Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

Summary

La méthode présentée implique l’étirement uniaxial des hydrogels mous 3D incorporés dans le caoutchouc de silicone tout en permettant la microscopie confocale vivante. La caractérisation des souches externes et internes d’hydrogel ainsi que l’alignement des fibres sont démontrés. Le dispositif et le protocole développés peuvent évaluer la réponse des cellules à divers régimes de déformation.

Abstract

Les forces externes sont un facteur important dans la formation, le développement, et le maintien de tissu. Les effets de ces forces sont souvent étudiés à l’aide de méthodes d’étirement in vitro spécialisées. Divers systèmes disponibles utilisent des civières 2D à base de substrat, tandis que l’accessibilité des techniques 3D pour filtrer les hydrogels mous est plus restreinte. Ici, nous décrivons une méthode qui permet l’étirement externe des hydrogels mous de leur circonférence, en utilisant une bande élastique de silicone comme support d’échantillon. Le système d’étirement utilisé dans ce protocole est construit à partir de pièces imprimées en 3D et d’électronique à faible coût, ce qui le rend simple et facile à reproduire dans d’autres laboratoires. Le processus expérimental commence par la polymérisation d’hydrogels de fibrine molle épais (>100 μm) (module élastique d’environ 100 Pa) dans une découpe au centre d’une bande de silicone. Les constructions en gel de silicone sont ensuite fixées au dispositif d’étirement imprimé et placées sur l’étage du microscope confocal. Sous microscopie en direct, le dispositif d’étirement est activé et les gels sont entifiés à différentes magnitudes d’étirement. Le traitement d’image est ensuite utilisé pour quantifier les déformations de gel résultantes, démontrant des déformations relativement homogènes et un alignement des fibres tout au long de l’épaisseur 3D du gel (axeZ). Les avantages de cette méthode incluent la possibilité de filtrer des hydrogels extrêmement mous en 3D lors de l’exécution de la microscopie in situ, et la liberté de manipuler la géométrie et la taille de l’échantillon en fonction des besoins de l’utilisateur. De plus, avec une adaptation appropriée, cette méthode peut être utilisée pour étirer d’autres types d’hydrogels (par exemple, le collagène, le polyacrylamide ou le polyéthylène glycol) et peut permettre l’analyse de la réponse des cellules et des tissus aux forces externes dans des conditions 3D plus biomimétiques.

Introduction

La réponse tissulaire aux forces mécaniques fait partie intégrante d’un large éventail de fonctions biologiques, y compris l’expression^{génique 1,}la différenciation cellulaire²et le remodelage tissulaire^3. De plus, les changements induits par la force dans la matrice extracellulaire (ECM) tels que l’alignement et la densification des fibres peuvent avoir un impact sur le comportement cellulaire et la formation des tissus^4,5,6. La structure de maille fibreuse de l’ECM possède des propriétés mécaniques intrigantes, telles que l’élasticité non linéaire, la déformation non affine et les déformations plastiques^{7,8,9,10,11,12.} Ces propriétés ont un impact sur la façon dont les cellules et leur microenvironnement environnant répondent aux forces mécaniques externes^13,14. Comprendre comment l’ECM et les tissus répondent aux forces mécaniques permettra de progresser dans le domaine de l’ingénierie tissulaire et dans le développement de modèles informatiques et théoriques plus précis.

Les méthodes les plus courantes pour étirer mécaniquement des échantillons se sont concentrées sur des substrats 2D chargés de cellules pour explorer les effets sur le comportement des cellules. Il s’agit, par exemple, d’appliquer une contrainte sur des substrats de polydiméthylsiloxane (PDMS) et d’analyser les angles de réorientation cellulaire par rapport à la direction d’étirement^{15,16,17,18,19.} Pourtant, les méthodes d’étude de la réponse des hydrogels 3D intégrés aux cellules à l’étirement externe, une situation qui imite plus étroitement le microenvironnement tissulaire, sont plus limitées. Les progrès vers les méthodes d’étirement 3D sont d’une importance particulière car les cellules se comportent différemment sur les substrats 2D par rapport aux matrices 3D²⁰. Ces comportements incluent le réalignement cellulaire, les niveaux d’expression des protéines et les modèles de migration^21,22,23.

Les procédés et dispositifs qui permettent l’étirement d’échantillons 3D comprennent à la fois les^{24,25,26,27,28} disponibles dans le commerce et ceux développés pour la recherche en laboratoire^29. Ces procédés utilisent des tubes en silicone distensibles^30,des chambres multi-puits^31,des pinces^26,32,des bioréacteurs^11,33,des cantilevers^34,35,36,et des aimants^37,38. Certaines techniques génèrent un étirement qui déforme localement les hydrogels 3D, par exemple en tirant des aiguilles de deux points uniques dans le gel^5,tandis que d’autres permettent la déformation de l’ensemble du gel^16. De plus, la plupart de ces systèmes se concentrent sur l’analyse du champ de déformation dans le plan X-Y, avec des informations limitées sur le champ de déformation dans la direction Z. De plus, seule une poignée de ces appareils sont capables d’imagerie microscopique in situ. Le principal défi de l’imagerie in situ à fort grossissement (p. ex. microscope confocal) est la distance de travail limitée de quelques centaines de microns entre la lentille de l’objectif et l’échantillon. Les dispositifs qui permettent l’imagerie en direct pendant l’étirement sacrifient l’uniformité de la déformation dans l’axe Zou sont relativement complexes et difficiles à reproduire dans d’autres laboratoires^39,40.

Cette approche d’étirement des hydrogels 3D permet une contrainte uniaxiale statique ou cyclique pendant la microscopie confocale en direct. Le dispositif d’étirement (appelé « Brancard uniaxial cyclique intelligent – SCyUS ») est construit à l’aide de pièces imprimées en 3D et de matériel à faible coût, permettant une reproduction facile dans d’autres laboratoires. Attaché à l’appareil est un caoutchouc de silicone disponible dans le commerce avec une découpe géométrique en son centre. Les composants d’hydrogel sont polymérisés pour remplir la découpe. Lors de la polymérisation, les hydrogels biologiques, tels que la fibrine ou le collagène, adhèrent naturellement aux parois intérieures de la découpe. En utilisant le SCyUS, la bande de silicone est étirée de manière uniaxially, transférant des souches contrôlées à l’hydrogel 3D intégré⁴¹.

Ce système permet une combinaison unique de fonctionnalités et d’avantages par rapport à d’autres méthodes existantes. Tout d’abord, le système permet l’étirement uniaxial d’hydrogels mous 3D épais (>100 μm d’épaisseur, <1 kPa rigidité) à partir de leur périphérie, avec une déformation Zhomogène dans tout l’hydrogel. Ces hydrogels sont trop mous pour être saisis et étirés par des techniques de traction conventionnelles. Deuxièmement, le dispositif d’étirement peut être facilement reproduit dans d’autres laboratoires, car l’impression 3D est facilement disponible pour les chercheurs et l’électronique utilisée dans la conception est peu coûteuse. Troisièmement, et c’est peut-être la caractéristique la plus attrayante, la géométrie et la taille de la découpe dans la bande de silicone peuvent être facilement manipulées, ce qui permet des gradients de déformation et des conditions limites accordables ainsi que l’utilisation d’une variété de volumes d’échantillons, jusqu’à quelques microlitres.

Le protocole présenté consiste à mouler le gel de fibrine en disques de ~2 mm de diamètre dans des bandes de caoutchouc de silicone de 0,5 mm d’épaisseur procédé par étirement uniaxial sous microscopie confocale vivante. Ce qui suit traite en détail des procédures expérimentales de mesure et d’analyse des déformations agissant sur la découpe géométrique, des déformations internes développées dans l’hydrogel, ainsi que de l’alignement des fibres résultant après diverses manipulations d’étirement. En conclusion, la possibilité d’incorporer des cellules dans le hydrogel et de les exposer à l’étirement externe commandé est discutée.

Protocol

1. Préparation de la solution (à effectuer à l’avance) Étiquetage du fibrinogèneREMARQUE: L’étape d’étiquetage n’est requise que si l’analyse de la déformation du gel de fibrine est souhaitée. Pour les expériences cellulaires, il est possible d’utiliser un gel non étiqueté. Ajouter 38 μL de colorant fluorescent à l’ester de succinimidyle à 10 mg/mL (dissous dans du DMSO) à 1,5 mL de solution de fibrinogène à 15 mg/mL (rapport molaire de 5:1) dans un tube de centrifuga…

Representative Results

Des données représentatives d’étirement statiques de magnitudes croissantes appliquées à la bande de silicone portant un hydrogel de fibrine 3D, encastré avec des billes fluorescentes de 1 μm, sont illustrées à la figure 9. L’analyse démontre l’effet de l’étirement en silicone sur les changements géométriques de la découpe ainsi que sur les souches développées dans le gel. Des images z-stack de l’ensemble du gel sont utilisées pour évaluer la dé…

Discussion

La méthode et le protocole présentés ici sont largement basés sur notre étude précédente par Roitblat Riba et al.⁴¹ Nous incluons ici les codes complets de conception assistée par ordinateur (CAO), Python et microcontrôleur du dispositif SCyUS.

Les principaux avantages de la méthode présentée par rapport aux approches existantes incluent la possibilité de forcer des hydrogels 3D très mous (module élastique de ~ 100 Pa) de leur circonférence, et …

Materials

Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)	Biological Industries	01-052-1A	Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5	Bar-Naor Ltd.	BN72204-30	22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO	Sigma-Aldrich Inc.	D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Biological Industries	02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)	Omrix Biopharmaceuticals	3902	Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer	N/A		Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)	Invitrogen	F8820	Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber	McMaster-Carr	3788T41	580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)	GE Healthcare	17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound	Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.	HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39	National Institute of Health, Bethesda, MD	Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)	Arduino/Adafruit	Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge	Thermo Scientific	75002470
Parafilm	Bemis	PM-996
Primovert Light Microscope	Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.	491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)	Dassault Systèmes	N/A
SCyUS Code37	N/A	N/A
Servomotor – TowerPro SG-5010	Adafruit	155
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030	For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates	Corning	430167
Thrombin buffer	N/A		Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)	N/A	N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope	Carl Zeiss AG	2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)	Carl Zeiss AG	Release Version 14.0.0.0