Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrollert stamme av 3D-hydrogeler under levende mikroskopiavbildning

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61671
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3,4
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Summary

Den presenterte metoden innebærer uniaxial strekking av 3D myke hydrogeler innebygd i silikongummi samtidig som levende konfokal mikroskopi tillates. Karakterisering av ytre og indre hydrogelstammer samt fiberjustering er demonstrert. Enheten og protokollen som er utviklet, kan vurdere cellenes respons på ulike strekkregimer.

Abstract

Eksterne krefter er en viktig faktor i vevsdannelse, utvikling og vedlikehold. Effektene av disse kreftene studeres ofte ved hjelp av spesialiserte in vitro stretching metoder. Ulike tilgjengelige systemer bruker 2D-substratbaserte bårer, mens tilgjengeligheten av 3D-teknikker for å spenne myke hydrogeler, er mer begrenset. Her beskriver vi en metode som tillater ekstern strekking av myke hydrogeler fra omkretsen, ved hjelp av en elastisk silikonstrimmel som prøvebærer. Strekksystemet som brukes i denne protokollen er konstruert av 3D-trykte deler og rimelig elektronikk, noe som gjør det enkelt og enkelt å replikere i andre laboratorier. Den eksperimentelle prosessen begynner med å polymerisere tykke (>100 μm) myke fibrinhydrgeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) i en utskjæring i midten av en silikonstrimmel. Silikon-gelkonstruksjoner festes deretter til den trykte strekkenheten og plasseres på det konfiske mikroskopstadiet. Under levende mikroskopi aktiveres strekkenheten, og gelene er avbildet i forskjellige strekkstørrelser. Bildebehandling brukes deretter til å kvantifisere de resulterende geldeformasjonene, som demonstrerer relativt homogene stammer og fiberjustering gjennom gelens 3D-tykkelse (Z-aksen). Fordelene ved denne metoden inkluderer evnen til å spenne ekstremt myke hydrogeler i 3D mens du utfører in situ-mikroskopi, og friheten til å manipulere geometrien og størrelsen på prøven i henhold til brukerens behov. I tillegg, med riktig tilpasning, kan denne metoden brukes til å strekke andre typer hydrogeler (f.eks. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) og kan tillate analyse av celler og vevsrespons på eksterne krefter under mer biomimetiske 3D-forhold.

Introduction

Vevsrespons på mekaniske krefter er en integrert del av et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert genuttrykk1, celledifferensiering2og vevsoppussing3. Videre kan kraftinduserte endringer i den ekstracellulære matrisen (ECM) som fiberjustering og fortetting påvirke celleadferd og vevsdannelse4,5,6. ECM's fibrøse maskestruktur har spennende mekaniske egenskaper, for eksempel ikke-lineær elastisitet, ikke-affindeformasjon og plastdeformasjoner7,8,9,10,11,12. Disse egenskapene påvirker hvordan celler og deres omkringliggende mikromiljø reagerer på eksterne mekaniske krefter13,14. Å forstå hvordan ECM og vev reagerer på mekaniske krefter vil muliggjøre fremgang innen vevsteknikk og i utviklingen av mer nøyaktige beregnings- og teoretiske modeller.

De vanligste metodene for mekanisk strekkprøver har fokusert på cellebelastede 2D-substrater for å utforske effektene på celleadferd. Disse inkluderer for eksempel å påføre belastning på PDMS-substrater (polydimetylsiloksan) og analysere cellereorienteringsvinkler i forhold til strekkretningen15,16,17,18,19. Likevel er metoder som undersøker responsen til 3D-celleinbygde hydrogeler til ekstern strekk, en situasjon som nærmere etterligner vevsmikromiljø, mer begrenset. Fremskritt mot 3D-strekkmetoder er spesielt viktig fordi celler oppfører seg annerledes på 2D-substrater sammenlignet med 3D-matriser20. Disse virkemåtene omfatter cellulær omjustering, proteinuttrykksnivåer og overføringsmønstre21,22,23.

Metoder og enheter som tillater 3D-prøvestrekking inkluderer både kommersielt tilgjengelig24,25,26,27,28 og de som er utviklet for laboratorieforskning29. Disse metodene bruker distensible silikonrør30, multibrønnkamre31, klemmer26,32, bioreaktorer11,33, cantilevers34,35,36og magneter37,38. Noen teknikker genererer strekk som lokalt deformerer 3D-hydrogeler, for eksempel ved å trekke nåler fra to enkeltpunkter igelen 5, mens andre tillater deformasjon av hele hoveddelen av gelen16. Videre fokuserer de fleste av disse systemene på analyse av strekkfeltet i X-Y-planet, med begrenset informasjon om strekkfeltet i Z-retningen. I tillegg er bare en håndfull av disse enhetene i stand til mikroskopisk in situ-avbildning. Hovedutfordringen med in situ høyforstørrelsesavbildning (f.eks. konfokalt mikroskop) er den begrensede arbeidsavstanden til noen få hundre mikron fra objektivet til prøven. Enheter som tillater levende bildebehandling under strekkoffer ensartethet av belastning i Z-akseneller er relativt komplekse og vanskelige å reprodusere i andre laboratorier39,40.

Denne tilnærmingen til å strekke 3D-hydrogeler gir statisk eller syklisk uniaxial belastning under levende konfokal mikroskopi. Strekkenheten (referert til som 'Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS') er konstruert ved hjelp av 3D-trykte deler og rimelig maskinvare, noe som gir enkel reproduksjon i andre laboratorier. Festet til enheten er en kommersielt tilgjengelig silikongummi med en geometrisk utskjæring i midten. Hydrogelkomponenter polymeriseres for å fylle utskjæringen. Under polymerisasjon holder biologiske hydrogeler, som fibrin eller kollagen, naturlig til de indre veggene i utskjæringen. Ved hjelp av SCyUS er silikonstripen uniaxially strukket, og overfører kontrollerte stammer til den innebygde 3D-hydrogelen41.

Dette systemet gir en unik kombinasjon av funksjoner og fordeler sammenlignet med andre eksisterende metoder. For det første tillater systemet uniaxial strekking av tykke 3D myke hydrogeler (>100 μm tykk, <1 kPa stivhet) fra periferien, med Z-homogendeformasjon gjennom hele hydrogelen. Disse hydrogelene er for myke til å gripes og strekkes av konvensjonelle strekkteknikker. For det andre kan strekkenheten enkelt replikeres i andre laboratorier siden 3D-utskrift er lett tilgjengelig for forskere, og elektronikken som brukes i designet er rimelig. For det tredje, og kanskje den mest attraktive funksjonen, kan geometrien og størrelsen på utskjæringen i silikonstripen enkelt manipuleres, noe som gir justerbare belastningsgradienter og grenseforhold samt bruk av en rekke prøvevolumer, ned til noen få mikroliter.

Den presenterte protokollen består av støping fibrin gel i ~ 2 mm diameter disker i 0,5 mm tykke silikon gummi strimler som drives av uniaxial strekk under levende konfokal mikroskopi. Følgende diskuterer i detalj de eksperimentelle prosedyrene for måling og analyse av stammene som virker på den geometriske utskjæringen, de indre stammene utviklet i hydrogelen, samt resulterende fiberjustering etter ulike strekkmanipulasjoner. Til slutt diskuteres muligheten for å legge inn celler i hydrogelen og utsette dem for kontrollert ekstern strekk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Løsningsforberedelse (skal utføres på forhånd)

  1. Fibrinogen merking
    MERK: Merketrinnet er bare nødvendig hvis det er ønskelig å analysere deformasjonen av fibringelen. For cellulære eksperimenter er det mulig å bruke en umerket gel.
    1. Tilsett 38 μL 10 mg/ml succinimidylstereorescerende fargestoff (oppløst i DMSO) til 1,5 ml 15 mg/ml fibrinogenoppløsning (molarforhold på 5:1) i et 50 ml sentrifugerør og legg på en shaker i 1 time ved romtemperatur. Deretter plasserer du røret i sentrifugen i 3 minutter ved 800 x g (romtemperatur).
    2. Filtrer supernatanten fra forrige trinn gjennom en avsaltingskolonne fullpakket med dekstrangelharpiks (Tabell over materialer) for å skille det uberørte fargestoffet,42 ved å følge disse trinnene.
      1. Forvask kolonnen med 25 ml fibrinogenbuffer.
      2. Injiser langsomt det merkede fibrinogenet fra trinn 1.1.1 i kolonnen, og sørg for at det ikke kommer bobler inn i filteret. Kast den første ~ 0,3 ml eluterte oppløsningen (4-6 dråper svak farget væske). Samle deretter følgende 1,0-1,5 ml renset løsning (følg produsentens protokoll for mer spesifikke detaljer).
      3. Avslutt filtreringsprosessen ved å sterilisere den resulterende rensede løsningen ved hjelp av et sprøytedrevet filter (0,22-0,45 μm).
      4. For å rengjøre og resirkulere kolonnen, vask med 20 ml fibrinogenbuffer, og lagre deretter i 25 ml 20% etanol.
  2. Etter elution, del det resulterende rensede merket-fibrinogen i små aliquots på ~ 7-50 μL, avhengig av ønsket antall strukket geler. For hver strukket sirkelgel med 2 mm diameter, lag ca. 3,5 μL fibrinogen (2,5 μL vil bli brukt per gel + 1 μL for pipetteringsfeil).
    1. Oppbevar aliquots i en -20 °C fryser. De kan brukes opptil omtrent ett år (det anbefales ikke å tine og fryse igjen).
    2. For resten av denne protokollen, hold ca. 7 μL av det rensede merkede fibrinogenet i kjøleskapet (4 °C) til trinn 4. Dette volumet er beregnet for opprettelse av to strakte geler (2,5 μL er nødvendig per gel, og et ekstra volum på 1 μL brukes til å ta hensyn til feil i prøvepreparering).
      MERK: Denne filtreringsprosedyren fortynner vanligvis den første 15 mg/ml fibrinogenoppløsningen til en endelig konsentrasjon på ca. 10 mg/ml. Fortynningsfaktoren avhenger av det første volumet og konsentrasjonen av fibrinogen, som angitt i produsentens protokoll.
  3. Forbered 7 μL trombinoppløsning (fortynn ved hjelp av trombinbuffer til 2 enheter / ml, materialbord) og hold i kjøleskapet (4 °C) til trinn 4. Dette volumet er ment å fylle utskjæringene av to strakte geler.
    MERK: For å utføre intern belastningsanalyse, bør 1 μm diameter fluorescerende sfæriske perler (kjøpt som en suspensjon [2% faste stoffer] i vann pluss 2 mM NaN3) legges til trombinoppløsningen (et forhold på 1:25 v / v % perle: trombin anbefales for et 40x mål). Perler bør bare inkluderes når interne belastningsmålinger er ønsket, enten i nærvær eller fravær av celler.

2. Silikon stripe forberedelse

  1. Hent den 0,5 mm tykke silikongummien og skjær den i 15 x 80 mm2 strimler med et hull med 2 mm diameter i midten av stripen (Figur 1). Hvis det er mulig, bruk en programmerbar laserkutter for høy presisjon. Hvis programmerbare maskiner ikke er tilgjengelige, er saks tilstrekkelig for å kutte stripeomrisset og en liten hullstans er tilstrekkelig for senterutskjæringen.
    MERK: Kommersiell silikongummi kjøpes vanligvis med plastfolie på begge sider. Oppbevar originalt plastbelegg på begge sider av silikonet hvis mulig. Hvis du gjenbruker silikonstrimler fra et tidligere eksperiment, behandle dem med trypsin i 0,5 time, suge i 0,2 M NaOH i 0,5 time, og deretter suge i 70% etanol i 1 time. La dem tørke før bruk.
  2. Forbered tetningsfilmlag (hydrofobe) med dimensjoner på minst 20 × 30 mm2, slik at de er bredere enn silikonstripen og dermed gjør det mulig for en forsegling å danne seg over hele den geometriske utskjæringen.
  3. Vask en 10 cm tallerken med 70% etanol, og tørk deretter og tørk med ikke-loende delikate oppgaveservietter (for både sterile og ikke-sterile eksperimenter). Dette trinnet er viktig siden det gjør at tetningsfilmlagene bedre holder seg til platen og begrenser prøvens bevegelse under forberedelsesprosessen.
  4. Plasser tetningsfilmlagene i den vaskede 10 cm parabolen slik at det er nok plass til å plassere to strimler i hver tallerken side ved side (Figur 2A).
    1. Fjern plastfolie fra den ene siden av silikonstripen og plasser den eksponerte siden på tetningsfilmlaget slik at utsparingen er helt omgitt av tetningsfilmlaget (Figur 2B). Trykk deretter forsiktig på silikonet mot tetningsfilmlaget for å forsegle området rundt utskjæringen, ved hjelp av rene hanskede fingre.
      MERK: Pass på at det ikke er luftlommer mellom silikonet og tetningsfilmen, spesielt rundt utsparingen. Gjør dette ved å undersøke undersiden av retten (Figur 2C).

Figure 1
Figur 1: Hydrogel anstrengende tilnærming. (A) 15 × 80 mm2 silikonstrimmel med 2 mm diameter utsparing i midten av stripen (B) En silikonstrimmel med sirkulær utskjæring med innebygd fibringel. For illustrasjonsformål er utskjæringen i silikonet større enn i de faktiske forsøkene (C) Skjematisk for strekktilnærmingen med silikonstripen (oransje), sirkulær gel (cut-out i midten) og stoffforlengere (grønn) som kobler silikonet til strekkenheten. Forstørret område av gelen indikerer deformasjon av gelen, som svar på uniaxial strekking av silikonet. For enkelhets skyld vises ikke kompresjonen langs tykkelsen på gelen (Z-aksen) i illustrasjonen. Figur 1B &1C er tilpasset fra Roitblat Riba et al.41Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på riktig plassering av en silikonstrimmel på et tetningsfilmlag før gelpolymerisering. (A) Plassering av to tetningsfilmlag i en 10 cm tallerken (B) Plassering av silikonstrimler på tetningsfilmlagene (C) Nedre visning av parabolen, som viser lufttetningen mellom silikonet og tetningsfilmlaget. Venstre: Riktig forsegling av tetningsfilmlaget til silikonstripen rundt utsparingen uten luftlommer. Høyre: Feil forsegling av tetningsfilmlaget til silikonstrimmelen med luftlommer rundt kanten av utsparingen. Dette vil føre til lekkasje av hydrogelkomponentene under silikonet. Rød pil peker mot et område der det ble dannet en luftlomme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Forbereder trombin med celler

MERK: Utfør dette trinnet bare hvis det er ønskelig å legge inn celler i hydrogelen, og under sterile forhold i en biologisk hette (Materialbord).

  1. Sterilisering: Dagen før det cellulære eksperimentet, plasser silikonstrimlene og tetningsfilmlagene i 70% etanol over natten og utfør deretter UV-sterilisering i 30 minutter på hver side (hvis 10 cm-rettene ikke allerede er sterile, bør de også steriliseres under UV-lys i 30 minutter etter en 70% etanolvask). UV-systemet som brukes i protokollen er det som er innebygd i den biologiske hetten.
    MERK: Alternativt kan en autoklavsteriliseringssyklus (140 °C) utføres på silikonstrimlene siden de er motstandsdyktige mot opptil 260 °C.
  2. Utfør et celleantall for å bestemme cellekonsentrasjonen, og sentrifuger og re-suspendere cellepelleten med 7 μL trombin (2 enheter / ml) i et 1,5 ml sentrifugerør. Vi anbefaler en cellekonsentrasjon på 800 celler/μL trombin. Hold cellene avkjølt til bruk (ikke overskrid mer enn en halv time for å unngå å skade cellene).

4. Polymerisering av fibringeler

  1. Hent 2-enheten/ml trombin og 10 mg/ml merkede fibrinogenløsninger fra kjøleskapet (tilberedt i trinn 1) og legg dem på is der de vil være tilgjengelige.
    MERK: Løsninger holdes kalde før blandingsprosessen for å bremse polymerisasjonsreaksjonskinetikken. Dette gir mulighet for mer homogen blanding av proteinene.
  2. Med parabolen(e) satt opp (trinn 2), trekk ut 2,5 μL merket fibrinogen og pipette det jevnt inn i silikonutsparingen (med tetningsfilmlaget festet til undersiden) slik at hele omkretsen av utskjæringen er i kontakt med fibrinogen. Pass på at det ikke dannes luftlommer eller bobler hvor som helst i løsningen, og vær spesielt oppmerksom på bunnkantene på utsparingen (grensesnittet mellom tetningsfilmlaget og silikonet).
  3. Ta straks 2,5 μL trombin (med eller uten celler/perler) og pipette den direkte inn i fibrinogenoppløsningen i utskjæringen (når sluttvolumet på 5 μL fibrin). Bland deretter raskt de to løsningene ved å pipette forsiktig opp og ned ~ 10 ganger. Under blandingsprosessen flytter du spissen rundt hele volumet for å skape en så homogen løsning som mulig.
  4. Tilsett en svært liten mengde fosfatbuffer saltvann (PBS) [alternativt cellemedium for celleeksperimenter, materialbord] langs kanten av hver tallerken slik at hydrogelen ikke tørker ut under polymerisasjonsprosessen. Kontroller at det ikke er noen kontakt mellom PBS/cellemediet og prøvene, da dette vil skade prøven.
  5. Dekk parabolen(e) og legg dem i inkubatoren ved 37 °C i 30 minutter.
    MERK: Den nødvendige inkubasjonstiden avhenger av gelens volum. Hvis større volumer brukes, bør inkubasjonstiden øke.
  6. Fjern retten(e) fra inkubatoren og tilsett PBS/cellemedium i parabolen, og senk hele gel-silikonkonstruksjonen.
  7. Løft forsiktig prøvekonstruksjonene en om gangen fra parabolen, og sørg for at tetningsfilmlaget forblir festet til stripen. Løsne tetningsfilmlaget langsomt fra silikonet ved å tisse forsiktig fra den ene enden av silikonet til den andre (figur 3). Unngå å trekke fra områder nær utskjæringen der det kan oppstå spenningskonsentrasjoner (dette er hovedsakelig viktig for ikke-sirkulære geometrier). Unngå kontakt med utsparingen, da det vil skade prøven.
  8. Legg stripen tilbake i parabolen med PBS/cellemedium slik at stripen flyter i fatet. Ta deretter parabolen(e) til et standard cellekulturmikroskop for å kvalitativt vurdere tilstanden til hver prøve. Geler må være ensartede, kontinuerlige gjennom hele utskjæringen, og ingen bobler skal være til stede. Bruk figur 4 som veiledning, og velg de beste prøvene for videre analyse.

Figure 3
Figur 3: Riktig fjerning av tetningsfilmlaget fra bunnen av silikonstripen. Fjerningsprosessen bør gjøres sakte slik at hydrogelen ikke vil rive eller bryte vedheftet med de indre veggene i utskjæringen. Den hvite pilen viser retningen for fjerning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mikroskopisk observasjon av fibringeler i silikonutsparingen. (A) To eksempler på en riktig polymerisert fibringel. Legg merke til gelens relative homogenitet og full vedheft til kantene på utskjæringen (B) To eksempler på prøvepolymeriseringsfeil. Topp: Legg merke til de mange boblene og aggregatene som dannes nederst til venstre. Bunn: Legg merke til rivingen av gelen fra utsparingskantene og aggregatene nederst til venstre i utsparingen. Skalalinje = 300 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Prøvelasting på SCyUS-enheten

  1. Fyll badekaret med PBS/cellemedium (figur 5) og plasser silikonstripen som bærer prøvegelen over toppen, slik at endene sitter på hver side av badekaret. Badet er ment å unngå tørking av gelen. Plasser og stram klemmene (lilla) sammen med stoffstrimlene (grønn) slik at alle brikkene er koblet til for å danne en rett stripe med utsparingen i midten (Figur 5).
  2. Hent SCyUS-enheten og fest aluminiumsvæskebrønnen og 22 mm x 40 mm rektangulær glassdeksel (nr. 1 eller 1,5) (Figur 6Aiii). Fest dekselsklien til bunnen av brønnen ved hjelp av tetningsmateriale (f.eks. vakuumfett) slik at brønnen kan fylles med væske uten lekkasje.
    1. Fyll brønnen med ~1-2 ml PBS/cellemedium og plasser stripen + stoffet + gelkonstruksjonen (figur 6B) i enheten. Klem stoffstripen (2) inn i braketten (1) slik at utsparingen + gelen (5) er i midten som vist, og plasser deretter forsiktig stifteinnsatsen (4) inn i enheten og lås den på plass.
    2. Deretter setter du den andre stoffsiden inn i spindelen (uten å feste servomotoren) og låser den inn i spindelen (Figur 6C).
  3. Sett SCyUS-enheten med den vedlagte prøven inn i mikroskopets stadium (figur 6C). Koble mikrokontrolleren (Materialbord) til datamaskinen via en USB-kabel og koble servomotoren til mikrokontrolleren. Åpne SCyUS-kontrollmodulen på datamaskinen. Prøven er nå klar for avbildning for å sjekke tilstrekkeligheten av gelens tykkelse og fiberhomogenitet under det konfokale mikroskopet.

Figure 5
Figur 5: (A) JIG som inneholder et PBS-bad (3D-trykt) (B) Stripplassering på jIG for å sikre riktig in-line festing av braketter (i lilla) og forhindre tørking av gelen. Denne figuren er endret med tillatelse fra Roitblat Riba et al.41Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: SCyUS-strekkenhet. (A) Flere visninger av en CAD-modell av hoveddelene av SCyUS: spindel koblet til servoen (blå), statisk anker (rød), sett inn som fester silikonstripen ned (lilla) og fiksere som hindrer innsatsen i å stige opp (gulgrønn). En toppvisning av systemet (Ai), en kuttet visning av systemet (Aii) som viser banen til stripen (oransje linje), og en bunnvisning (Aiii) av aluminiumsvæsken godt med en glassdekslerlip. Væskebrønnen kan flyttes opp og ned med dreining av en skrue montert i hovedgjengen. Den oppadgående bevegelsen av aluminiumsbrønnen er begrenset av den lilla innsatsens sidevinger, som vist av de hvite pilene (B) Det faktiske systemet: (1) statisk anker (2) grønt ikke-strekkbart stoff (3) skrue for aluminium flytende brønnhøydekontroll (4) rød pin-down innsats (5) en silikonstrimmel med en sirkulær utsparing (6) blå tilkoblingsklemmer (C) Strekksystemet plassert på et konfektmikroskop. Servomotoren og spindelen vises med piler. Denne figuren er endret med tillatelse fra Roitblat Riba et al.41Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Sørg for tilstrekkelig gel for prøvetaking

  1. Bruk det konfokale mikroskopet (Materialtabell) til å ta en lav forstørrelse (10×), lav oppløsning (~1,4 μm x 1,4 μm pikselstørrelse) konfokal Z-stakk (≤10 Z-skiver med en trinnstørrelse på ca. 10 μm er tilstrekkelig) flisbilde av hele gelen ved hjelp av lasere på 488/543/561 for å undersøke homogenitet og vedheft til omkretsen av den geometriske utskjæringen gjennom tykkelsen på silikonet (Figur 7A-B). Bruk dette Z-stack-bildet som et kart for følgende trinn.
  2. Bruk levende bildebehandling med lav oppløsning, skann gelen og bestem den laveste Z-posisjonender full vedheft til de indre veggene i utsparingen er tydelig uten tårer eller bobler og noterer Z-plasseringentil mikroskopet (Zl). For å bestemme full vedheft av gelen til silikonet gjennom hele omkretsen, skann grensesnittet til gelens fluorescerende etikett og silikonstripen (mørk bakgrunn) under mikroskopet (Figur 7C).
  3. Beveg deg opp i Z-retningtil det ikke lenger er kontinuitet i gelen og noter Z-posisjonen(Zu):
  4. Trekk den øvre grensen (Zu) for Z-retningen fra den nedre grensen (Zl). Dette er referansetykkelsen for eksemplet (Zo):
    Equation 1
    Hvis Zo ≥ 100 μm, anses gelen som tilfredsstillende for analyse. Legg merke til at tykkelsen på silikonutskjæringen er ca. 500 μm, men gelpolymerisering i utskjæringen resulterer vanligvis i en mindre geltykkelse. 100 μm er den minste anbefalte tykkelsen for å sikre en stabil strekkprosess, uten tårer eller løsrivelse av gelen fra silikonutsparingen.
    MERK: På forskjellige XY-steder kan tykkelsen på gelen variere. Denne delen av protokollen måler minimumstykkelsen på gelen, slik at vi kan bestemme gelkvaliteten og indikere om det er tilstrekkelig for strekking. I tillegg gir det å finne midten av gelen et referansepunkt for å gå tilbake til etterstrekking, enten statisk eller dynamisk.

Figure 7
Figur 7: Gel homogenitet. Flisbilder ble tatt og sydd ved hjelp av den konfokale mikroskopprogramvaren (Table of Materials) (A) Et enkelt sydd flis Z-stykkebilde av en fibringelprøve med relativt inhomogen fibertetthet på grunn av feil trombin og fibrinogenblanding før polymerisering. Denne gelen vil ikke gi en pålitelig analyse (B) Et enkelt sydd flis Z-stykkebilde av en fibrin gelprøve med relativt homogen fibertetthet. Dette er en akseptabel gel for å strekke eksperimenter. Skalalinjen for bilder A &B er 200 μm (C) Zoom inn i grensesnittet mellom den fluorescerende merkede gelen (rød) og silikonet (svart bakgrunn). Skalastang = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7. SCyUS-drift, strekking og avbildning

  1. Nå som prøven er fastslått å være av tilfredsstillende kvalitet og er satt på SCyUS-enheten riktig, må du bestemme den forhåndsstrakte posisjonen til prøven. Dette oppnås ved å bruke levende avbildning under det konfokale mikroskopet (lik trinn 6.2).
    1. Kontroller at servomotoren er i nullstilling ved å klikke på knappen Gå til null servo pos (klikk på figur 8A og sørg for at figur 8B viser null) og fest den til strekkenheten som vist i figur 6C.
      MERK: Gjør dette trinnet sakte og forsiktig for ikke å legge overflødig spenning på prøven.
    2. Mens du ser for deg prøven, flytter du motoren én grad (figur 8C) om gangen med urviseren ved å klikke +1-knappen til høyre side av utsparingen er observert for å bevege seg. Deretter reverserer du bevegelsen (Figur 8D) tilbake til den nest siste trinnposisjonen ved å klikke på -1-knappen. Dette bekrefter at prøven er under minimal spenning. Klikk på knappen Angi min. servoposisjon (Figur 8E) for å angi referanseposisjonen. Det er mulig å gå tilbake til referanseposisjonen når som helst ved å klikke knappen Gå til min. servoposisjon (Figur 8F).
      MERK: Det anbefales å bruke et mål for høy forstørrelse (≥40×) for dette trinnet for å minimere feil.
    3. Ta en høy forstørrelse (40×), høy oppløsning (~ 0,2 μm × 0,2 μm pikselstørrelse), enkelt Z-stykke flisbilde av hele gelområdet. Dette vil bli brukt som referansebilde for etterbehandlingsanalyse. Det anbefales å ta et enkelt Z-stykkebilde midt i geltykkelsen (ved å bruke Zo fra Eq. 1), dette vil tillate retur til omtrent samme Z-posisjonetter strekking. Ta også hensyn til at høyoppløselige flisbilder av hele gelområdet tar betydelig tid (~ 20-30 min).
    4. Nå er prøven klar for statisk strekking. Juster servomotoren til ønsket strekkstørrelse ved å gå frem én grad (Figur 8C) om gangen i GUI (utfør dette sakte, ca. 1 grad/sekund).
  2. På hver strekkstørrelse der analyse er ønsket, kan du ta et enkelt Z-stykke høyoppløselig flisbilde av hele gelområdet for etterbehandlingsanalyse. I likhet med trinn 6.2, må du kontrollere at gelen ikke har løsnet fra silikonet gjennom hele omkretsen ved å skanne grensesnittet mellom gelen (rød) og silikonet (mørk bakgrunn), på jakt etter endringer i vedheftet fra forrige strekkstørrelse.
    MERK: Under aktiveringen av motoren, bruk levende bildebehandling for å følge gelplasseringen i X-Y (med innstillinger for lav oppløsning og lav forstørrelse). Gelen opplever en Z-Poisson-effekt der bunnen av gelen stiger, derfor bør Z-posisjonentil mikroskopet også justeres til det omtrentlige midten av geltykkelsen for hver strekkstørrelse. Dette kan oppnås ved å beregne Zo (Eq. 1) på nytt for hver strekkstørrelse. Siden strekk i Z-retningener relativt homogen, er det ikke kritisk å finne den nøyaktige senterdybden på gelen.

Figure 8
Figur 8: GUI for SCyUS-kontrollmodulen. (A) Motorens posisjon i grader. Verdien varierer fra -90° til 90° (B) "Set Minimum Servo Position". Denne knappen gir mulighet for en forhåndsinnstilt minimumsposisjon, for å angi en ny referanseposisjon som er forskjellig fra Zero Servo Position (C) 'Plus 1°' -knappen beveger servomotoren en grad med klokken (D) 'Minus 1°' -knappen beveger servomotoren en-graders grader mot klokken (E) 'Gå til nullposisjon'-knappen setter servomotorposisjonen til 0° ([A] vil bli satt til null) (F) 'Gå til minimum servoposisjon'-knappen flytter servomotoren til den brukerdefinerte 'Min' -posisjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

8. Etterbehandling av eksterne belastningsmålinger

  1. Hvis du vil måle de effektive belastningene på utskjæringsgrensene, måler du kant-til-kant-lengdene i strekkretningen (X-aksen) i midten av Y -aksen(figur 9A).
    1. Last opp bildet før strekk til bildebehandlingsprogramvaren (ImageJ FIJI43), og mål den største avstanden fra kant til kant, som er definert som hullets aksiale lengde ( Equation 8 ) i midten.
    2. Definer den største avstanden fra topp til bunn som vinkelrett avstand ( Equation 6 ).
    3. Gjenta denne prosessen for alle bilder med strekkintervall og beregn aksiale ( Equation 7 ) og vinkelrette ( Equation 5 ) avstander til den utskårne periferien (figur 9A, nederst), og utfør deretter følgende beregninger for å finne belastningene på utskjæringskantene:

Equation 2

Equation 3

Figure 9
Figur 9: Gelstammer på grunn av ekstern strekking av silikonstripen. (A) X-Y tverrsnitt av en ikke-strukket fibringel (topp), og etter påføring av εhull = 64% belastning langs x-retningen (bunnen). Gelen er innebygd med fluorescerende perler. De relevante lengdene på d og l som brukes til beregning av εhull er angitt i bildene (B) Zoom-in-bilder av det stiplede firkantede området merket i A (C) Illustrasjon av belastningstypene som vurderes i denne studien: εhull er den aksiale belastningen av utskjæringen ved maksimal diameter, og εgel er den aksiale stammen i midten av gelen (målt ved perleaggregatet) (D) Det ble funnet et lineært forhold mellom εhull og εgel i både xx-retning (rød linje) og yy retning (grønn linje). Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Roitblat Riba et al.41Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

9. Analyse av fiberorientering

  1. Bruk kvantifisering av fiberjustering for å karakterisere den strukturelle responsen til den fibrøse gelen til å øke størrelsene på strekk. Last opp bilder med høy oppløsning til ImageJ FIJI-programvare (NIH)43, og analyser deretter ved hjelp av OrientationJ (EPFL)44-modulen (Innstillinger: Gaussian gradient og 3-pikselvindu, figur 10).
    1. Beregn 2D Nematic Order Parameter (NOP) for orienterings histogrammet som:45
      Equation 4
      MERK: Verdien NOP = 1 indikerer perfekt justering langs aksialretningen (vinkel null) og NOP = 0 indikerer isotropi. Orienteringsvinkelen, θ, er fibervinkelen i forhold til strekkaksen (x-aksen) oppnådd gjennom bildeanalyse og nøyaktig definert i OrientationJ-dokumentasjonen. 44

Figure 10
Figur 10: Fiberorientejustering ved hjelp av FIJI ImageJ-programvare. (A) Hovedmenyen til ImageJ med en pil som indikerer plasseringen av 'Plugins' pulldown-menyen der 'OrientationJ' kan bli funnet. Under den utvidede menyen til 'OrientationJ', klikk på 'OrientationJ Distribution' alternativet (B) OrientationJs distribusjonsmodul. Sett «Lokalt vindu σ» til 3 piksler og «Gradering» til «Gaussian». Trykk deretter på 'Kjør' -knappen (rød pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

10. Manuell intern gelstammeanalyse

  1. Mens du utfører levende høyforstørrelsesavbildning av en hydrogel med innebygde perler, må du manuelt finne et interesseområde (ROI) med lett gjenkjennelige egenskaper (f.eks. aggregater av perler), for å gå tilbake til samme sted etter hver strekkstørrelse.
    MERK: Kompresjon i Z-retning (Poisson-effekten) kan føre til en økning i perletetthet etter hvert som strekningen øker, derfor foreslår vi at du velger perleaggregater som er store nok, slik at de er tydelig identifiserbare. Denne protokollen krever analyse av den sentrale regionen av fibringelen, selv om enhver region kan velges.
  2. I pre-stretch posisjon (trinn 6), ta et høyoppløselig Z-stack bilde av den valgte avkastningen. Etter hvert ønskede strekkintervall går du tilbake til samme avkastning og gjentar bildeopptaksprosessen.
  3. Ta bildene og importer dem til ImageJ. I avkastningen registrerer du X-Y-pikselplasseringen for hver synlige perlemengde. Overføre de registrerte dataene til et regneark.
  4. Mål avstandene mellom hvert par aggregater og sammenlign dem med avstandene til de samme parene i referansebildet, slik at du kan regne av belastninger i X- og Y-retningene.
    MERK: Hvis en kontinuerlig sanntidsfilm spilles inn mens gelen strekkes (i stedet for statisk bildeopptak), kan en automatisk analyse av stammer utføres med digitale bilde- eller volumkorrelasjoner (DIC/ DVC) metoder, som tidligere demonstrert46,47. Det skal imidlertid bemerkes at automatisk DIC / DVC-analyse er utfordrende i denne innstillingen, da Z-stabelenikke bare beveger seg i X-Y-planet, men også i Z-retningenpå grunn av Poisson-effekten (komprimering), som står for betydelige drift under den innspilte filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative data fra statisk strekning av økende størrelser påført silikonstripen som bærer en 3D fibrin hydrogel, innebygd med 1 μm fluorescerende perler, er vist i figur 9. Analysen viser effekten av silikonstrekk på geometriske endringer i utskjæringen samt de utviklede stammene i gelen. Z-stakkbilderav hele gelen brukes til å evaluere deformasjonen av den opprinnelige sirkelformede utskjæringen til elliptisk geometri (figur 9A). Disse bildene brukes til å beregne εxx(hull) (Formel 2). Zooming i og manuell sporing av flere perleaggregater (Figur 9B) under gelstrekking gjør det mulig å beregne lokale gelstammer i midten, i aksiale εxx(gel) og vinkelrette εyy(gel) retninger ( Figur9C,D). De aksiale stammene forplanter seg relativt lineært fra silikonutskjæringskanten til midten av gelen og er større enn de kompressive vinkelrette stammene (Figur 9D).

Høyforstørrelsesbilder av den fluorescerende merkede gelen gjør det mulig å observere og kvantifisere fiberjustering, indusert av silikonstrekningen. Figur 11 viser representative zoom-in-bilder av en typisk ustrakte og relativt isotropisk hydrogel (figur 11A) og en hydrogel under høy 80 % utsparingsstamme som viser svært justerte fibre i strekkretningen (Figur 11B). Analyse av fiberreorientering ved hjelp av ImageJ viste omtrent lineær avhengighet mellom fiberjustering (NOP) og den ytre belastningen på utsparingen (εhull) opp til stammer på 40%, med moderat metning ved stammer over 40% (Figur 11D). En detaljert analyse av fiberjustering i forskjellige Z-skiverer vist i figur 12. Her beregnes histogrammer av fiberjustering for hver Z-skive (figur 12A), i tillegg til tilhørende NOP (figur 12B)og gjennomsnittlig NOP over alle Z-skiver for hver eksterne belastningsstørrelse for utskjæringen (figur 12C). Etter hvert som εhull øker, øker fiberjusteringen, etter en generell ikke-lineær kurve som vist i figur 12C. Vær oppmerksom på at gelen trekker seg sammen langs Z-aksen på grunn av Poisson-effekten, representert av de kortere linjene ved høyere stammer i figur 12B.

Siden det har vist seg vanskelig å utføre grundig analyse av de indre stammene i hele gelen, gir vi her foreløpige resultater av endelige elementsimuleringer (FE) utført på 2D kontinuerlig materiale gitt de mekaniske egenskapene til fibrin (Figur 13). Den ytre stammen av utskjæringen er ~ 40% og fargekartet representerer det strekkinduserte belastningsfeltet. Fargekartet varierer fra 38% -42%, noe som indikerer at gelstammer er relativt homogene i hele det sirkulære gelområdet. Vi merker at hvis andre gelgeometrier brukes, kan gradienter i belastning oppstå, og dette er et tema for fremtidige studier.

For å demonstrere at innebygde fibringeler kan opprettholde vedheft til silikonstripen ved høye stammer (0 til +30%) og frekvenser (opptil 1 Hz), kjørte vi foreløpige tester (protokoll for denne testen er ikke inkludert i dette arbeidet) som ikke viser noen løsrivelser av gelene fra de indre veggene i utsparingen. Tre geler ble testet, gel 1 for en total varighet på ~ 87 minutter, gel 2 i 60 minutter & gel 3 i 30 min totalt (Tabell 1). I alle disse tre tilfellene opprettholdt fibrinhydrgeler sin vedheft til silikonet.

Figure 11
Figur 11: Gelfiberjustering som svar på ekstern strekk. Bilder tatt i midten av en fluorescerende merket gel mens (A) ubelastet og (B) etter påføring av εhull= 80% (C) Gjennomsnittlig histogrammer av fiberretninger under økende εhull [%] stammer. Grå feilfelt indikerer forskjeller mellom 40 skiver i z-stakken som vurderes for hver testede stamme (D) Gjennomsnittlig Nematisk rekkefølgeparameter (NOP) som en funksjon av εhull for tre forskjellige gelprøver (inkludert "Gel 1" som analyseres i figur 11A-C). Feilfelt angir forskjeller mellom sektorer i Z-stabelen for hver strekkstørrelse. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Roitblat Riba et al.41Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12: Analyse av fiberorientering ved hjelp av OrientationJ44-verktøyet (ImageJ-programvare)43 (A) 3D-histogrammer av fiberretning for forskjellige Z-skiver. Vist er eksempler på to histogrammer beregnet for strukket (εhull = 17,6%, topp) og ikke-strukket (bunn) geler. Histogrammet normaliseres slik at området under kurven er lik 1 (B) Resulterende NOP versus Z-dybde; Grafen viser beregningene av NOP for hvert histogram som en funksjon av Z-dybde (C) Mean NOP som en funksjon av εhull. Feilfelt representerer standardavviket for NOP for alle Z-sektorenei en individuell strekkstørrelse på samme XY-punkt i samme gel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: 2D-begrensede elementer (FE) simulering av en strukket gel. Gel strekkes(εhull ≈ 40%) av en silikonbærer. Strekkfelt presenteres med verdier av maksimal hovedstamme der mindre gradienter observeres. Sirkelen som representeres av den stiplede linjen, er hullets forhåndsstrekkede geometri, den opprinnelige lengden (lo) er midtlengden langs x-aksen før strekk påføres, og den strakte lengden (l) er midtlengden langs x-aksen etter at strekk er påført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gel #1 Dynamisk strekkamplitude (frekvens 1 Hz) Dynamisk strekkvarighet (min)
0-37% 0.1
1
5
15
30
0-48% 1
5
30
Total tid under dynamisk strekk 87 min
Gel #2 Dynamisk strekkamplitude (frekvens 1 Hz) Dynamisk strekkvarighet (min)
0-30% 0
10
20
30
0-50% 30
Total tid under dynamisk strekk 60 min
Gel #3 Dynamisk strekkamplitude (frekvens 1 Hz) Dynamisk strekkvarighet (min)
0-30% 10
20
30
Total tid under dynamisk strekk 30 min

Tabell 1: Representative resultater av dynamisk strekkbevis. Tre geler ble innebygd i silikonstrimler og strukket dynamisk (1 Hz) i forskjellige varigheter. Stammer varierte fra null til forskjellige størrelser over 30%. Alle tre gelene opprettholdt vellykket vedheft til de indre veggene i den sirkulære utskjæringen av silikonstripen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden og protokollen som presenteres her er i stor grad basert på vår tidligere studie av Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderer her hele dataassistert design (CAD), Python og mikrokontrollerkoder for SCyUS-enheten.

De viktigste fordelene ved den presenterte metoden over eksisterende tilnærminger inkluderer muligheten til å spenne svært myke 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) fra omkretsen, og under levende konfokal avbildning. Andre metoder er vanligvis begrenset i deres evne til å bruke strekkfelt i Z-aksen og er ikke i stand til å gi in situ mikroskopibilder med høy forstørrelse mens de strekker seg, hovedsakelig på grunn av arbeidsområdebegrensninger fra prøven til objektivlinsen. De fleste tilgjengelige systemer er basert på 2D-substratstrekking, som er begrenset i etterligning av fysiologiske vevsmiljøer.

Begrensninger i systemet inkluderer potensiell inkonsekvent homogenitet av fibertetthet av gel postpolymerisasjonen (Figur 7A), spesielt når store gelvolumer eller komplekse geometrier brukes. Slike ikke-homogeniteter kan føre til ikke-ensartede stammer og fiberjustering i gelen. Videre kan optiske restriksjoner ved relativt dype Z-seksjoner(>30 μm) føre til feil i analysen av fiberorientering.

Kritiske trinn i 3D-strekkprotokollen inkluderer følgende (i) Forsikre deg om at prøvegeler har oppnådd fullstendig vedheft til de indre veggene i den geometriske utskjæringen i silikonet, uten bobler eller tårer, spesielt langs Z-retningen. Fullstendig vedheft og kontinuitet i prøven med en tykkelse på minst 100 μm (Eq. 1) er avgjørende for pålitelig strekk prøven til en ønsket belastning (ii) Fest prøven riktig til SCyUS-enheten før strekking. Det er nødvendig å feste silikonstripen til brakettene og ikke-elastiske stofflengdeforlengere ved hjelp av 3D-trykt jig (figur 5A) og for å validere at alle brikkene er festet in-line, og sikre at belastningen blir indusert i gelen symmetrisk. Dette gjelder også riktig lasting av enhetens spindel (Figur 6B-C) (iii) Ta forsiktig opp referansen (pre-stretch) posisjonen til prøven. Hvis referansebildet tas mens prøven allerede er under spenning (f.eks. på grunn av servomotorens vedlegg før dette trinnet), vil alle strekkmålinger være unøyaktige.

Potensielle fremtidige programmer og modifikasjoner av den presenterte protokollen inkluderer følgende:

(i) Et syklisk strekkregime kan påføres cellen innebygde hydrogeler. Ettersom dynamisk bevegelse av motoren er kodet av mikrokontrollerprogramvaren, kan enhver syklisk profil programmeres, begrenset bare av oppløsningen og rotasjonshastigheten til motoren som brukes i systemet (flere detaljer tilgjengelig i Roitblat Riba et al.41). I dette arbeidet demonstrerte vi at fibringel kan opprettholde vedheft under dynamisk strekk (Tabell 1). Selv om videre testing er nødvendig, vil anvendelsen av syklisk lasting gi innsikt i hydrogelens og innebygde cellers dynamiske respons.

(ii) Geometrien og volumet av silikonutsparingen kan endres. I den nåværende protokollen fokuserte vi bare på geler i en sirkulær geometri. Under slike forhold er indre stammer relativt homogene gjennom hele gelen, som spådd av våre FE-simuleringer (figur 13). Men hvis andre gelgeometrier vil bli vurdert ved å endre utskjæringsdelen av silikonet, vil gradienter dukke opp. For eksempel kan en "diamant" formet cut-out potensielt føre til en gradient i gelstammene på grunn av en gradvis endring i den opprinnelige lengden på utskjæringen langs strekkretningen. Denne metoden for gelstammekontroll er spesielt tiltalende, da forskjellige formede utskjæringer er relativt trivielle å produsere. I tillegg kan tykkelsen og arealet av silikonutskjæringen enkelt endres, noe som muliggjør justeringer i gelvolumer, fra miniatyrvolumer på noen få mikroliter til større volumer forbundet med mm-cm skala gelstørrelser. Videre er det mulig å inkludere flere utskjæringer i samme silikonstrimmel, noe som gjør det mulig å strekke flere geler samtidig.

(iii) Celler kan bygges inn i hydrogelen. Det er noen utfordringer som bør tas i betraktning når du bygger inn celler i de strakte hydrogelene. De fleste celler innebygd i 3D-hydrogeler bruker betydelige trekkraftkrefter på matrisen, samt nedgraderer matrisen over tid. Dette kan resultere i global sammentrekning og fordøyelse av gelen, noe som kan føre til frakobling av gelen fra silikonutskjæringen indre veggen på lengre tider med inkubasjon. En mulig måte å takle denne situasjonen på er å bruke lave cellekonsentrasjoner og begrense tiden for cellulære eksperimenter til et intervall som gelkontraksjon og nedbrytning er minimal. Vi har tidligere demonstrert muligheten for å dyrke fibroblastceller i fibringelen under statisk strekning på 10%, over en periode på 5 timer, uten tegn på gel rive eller frakobling fra silikonet cut-out41.

(iv) Dette oppsettet bør også testes med andre typer hydrogeler, spesielt syntetiske som polyakrylamid (PAA) eller polyetylenglykol (PEG)-baserte hydrogeler, som ofte brukes til cellekultur. Den naturlige vedheften av disse hydrogelene til silikonutskjæringen bør undersøkes, og hvis det viser seg å være utilstrekkelig for gelstrekking, bør teknikker for å oppmuntre til vedheft brukes. Bruken av biologisk lim48,49 eller kjemiske behandlinger50,51,52 til utskjæringsflaten bør vurderes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Noen figurer som er inkludert her har blitt tilpasset ved tillatelse fra Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Anstrengende 3D-hydrogeler med ensartede z-aksestammer samtidig som levende mikroskopiavbildning, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

Bioingeniør Utgave 166 Hydrogel Ekstracellulær matrise Mekanobiologi Cellemekanikk Mekanisk kraft Ekstern strekking Fibrøst nettverk Fiberjustering
Kontrollert stamme av 3D-hydrogeler under levende mikroskopiavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, … More

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter