Vi presenterar en enkel metod för att isolera mycket livskraftiga fett stamceller från mus epididymal fettkuddar med fluorescens aktiverad cell sortering.
Fetma och metabola störningar som diabetes, hjärtsjukdomar och cancer är alla förknippade med dramatisk fettvävnadsrenovering. Vävnad-bosatta fett stamceller (APCs) spelar en nyckelroll i fettvävnad homeostas och kan bidra till vävnad patologi. Den ökande användningen av encellsanalysteknik – inklusive encellig RNA-sekvensering och encellig proteomik – förändrar stam-/stamcellsfältet genom att tillåta oöverträffad upplösning av individuella celluttrycksförändringar inom ramen för förändringar i populationen eller vävnaden. I den här artikeln tillhandahåller vi detaljerade protokoll för att dissekera mus epididymal fettvävnad, isolera enstaka fettvävnad-härledda celler och utföra fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att berika för livskraftig Sca1+/ CD31–/ CD45–/ Ter119– APCs. Dessa protokoll kommer att göra det möjligt för utredare att förbereda högkvalitativa API: er som är lämpliga för nedströmsanalyser som RNA-sekvensering med en cell.
Fettvävnad spelar en nyckelroll i energimetabolismen. Överskott av energi lagras i form av lipider, och fettvävnad kan betydande expansion eller upprullning beroende på näringsstatus och energisk efterfrågan. Expansion av fettvävnad kan bero på en ökning av fettstorleken (hypertrofi) och/eller av en ökning av adipocytnumret (hyperplasi); den senare processen regleras tätt genom spridning och differentiering av fettavkompitorceller1,2. Under fetma expanderar fettvävnad överdrivet, och vävnadsdysfunktion – inklusive hypoxi, inflammation och insulinresistens – utvecklasofta 3,4. Dessa komplikationer är riskfaktorer för många kroniska sjukdomar inklusive högt blodtryck, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar, stroke och cancer5. Att begränsa okontrollerad fettvävnadsexpansion och mildra fettvävnadspatologier är därför högsta biomedicinska forskningsprioriteringar. Under fettvävnad expansion, bosatta fettvävnad-härledda stamceller (ASCs) proliferate och differentiera sekventiellt i preadipocytes (engagerade stamceller) och sedan i mogna adipocyter6. Nyligen genomförda encelliga RNA-sekvensering (scRNA-seq) studier visar att dessa fett stamceller (APC) populationer (ASCs och preadipocytes) uppvisar betydande molekylär och funktionell heterogenitet7,8,9,10,11,12. Till exempel visar ASCs en minskad adipogenic differentieringskapacitet, samtidigt som de uppvisar högre spridnings- och expansionskapacitet, jämfört med preadipocyter7. Ytterligare molekylära skillnader rapporteras inom ASC och preadipocyte populationer, även om funktionell relevans av dessa skillnader är fortfarande oklart7. Tillsammans belyser dessa data komplexiteten i fett stamcellspoolen och understryker behovet av att utveckla och standardisera verktyg för att bättre förstå och manipulera dessa kritiska cellpopulationer.
Detta protokoll beskriver isoleringen av hög lönsamhet Sca1+ fett stamceller populationer från mus epididymal fettkuddar som är lämpliga för känsliga nedströms analyser, inklusive encelliga studier (scRNA-sekvensering) och cell kultur. Isolering och dissociation av epididymala fettkuddar utfördes som tidigarebeskrivits 7,13 med små modifieringar som förbättrar livskraften hos isolerade API: er. I korthet färgas dissocierade celler från epididymala fettkuddar med antikroppar mot Sca1, en markör för både ASCs och preadipocyter6,7och andra härstamningsmarkörer (Lin) : Ter119 (erytroida celler), CD31 (endotelceller) och CD45 (leukocyter). Livskraftiga Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– celler sorteras sedan efter fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Viktigt, detta protokoll validerades genom framgångsrik isolering och analys av livskraftiga Sca1+/ Lin– fett stamceller rapporteras i en nyligen encellig RNA sekvensering studie som identifierade funktionellt heterogena subpopulationer inom ASCs och preadipocytes7.
Enkelcellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) får snabbt dragkraft som ett kraftfullt verktyg för att samtidigt studera olika cellpopulationer på encellsnivå. På grund av höga kostnader i samband med provberedning och hög genomströmningssekvensering är det absolut nödvändigt att optimera cellulära ingångar (hög livskraft och renhet) för att öka sannolikheten för experimentell framgång. Vissa cellberedningsprotokoll förlitar sig på avlägsnande av döda celler och skräp med lågspinntvättar och kolumnbase…
The authors have nothing to disclose.
Vi bekräftar Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility för hjälp med FACS sortering.
1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |