Den presenterade metoden innebär enaxial sträckning av 3D mjuka hydrogeler inbäddade i silikongummi samtidigt som levande konfokal mikroskopi tillåts. Karakterisering av de yttre och inre hydrogelstammarna samt fiberjustering demonstreras. Enheten och protokollet som utvecklats kan bedöma cellernas reaktion på olika stamregimer.
Yttre krafter är en viktig faktor i vävnadsbildning, utveckling och underhåll. Effekterna av dessa krafter studeras ofta med hjälp av specialiserade in vitro-stretchingmetoder. Olika tillgängliga system använder 2D-substratbaserade bårar, medan tillgängligheten till 3D-tekniker för att spänna mjuka hydrogeler är mer begränsad. Här beskriver vi en metod som möjliggör extern sträckning av mjuka hydrogeler från deras omkrets, med hjälp av en elastisk silikonremsa som provbärare. Stretchsystemet som används i detta protokoll är konstruerat av 3D-printade delar och billig elektronik, vilket gör det enkelt och enkelt att replikera i andra labb. Den experimentella processen börjar med polymerisering av tjocka (>100 μm) mjuka fibrinhydrogeler (Elastisk Modulus på ~ 100 Pa) i en utskärning i mitten av en silikonremsa. Silikongelkonstruktioner fästs sedan på den tryckta sträckningsanordningen och placeras på det konfokala mikroskopstadiet. Under levande mikroskopi aktiveras sträckanordningen och gelerna avbildas med olika stretchstorlekar. Bildbehandling används sedan för att kvantifiera de resulterande geldeformationerna, vilket visar relativt homogena stammar och fiberjustering genom hela geléns 3D-tjocklek(Z-axel). Fördelarna med denna metod inkluderar förmågan att spänna extremt mjuka hydrogeler i 3D medan du utför in situ-mikroskopi och friheten att manipulera provets geometri och storlek enligt användarens behov. Dessutom, med korrekt anpassning, denna metod kan användas för att sträcka andra typer av hydrogeler (t.ex. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) och kan möjliggöra analys av celler och vävnadsrespons på yttre krafter under mer biomimetiska 3D-förhållanden.
Vävnadsrespons på mekaniska krafter är en integrerad del av ett brett spektrum av biologiska funktioner, inklusivegenuttryck 1, cell differentiering2, och vävnadsrenovering3. Dessutom kan kraftinducerade förändringar i den extracellulära matrisen (ECM) såsom fiberjustering och förtätning påverka cellbeteende och vävnadsbildning4,5,6. ECM: s fibrösa nätstruktur har spännande mekaniska egenskaper, såsom icke-linjär elasticitet, icke-affindeformation och plastdeformationer7,8,9,10,11,12. Dessa egenskaper påverkar hur celler och deras omgivande mikromiljö reagerar på yttre mekaniska krafter13,14. Att förstå hur ECM och vävnader reagerar på mekaniska krafter kommer att möjliggöra framsteg inom vävnadsteknik och i utvecklingen av mer exakta beräknings- och teoretiska modeller.
De vanligaste metoderna för att mekaniskt sträcka prover har fokuserat på cellbelastade 2D-substrat för att utforska effekterna på cellbeteendet. Dessa inkluderar till exempel att applicera stam på pdms-substrat (polydimethylsiloxane) och analysera cellreorienteringsvinklar i förhållande till sträckriktningen15,16,17,18,19. Ändå är metoder som undersöker 3D-cellinbäddade hydrogelers svar på yttre stretch, en situation som närmare efterliknar vävnadsmikromiljö, mer begränsade. Framsteg mot 3D-sträckningsmetoder är av särskild betydelse eftersom celler beter sig annorlunda på 2D-substrat jämfört med 3D-matriser20. Dessa beteenden inkluderar cellulär omjustering, proteinuttrycksnivåer och migreringsmönster21,22,23.
Metoder och anordningar som möjliggör 3D-provsträckning inkluderar bådekommersiellt tillgängliga 24,25,26,27,28 och de som utvecklats för laboratorieforskning29. Dessa metoder använder distensible silikonrör30,multi-well kammare31,klämmor26,32,bioreaktorer11,33,cantilevers34,35,36, och magneter37,38. Vissa tekniker genererar sträckning som lokalt deformerar 3D-hydrogeler, till exempel genom att dra nålar från två enda punkter i gelén5, medan andra tillåter deformation av hela huvuddelen av gelén16. Dessutom fokuserar de flesta av dessa system på analys av belastningsfältet i X-Y-planet, med begränsad information om belastningsfältet i Z-riktningen. Dessutom kan endast en handfull av dessa enheter mikroskopisk in situ-avbildning. Den största utmaningen med in situ-avbildning med hög förstoring (t.ex. konfokalt mikroskop) är det begränsade arbetsavståndet på några hundra mikrometer från objektivlinsen till provet. Anordningar som tillåter levande avbildning under stretch offrar enhetligheten av belastningen i Z-axelneller är relativt komplexa och svåra att reproducera i andralaboratorier 39,40.
Detta tillvägagångssätt för att sträcka 3D hydrogeler möjliggör statisk eller cyklisk enaxial stam under levande confocal mikroskopi. Sträckanordningen (kallad Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS) är konstruerad med 3D-utskrivna delar och billig hårdvara, vilket möjliggör enkel reproduktion i andra laboratorier. Fäst vid enheten är ett kommersiellt tillgängligt silikongummi med en geometrisk utskärning i mitten. Hydrogelkomponenter polymeriseras för att fylla utskärningen. Under polymerisationen fäster biologiska hydrogeler, såsom fibrin eller kollagen, naturligt på skärningens innerväggar. Med hjälp av SCyUS är silikonremsan uniaxiellt sträckt och överför kontrollerade stammar till den inbäddade 3D-hydrogelen41.
Detta system möjliggör en unik kombination av funktioner och fördelar jämfört med andra befintliga metoder. För det första tillåter systemet enaxial sträckning av tjocka 3D mjuka hydrogeler (>100 μm tjock, <1 kPa styvhet) från periferin, med Z-homogendeformation i hela hydrogelen. Dessa hydrogeler är för mjuka för att greppas och sträckas av konventionella draghållfasta tekniker. För det andra kan sträckningsenheten enkelt replikeras i andra laboratorier eftersom 3D-utskrift är lätt tillgänglig för forskare och elektroniken som används i designen är billig. För det tredje, och kanske den mest attraktiva funktionen, kan geometrin och storleken på utskärningen i silikonremsan lätt manipuleras, vilket möjliggör tunable stamgradienter och gränsförhållanden samt användning av en mängd olika provvolymer, ner till några mikroliter.
Det presenterade protokollet består av gjutning fibrin gel i ~ 2 mm diameter skivor i 0,5 mm tjocka silikon gummiremsor som fortsätter av enaxial stretch under levande confocal mikroskopi. Följande diskuterar i detalj de experimentella förfarandena för att mäta och analysera stammarna som verkar på den geometriska utskärningen, de inre stammarna som utvecklats i hydrogelen, samt resulterande fiberjustering efter olika sträckmanipulationer. Slutligen diskuteras möjligheten att bädda in celler i hydrogelen och utsätta dem för kontrollerad extern sträckning.
Metoden och protokollet som presenteras häri är till stor del baserade på vår tidigare studie av Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderar här den fullständiga datorstödda designen (CAD), Python och mikrokontrollerkoderna för SCyUS-enheten.
De stora fördelarna med den presenterade metoden jämfört med befintliga metoder inkluderar möjligheten att spänna mycket mjuka 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) från deras omkrets och under levande</e…
The authors have nothing to disclose.
Några siffror som ingår här har anpassats med tillstånd från Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019) sila 3D-hydrogeler med enhetliga z-axelstammar samtidigt som de möjliggör levande mikroskopiavbildning.
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |