3 droppar; ~ 20 μL) på äggen. Detta förhindrar att äggen avtorkar under mikroinjektion. Ta bort ägg som inte är fästa vid det medicinska förbandet eller som inte täcks av oljan.
   8. Placera glasskyddet med de monterade äggen vända upp inuti en fyrkantig Petri-skål med en stor kvadrat våtfilterpapper för transport för mikroinjektion.

6. Injicera Culex embryon

1. Fylla injektionsnålarna med injektionsblandningen
   1. Välj ett nålfyllmedel eller gelbelastningsspets som enkelt passar in i baksidan av den valda injektionsnålen och kommer att ha lite utrymme mellan slutet av nålfyllmedlet och injektionsnålen.
   2. Placera försiktigt en enda och liten droppe injektionsblandning (~ 0,5-1 μL) i injektionsnålen med hjälp av nålen för att fylla nålen igen. Placera droppen av injektionsblandningen nära där injektionsnålen börjar avsmalna.
2. Fäst injektionsnålen på mikroinjektorn.
3. Placera diabilden som innehåller embryona på mikroskopets scen.
4. Öppna nålen
   OBS: Om du använder avfasade nålar är detta inte nödvändigt.
   1. Använd ett startinjektionstryck på ~30 PSI och justera vid behov för att leverera en lämplig volym injektionsblandning.
   2. Placera nålen ovanför embryot under ett dissekeringsmikroskop och använd försiktigt mikromanipulatorn för att sänka nålen på embryot. När nålen knappt vidrör embryot, flytta snabbt embryot vinkelrätt mot nålens långa axel.
   3. För att avgöra om nålen har öppnats framgångsrikt trycker du på injektionsutlösaren och ser om några bubblor/injektionsblandningar kommer ut ur nålen. Om inte, upprepa att flytta embryot mot nålen tills nålen är öppen och injektionsblandningen kommer ut när avtryckaren trycks in.
5. Injicera embryona
   1. Placera det första embryot i linje i mitten av vyn i mikroskopet och se till att det är i fokus.
   2. Placera nålen över det första ägget, också inom mitten av synfältet i mikroskopet.
   3. Öka gradvis förstoringen på mikroskopet och sänk försiktigt nålen för att hålla den strax ovanför det första embryot, centrerat och i fokus. Fortsätt tills mikroskopet har nått sin högsta förstoring och både embryot och nålen är i fokus.
   4. Flytta försiktigt embryot på scenen något till vänster och sänk nålen något så att nålen och embryot nu är i samma synplan.
   5. Använd mikroskopstadiet för att flytta embryot, rör försiktigt embryot till nålens spets. Embryots smala, bakre ände bör avleda något. Justera nålens höjd om den är för hög eller för låg.
   6. Använd mikroskopstadiet, flytta embryots bakre ände på nålen och observera nålen som tränger in i myggäggets korrion. Nålen ska bara tränga in i membranet på den ungefärliga platsen för polcellerna i Culex-embryon. När detta inträffar, tryck på injektionsutlösaren 1-3 gånger för att skjuta injektionsblandningen i embryot. Leverera en liten mängd injektionsblandning, precis tillräckligt för att en liten rensning i embryoplasman kan detekteras.
   7. Använd scenen och flytta embryot till höger, bort och från nålens spets. Om injektionen gick bra, bör lite eller ingen vätska läcka från embryot.
   8. Flytta ner scenen så att nästa embryo i linjen placeras framför nålen. Flytta sedan scenen till vänster, placera embryot på injektionsnålen och tryck injektionsutlösaren.
   9. Om injektionsblandningen inte verkar komma ut och/eller om en stor mängd vätska kommer ut ur embryot efter att nålen har tagits bort, byt ut injektionsnålen och börja om.
   10. Förstör eventuella oinsprutade eller skadade ägg.
6. Sköta till embryona post-injection
   1. När alla embryon på diabilden har injicerats, tvätta av Halokarbonoljan genom att applicera omvänd osmosvatten med en sprutande flaska, så att vattenströmmen riktas på toppen av glaslocket ovanför de injicerade embryona och låta vattnet strömma ner i täcket och över embryona för att skölja bort oljan. Se till att inte rikta vattenströmmen direkt på embryona eftersom detta kan skada eller lossa dem från det medicinska förbandet. Denna process tar bort de flesta, men inte alla, halokarbonolja.
   2. Täck rutschkanan med 150 μL DI-vatten.
   3. Placera diabilden med de injicerade embryona på våtfilterpapper inuti en fyrkantig Petri-skål.
   4. Placera Petri-skålen som innehåller de injicerade embryona i en miljökammare inställd på 25-27 °C, 70-80% RH med en lång dag fotoperiod (>13 h ljus / dag).

7. Uppfödning av injicerade embryon (F₀₎till vuxen ålder och upprättande av kors

1. Undersök bilderna av injicerade embryon dagligen och förvänta dig att 1^st instar larver bör dyka upp 1,5 dagar efter injektionen.
2. Räkna antalet 1^st instar larver och placera 100-200 larver i en skokartongstor Tupperware-behållare med 450 ml DI-vatten och 50 mg mald fiskmat. Vid denna tidpunkt, skapa 1-5 gånger fler behållare som innehåller vilda eller ej injicerade larver som kommer att användas för att korsa med de injicerade myggorna.
3. Mata larverna dagligen, något öka mängden mat de får varje dag tills de når 300-500 mg på den^{6: e} dagen av larvlivet.
4. När popp visas, använd en överföringspipett för att placera en pupp i ett 2 ml mikrocentrifugrör fyllt 50-75% fullt av DI-vatten. Upprepa för alla puppar, både popparna som injicerades som embryon samt opinjected, vilda puppar. Tryck försiktigt på locken så att de är något på glänt, vilket hindrar myggorna från att fly men fortfarande möjliggör en liten mängd gasutbyte.
5. När de vuxna myggorna dyker upp i sina mikrocentrifugrör, släpp injicerade kvinnliga myggor i en bur som innehåller jungfruliga vilda manliga myggor, vilket uppnår ett förhållande på minst 1 vild typ hane för varje injicerad kvinna. På samma sätt, släpp injicerade manliga myggor i en bur som innehåller jungfruliga vilda kvinnor, vilket uppnår ett förhållande på cirka 5-10 jungfruliga vilda kvinnor för varje injicerad hane. Ett högre förhållande mellan vilda honor och injicerade män rekommenderas eftersom varje manlig mygga kan kompisera flera gånger. Därför ökar antalet F1-avkomma som kan produceras med högre antal vilda honor som parar sig med injicerade män.

8. Erhålla och föda upp F_{1 myggor} och screening dem för mutationer

1. Sju till tio dagar efter vuxnas uppkomst, erbjud en blodmåltid till kvinnorna i varje bur enligt beskrivningen ovan (steg 3).
2. Fyra dagar efter blodmatning, placera oviposition vatten i varje bur. Varje äggflotte representerar avkomman till en enda kvinnlig mygga och bör därför placeras i sin egen plast, skokartongstor uppfödningsbehållare strax efter oviposition. Märk varje behållare med en unik identifierare och ange också att larverna tillhör F_{1-generationen} för den gen som är av intresse, oavsett om den manliga eller kvinnliga föräldern injicerades, det datum då pannan fastställdes, uppfödningsförhållanden och experimenterarens initialer.
3. Övervaka larvernas pannor dagligen. Så snart larverna kläcker i pannorna, ge 50 mg mald fiskmat. Öka maten dagligen i 6 dagar enligt beskrivningen ovan (steg 7.3).
4. Överför enskilda poppar till 2 ml mikrocentrifugrör som innehåller mellan 1-1,5 ml DI-vatten, märk varje rör och knäcker locken.
5. När de vuxna myggorna dyker upp, öppna försiktigt 2 mL mikrocentrifugröret, täck med ett pekfinger och använd den andra handen, placera en 3 dram glasflaska över toppen av mikrocentrifugröret. Myggans naturliga instinkt bör vara att flyga upp och in i glasflaskan. När detta händer, skjut ett finger över glasflaskan och vänd den snabbt och placera en liten bomullstuss som har blivit något våt med 10% sackaroslösning i toppen av injektionsflaskan. Detta förhindrar myggan från att fly och ger en nödvändig mat- och vattenkälla.
6. Märk både röret som innehåller pupal exuvia och glasflaskan som innehåller den vuxna myggan för att indikera larvpannan från vilken den härstammar, myggans kön och den unika identifieraren för den personen. Ex: II.C.M32, där "II" representerar att den manliga föräldern injicerades, "C" representerar den pan/äggflotte från vilken individen härstammar, och "M32" betecknar att det var den 32: a^hanen som kom ut ur den larvuppfödningsbehållaren.
7. Placera vuxna myggor i sina enskilda glasflaskor tillbaka i miljökammaren och tillsätt en liten mängd (~ 20 μL) av 10% sackaroslösning till deras bomull dagligen. Var noga med att inte övermata eller mätta bomullen eftersom myggorna kommer att fastna i sackaroslösningen och dö.
8. Screening myggor för önskad mutation
   1. Extrahera genomiskt DNA från 5-10 pupal exuvia från varje äggflotte / panna av larver med Phire Direct PCR Kit enligt tillverkarens instruktioner, liksom 1-2 vilda individer som kommer att fungera som en kontroll.
      OBS: Eftersom avkomman från varje flotte sannolikt är fulla syskon, kommer screening 5-10 larver från varje panna att avgöra om mutationen har förts vidare till avkomman. Om ingen av de screenade larverna från en panna har önskad mutation, screena inte ytterligare vuxna. Om några av larverna har mutationen, bör varje individ från den pannan screenas.
   2. Med hjälp av de tidigare utformade PCR-primersna (steg 1.2), förstärk fragmentet runt den förväntade platsen för din mutation med Phire PCR-kitet i både vilda och F1-avkomman och kör PCR-fragment på en 3-4% agarose gel för att avgöra om det finns några synliga infogningar eller borttagningar (indels).
      OBS: Alla individer som har önskad mutation kommer att vara heterozygous och bör visa 2 band, en vild typ och en antingen något kortare eller längre i önskat läge. För att skilja dessa, jämför positionen och tjockleken på banden hos de vilda individerna med de i banden i F1-avkomman. Helst kommer 2 diskreta band att vara synliga, men om indel är mycket liten kan bandet verka bredare och / eller suddigare.
   3. Rena PCR-produkten antingen genom att excisera bandet som innehåller de misstänkta outddarna (rekommenderas) eller genom att rena den återstående PCR-produkten som inte har laddats i gelén. Skicka in den renade PCR för sekvensering för att avgöra om den önskade mutationen finns.

9. Erhålla och föda upp F_2- och F_3-myggor och sålla dem efter mutationer

1. Släpp alla F₁ vuxna myggor för vilka den önskade mutationen hittades genom att undersöka sin pupal exuvia från sina enskilda glasflaskor och i en bur som innehåller vilda, ej injicerade myggor av motsatt kön. Backcrossing för denna andra generation bör ta bort alla skadliga effekter av injektion och inavel.
2. Blod matar burarna i mutant f₁ myggor och deras vilda motsvarigheter som tidigare beskrivits. Fyra till fem dagar senare, samla de resulterande F₂ äggflottorna.
3. Etikett och bakre F_{2 larverna} enligt beskrivningen ovan, placera varje äggflotte i en separat, märkt behållare. Vid poppning separerar du återigen enskilda puppar i enskilda 2 ml mikrocentrifugrör och överför varje vuxen till separata glasflaskor som är täckta med sackarosdränkt bomull vid uppkomst. Screena sedan pupal exuvia av varje F₂ individ önskad mutation som tidigare beskrivits (steg 8,5-8,8).
   OBS: Här kommer alla individer som har önskad mutation att vara heterozygous, och därför pcr produkten bör helst producera 2 distinkta band när de körs på en 3-4% agarose gel.
4. När mutant F₂ larver har identifierats, placera alla män och kvinnor som har mutationen i samma bur för att kompisera. Blodfoder 7-10 dagar efter vuxen uppkomst, och 4-5 dagar senare, samla F₃ äggflottar.
5. Placera varje F_3-äggflotte i en separat larvuppfödningsbehållare och etikett och matning enligt beskrivningen ovan.
6. Separera F 3-popparna i enskilda 2 ml mikrocentrifugrör. När vuxna dyker upp, överför dem till enskilda glasflaskor med 10% sackaros-blöt bomull. Screena pupal exuvia som tidigare beskrivits. Den här gången bör cirka 25% av avkomman i varje panna vara homozygous för nullmutationen. Placera dessa individer i en enda bur och använd dem för att skapa och underhålla den nygenererade mutantlinjen av myggor.
   OBS: Om ett lågt antal homozygous myggor är närvarande, kan heterozygous F₃ män och kvinnor korsas med varandra för att generera ytterligare homozygous-null myggor i F_{4-generationen.}

Representative Results

Med hjälp av det beskrivna protokollet kunde vi framgångsrikt injicera embryon av Cx. pipiens, och observerade en hög överlevnadsgrad bland de injicerade embryona (~ 55%, figur 1). Tidigare försök hade en lägre andel överlevnad, sannolikt eftersom äggfollikelns främre var fäst vid den medicinska dressingremsan, vilket hindrade mygglarver från att fly från korieringen och framgångsrikt simma i vattnet. Se till att den främre änden sträcker sig bortom remsan av medicinsk dressing kraftigt ökad larv överlevnad, och resulterar i högkvalitativa avkommor som kan utvecklas till vuxen ålder och reproducera (Figur 2B).

Efterföljande experiment och screening tyder på att null mutationen för dygnsrytm klocka gen cykeln (cyc; KM355981) tog sig in i könscellen hos de injicerade embryona(figur 3). Med tanke på att våra primers förstärkte en stor region av cyc-genen nära skärplatserna, var det svårt att observera två separata band i heterozygous, F₁ myggor. Detta visar nyttan av att designa primers som kommer att förstärka fragment som är ~ 100-200 bp runt den skurna platsen, och även vikten av att sekvensera alla misstänkta mutanta myggor. Sekvensering visade att cirka 10% av de screenade myggorna visade en liten insättning eller radering nära Cas9-skärplatsen för den första guiden RNA som vi hade designat (Figur 3), vilket tyder på att detta var ett mycket effektivt gRNA och att vi framgångsrikt riktade in oss på polcellerna under mikroinjektioner. F_{1 individer} framgångsrikt parat och producerat livskraftiga avkommor (F₂ generation), varav några också innehöll mutationen.

Figur 1: Exempel på en fasad borosilikatnål. Denna nål var tillverkad av en silikoniserad borosilikat microcapillary rör, dras med en PC-10 vertikal nål puller, och sedan fasad på en BV-10 Beveller. Nålen ses under ~63x förstoring. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: F_{0-generationens} överlevnad i hela deras utveckling. A)Bild av 1^st instar larver som kläcktes från 3 diabilder som innehåller injicerade embryon. B)Grafisk representation av antalet individer i varje livsstadium. Av de 801 embryon som injicerades kläcktes 441 1^st instar larver, och av dessa 149 individer nådde poppning, vilket resulterade i totalt 121 vuxna (73 män och 43 honor). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3: Representativa resultat som visar överföringen av den önskade mutationen. De två översta sekvenserna representerar sekvensen av cykelgenen i Culex quinquefascaitus (Cx.quinq; XP_001865023.1) och hos vilda honor av Cx. pipiens (WT. F; KM355981). Sekvenserna nedan representerar sekvenser i tre manliga F_1-avkommor (I.DM1; II.JM4; II.K10M). Den gröna lådan representerar PAM-sekvensen som känns igen av Cas9-proteinet (CGG) medan den gröna pilen representerar var Cas9-proteinet klyvde genomiskt DNA. Dessa resultat visar att korta borttagningar av 2 eller 4 nukleotider ärvdes i F₁ hanar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Detta protokoll presenterar metoder för att införa specifika mutationer i arvsmassan hos Culex myggor och kan användas för att redigera arvsmassan hos andra myggor också. Protokollet är betydelsefullt eftersom det ger specifika detaljer om inte bara hur man förbereder injektionsmaterialen, men också en detaljerad videoöversikt över hur man inducerar myggor att lägga ägg, liksom hur man förbereder och injicerar dessa ägg. Vi sammanfattar också hur man utnyttjar biologin hos kvinnliga Cx. pipiens för att lägga ägg i enskilda flottar och därmed screena en mindre andel avkommor från varje kvinna för önskade mutationer. Metoderna som presenteras här har optimerats för Cx. pipiens men kan anpassas, med små justeringar, för att redigera genom av andra myggor eller insekter. Dessutom är de mikromanipulations- och mikroinjektionsprotokoll som beskrivs här mottagliga för att injicera flera olika material i insektsembryon, inklusive transposoner, dsRNA eller andra endonukleaser som TALENs eller Zink-Finger nukleaser. Dessutom genererar avfasningsprotokollet mikroinjektionsnålar med varierande öppningsstorlekar och skapar därför nålar som kan användas för att injicera en mängd olika injektionsmaterial. Nålens öppna storlek kan härledas genom att långsamt minska lufttrycket efter att nålen har fasats och med ant angivande av det tryck vid vilket luftbubblor slutar strömma från spetsen på den nyöppnade nålen. Ju mindre lufttryck som behövs för att producera bubblor indikerar att nålen har en större öppningsstorlek, och omvänt indikerar högre lufttryck att nålen har en mindre öppningsstorlek. Nålar med större öppningsstorlekar är bättre för att injicera större partiklar och mer trögflytande material, men kommer sannolikt att orsaka större skador på embryot och därmed minska överlevnaden.

Mikroinjektionsexperiment är på många sätt en kapplöpning mot klockan. Först måste man injicera enskilda embryon inom de första 2 timmarna efter oviposition, innan korition härdar och blastodermbildning sker. Därför är det absolut nödvändigt att notera när myggorna först placerades i ovipositionskammaren, hur lång tid det tar att manipulera äggen för injektion (vi rekommenderar inte mer än 20-30 minuter) och hur lång tid det tar att injicera alla embryon. Tiden är också begränsad vid screening av vuxna myggor för mutationer eftersom Cx. pipiens är ganska känsliga för sin omgivning och myggor i allmänhet överlever i allmänhet bara i 3-5 dagar i enskilda glasflaskor. Därför är det absolut nödvändigt att screena mygga pupal exuvia så snabbt som möjligt. Alternativt kan man också extrahera genomiskt DNA från ett enda myggben¹⁴. För att göra det bör dock myggorna först bedövas på is. Eftersom vi var trötta på hur kall behandling och förlust av lemmar kan påverka myggens överlevnad och deras förmåga att kompisera och lägga livskraftiga ägg, bestämde vi oss för att istället screena de kasserade pupal exuvia för mutationer. Nivån av gDNA inom exuvia är sannolikt lägre än inuti ett myggben, och detta lägger till extra ansträngning och tid att separera myggor på pupalstadiet, men säkerställer också att alla vuxna är omaterade när de släpps ut i sina lämpliga burar, vilket är absolut nödvändigt. Vi anser att resultaten är värda det, men uppmuntrar andra att överväga om avlägsnandet av ett ben kan vara ett bättre tillvägagångssätt för deras experimentella behov.

Det bästa sättet att påskynda screening för mutationer är att injicera en plasmid som innehåller en genetisk markör, såsom ett fluorescerande protein, flankerat av homologa sekvenser på vardera sidan av den skurna platsen. Frekvensen av knock-in mutationer med hjälp av homology directed-repair (HDR) är i allmänhet lägre än icke-homolog end-joining (NHEJ), knock-out mutationer (HDR=0,71%; NHEJ=24.87%; ²²). Därför kommer införandet av markören sannolikt att ske med en mycket lägre frekvens, men de tidsbesparingar som erbjuds genom att snabbt kunna screena mygglarver under ett fluorescerande mikroskop kan vara värda risken, beroende på projektet. Dessutom förbättras frekvensen av HDR- och knock-in-mutationer när man också injicerar en plasmid som innehåller den genetiska^sekvensenav Cas9-proteinet, driven av en väl karakteriserad embryonal promotor och gRNA som drivs av U6 promotor 24^,26. Detta beror sannolikt på att tidigt i embryonal utveckling, när atomkärnor snabbt delar sig (S-fasen av cellcykeln), verkar den felbenägna men ändamålsenliga NHEJ-mekanismen vara den föredragna metoden för att reparera dubbelsträngade pauser (granskad¹⁸). Men när embryogenes fortskrider är cellulära maskinerna redo att använda den mer exakta HDR-mekanismen för att reparera dubbelsträngade pauser (sen S-fas och G2-fas). Genom att injicera en plasmid som innehåller Cas9-sekvensen tidigt i embryonal utveckling kan Cas9-proteinet nå de flesta målceller medan embryot fortfarande är i sitt synyteltillstånd och innan cellmembran har bildats, men den lilla fördröjning som krävs för att transkribera och översätta Cas9-proteinet verkar öka sannolikheten för att endonukleasen kommer att vara aktiv vid en tidpunkt då det utvecklande embryot är mer sannolikt att använda HDR för att exakt reparera dubbelsträngade pauser i genomiskt DNA. Till exempel upptäckte Lin et al.²⁷ att frekvensen av HDR förbättrades till ~ 33% när Cas9-proteinet komplext med gRNA injicerades i mänskliga cellinjer arresterade i M-fasen av cellcykeln. En ytterligare fördel med att leverera Cas9 och gRNAs på plasmider är att de är mindre trögflytande och därför mindre benägna att täppa till nålen under injektioner (R. Harrell, personlig observation). Men tills embyronic promotors kännetecknas och valideras i Culex myggor, rekommenderar vi att injicera Cas9 protein eller mRNA som beskrivs här.

Dessutom, med tanke på den tid som man måste ägna åt att odla och screening myggor, rekommenderar vi att man har minst en heltidstekniker, student eller forskare som ägnas åt denna uppgift. Vi rekommenderar också strategiskt att överväga hur många null mutanter man behöver för ett givet experiment och vikten av genetisk mångfald inom nulllinjen. Medan vi kunde identifiera myggor i F_{1- och} F_{2-generationerna} som hade mutationen, överlevde endast en handfull F_2-myggorna till vuxen ålder de heterozygous mutanta myggorna misslyckades med att producera livskraftiga avkommor. Vi tror att detta har mycket mindre att göra med mutationen, och mer sannolikt är ett resultat av den långa tidsperioden att både manliga och kvinnliga myggor var begränsade till glasrör medan vi screening dem. Denna långvariga isoleringsperiod störde sannolikt deras förmåga att framgångsrikt para sig och, när det gäller kvinnor, få en blodmåltid och lägga livskraftiga ägg. Att korsa för en enda generation och/eller ha optimerade screeningtekniker på plats bör förhindra att problemet uppstår i framtiden. Därför är vi genom att följa detta protokoll övertygade om att forskare framgångsrikt kommer att kunna generera null-linjer av Culex myggor och, med mindre justeringar, ytterligare insekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Membrane Feeder	Hemotek	SP5W1-3	Company location: Blackburn, UK
ATP	Invitrogen	18330019	Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	World Precision Instruments	1B100-6	Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler	Sutter Instruments	BV-10-B	Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate	Thermo Fisher Scientific	09-800	Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam	Henry Schein Inc	1010171	Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector	Eppendorf	5252000021	Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller	Narishige	PC-100	This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	Capillary Tube Supplies Limited	QGCT 1.0	Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit	Takara, Bio USA	632639	This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood	Lampire biologicals	7201406	Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food	Tetramin	N/A
Whatman filter paper	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Company Location: St. Louis, MO, USA