Den presenterte metoden innebærer uniaxial strekking av 3D myke hydrogeler innebygd i silikongummi samtidig som levende konfokal mikroskopi tillates. Karakterisering av ytre og indre hydrogelstammer samt fiberjustering er demonstrert. Enheten og protokollen som er utviklet, kan vurdere cellenes respons på ulike strekkregimer.
Eksterne krefter er en viktig faktor i vevsdannelse, utvikling og vedlikehold. Effektene av disse kreftene studeres ofte ved hjelp av spesialiserte in vitro stretching metoder. Ulike tilgjengelige systemer bruker 2D-substratbaserte bårer, mens tilgjengeligheten av 3D-teknikker for å spenne myke hydrogeler, er mer begrenset. Her beskriver vi en metode som tillater ekstern strekking av myke hydrogeler fra omkretsen, ved hjelp av en elastisk silikonstrimmel som prøvebærer. Strekksystemet som brukes i denne protokollen er konstruert av 3D-trykte deler og rimelig elektronikk, noe som gjør det enkelt og enkelt å replikere i andre laboratorier. Den eksperimentelle prosessen begynner med å polymerisere tykke (>100 μm) myke fibrinhydrgeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) i en utskjæring i midten av en silikonstrimmel. Silikon-gelkonstruksjoner festes deretter til den trykte strekkenheten og plasseres på det konfiske mikroskopstadiet. Under levende mikroskopi aktiveres strekkenheten, og gelene er avbildet i forskjellige strekkstørrelser. Bildebehandling brukes deretter til å kvantifisere de resulterende geldeformasjonene, som demonstrerer relativt homogene stammer og fiberjustering gjennom gelens 3D-tykkelse (Z-aksen). Fordelene ved denne metoden inkluderer evnen til å spenne ekstremt myke hydrogeler i 3D mens du utfører in situ-mikroskopi, og friheten til å manipulere geometrien og størrelsen på prøven i henhold til brukerens behov. I tillegg, med riktig tilpasning, kan denne metoden brukes til å strekke andre typer hydrogeler (f.eks. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) og kan tillate analyse av celler og vevsrespons på eksterne krefter under mer biomimetiske 3D-forhold.
Vevsrespons på mekaniske krefter er en integrert del av et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert genuttrykk1, celledifferensiering2og vevsoppussing3. Videre kan kraftinduserte endringer i den ekstracellulære matrisen (ECM) som fiberjustering og fortetting påvirke celleadferd og vevsdannelse4,5,6. ECM’s fibrøse maskestruktur har spennende mekaniske egenskaper, for eksempel ikke-lineær elastisitet, ikke-affindeformasjon og plastdeformasjoner7,8,9,10,11,12. Disse egenskapene påvirker hvordan celler og deres omkringliggende mikromiljø reagerer på eksterne mekaniske krefter13,14. Å forstå hvordan ECM og vev reagerer på mekaniske krefter vil muliggjøre fremgang innen vevsteknikk og i utviklingen av mer nøyaktige beregnings- og teoretiske modeller.
De vanligste metodene for mekanisk strekkprøver har fokusert på cellebelastede 2D-substrater for å utforske effektene på celleadferd. Disse inkluderer for eksempel å påføre belastning på PDMS-substrater (polydimetylsiloksan) og analysere cellereorienteringsvinkler i forhold til strekkretningen15,16,17,18,19. Likevel er metoder som undersøker responsen til 3D-celleinbygde hydrogeler til ekstern strekk, en situasjon som nærmere etterligner vevsmikromiljø, mer begrenset. Fremskritt mot 3D-strekkmetoder er spesielt viktig fordi celler oppfører seg annerledes på 2D-substrater sammenlignet med 3D-matriser20. Disse virkemåtene omfatter cellulær omjustering, proteinuttrykksnivåer og overføringsmønstre21,22,23.
Metoder og enheter som tillater 3D-prøvestrekking inkluderer både kommersielt tilgjengelig24,25,26,27,28 og de som er utviklet for laboratorieforskning29. Disse metodene bruker distensible silikonrør30, multibrønnkamre31, klemmer26,32, bioreaktorer11,33, cantilevers34,35,36og magneter37,38. Noen teknikker genererer strekk som lokalt deformerer 3D-hydrogeler, for eksempel ved å trekke nåler fra to enkeltpunkter igelen 5, mens andre tillater deformasjon av hele hoveddelen av gelen16. Videre fokuserer de fleste av disse systemene på analyse av strekkfeltet i X-Y-planet, med begrenset informasjon om strekkfeltet i Z-retningen. I tillegg er bare en håndfull av disse enhetene i stand til mikroskopisk in situ-avbildning. Hovedutfordringen med in situ høyforstørrelsesavbildning (f.eks. konfokalt mikroskop) er den begrensede arbeidsavstanden til noen få hundre mikron fra objektivet til prøven. Enheter som tillater levende bildebehandling under strekkoffer ensartethet av belastning i Z-akseneller er relativt komplekse og vanskelige å reprodusere i andre laboratorier39,40.
Denne tilnærmingen til å strekke 3D-hydrogeler gir statisk eller syklisk uniaxial belastning under levende konfokal mikroskopi. Strekkenheten (referert til som ‘Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS’) er konstruert ved hjelp av 3D-trykte deler og rimelig maskinvare, noe som gir enkel reproduksjon i andre laboratorier. Festet til enheten er en kommersielt tilgjengelig silikongummi med en geometrisk utskjæring i midten. Hydrogelkomponenter polymeriseres for å fylle utskjæringen. Under polymerisasjon holder biologiske hydrogeler, som fibrin eller kollagen, naturlig til de indre veggene i utskjæringen. Ved hjelp av SCyUS er silikonstripen uniaxially strukket, og overfører kontrollerte stammer til den innebygde 3D-hydrogelen41.
Dette systemet gir en unik kombinasjon av funksjoner og fordeler sammenlignet med andre eksisterende metoder. For det første tillater systemet uniaxial strekking av tykke 3D myke hydrogeler (>100 μm tykk, <1 kPa stivhet) fra periferien, med Z-homogendeformasjon gjennom hele hydrogelen. Disse hydrogelene er for myke til å gripes og strekkes av konvensjonelle strekkteknikker. For det andre kan strekkenheten enkelt replikeres i andre laboratorier siden 3D-utskrift er lett tilgjengelig for forskere, og elektronikken som brukes i designet er rimelig. For det tredje, og kanskje den mest attraktive funksjonen, kan geometrien og størrelsen på utskjæringen i silikonstripen enkelt manipuleres, noe som gir justerbare belastningsgradienter og grenseforhold samt bruk av en rekke prøvevolumer, ned til noen få mikroliter.
Den presenterte protokollen består av støping fibrin gel i ~ 2 mm diameter disker i 0,5 mm tykke silikon gummi strimler som drives av uniaxial strekk under levende konfokal mikroskopi. Følgende diskuterer i detalj de eksperimentelle prosedyrene for måling og analyse av stammene som virker på den geometriske utskjæringen, de indre stammene utviklet i hydrogelen, samt resulterende fiberjustering etter ulike strekkmanipulasjoner. Til slutt diskuteres muligheten for å legge inn celler i hydrogelen og utsette dem for kontrollert ekstern strekk.
Metoden og protokollen som presenteres her er i stor grad basert på vår tidligere studie av Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderer her hele dataassistert design (CAD), Python og mikrokontrollerkoder for SCyUS-enheten.
De viktigste fordelene ved den presenterte metoden over eksisterende tilnærminger inkluderer muligheten til å spenne svært myke 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) fra omkretsen, og under levende konfokal avbildning. Andre met…
The authors have nothing to disclose.
Noen figurer som er inkludert her har blitt tilpasset ved tillatelse fra Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Anstrengende 3D-hydrogeler med ensartede z-aksestammer samtidig som levende mikroskopiavbildning, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |