Summary
所述协议使用两种方法对组织样本进行优化定量蛋白学分析：基于标签和无标签量化。基于标签的方法具有更精确的蛋白质量化优势，而无标签方法更具成本效益，用于分析数百个组位样本。
Abstract
质谱学的最新进展导致深度蛋白石分析以及可生成的可靠和可重复的数据集的生成。然而，尽管技术取得了相当大的进步，但来自生物物种（如患者血液、CSF 和组织）的样品制备仍构成相当大的挑战。为了识别生物标志物，组织蛋白学通常提供一个有吸引力的样本来源，将研究结果从长凳翻译到诊所。它可以揭示癌症早期诊断和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病等）的潜在候选生物标志物。组织蛋白质解毒学还根据蛋白质的丰富性产生丰富的系统信息，并有助于解决有趣的生物学问题。
定量蛋白学分析可分为两大类：基于标签的方法和无标签的方法。在基于标签的方法中，蛋白质或肽使用稳定的同位素（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）或化学标签（如 ICAT（同位素编码亲和力标签）、TMT（串联质量标签）或 iTRAQ（用于相对和绝对定量的同质标记）进行标记。基于标签的方法具有更精确的蛋白质定量和使用同位素标签的优势，可以在一个实验中分析多个样本。无标签方法提供了基于标签的方法的具有成本效益的替代方案。根据临床特征，可以分析和比较属于特定组群的数百个患者样本，并与其他组别进行比较。在这里，我们描述了使用无标签和基于标签的蛋白质组分析方法为组织样本优化定量蛋白质组学工作流程，这对生命科学的应用至关重要，尤其是基于生物标志物的发现项目。
Introduction
蛋白造物学技术具有潜力，能够识别和量化潜在的候选标记，可以帮助检测和预测疾病1。质谱学领域的最新进展加速了蛋白质水平的临床研究。研究人员正试图利用质谱学蛋白质组学来应对多种疾病复杂病理生物学的挑战，这些蛋白质组学现在提高了蛋白质识别和定量2的灵敏度。蛋白质的精确定量测量对于理解健康人和患病个体蛋白质之间的动态和空间合作至关重要。然而，这种对蛋白质组范围的分析并不容易。
临床标本的蛋白体分析的一个主要局限性是生物样本的复杂性。研究了许多不同类型的样本来研究这种疾病的蛋白质组，如细胞系、血浆和组织4，5。细胞系被广泛用作体外实验的模型，以模拟疾病进展的不同阶段。然而，细胞系的一个主要局限性是，它们很容易在细胞培养过程中获得基因型和表型变化。体液，如血浆，可能是生物标志物发现的吸引力来源;然而，由于蛋白质高度丰富和蛋白质浓度的动态范围，血浆蛋白质解质学是有点更具挑战性的7。在这里，肽源自最丰富的蛋白质可以抑制那些从低富含蛋白质，即使质量/电荷比是相同的6。虽然在过去几年中，在耗竭和分馏技术方面取得了进步，但获得良好的覆盖范围仍然是等离子体蛋白学8、9的主要限制。更倾向于使用组织进行疾病生物学的蛋白体研究，因为组织样本与疾病部位最接近，并提供高生理和病理信息，以便更好地了解疾病生物学10，11。
在这份手稿中，我们为组织样本的定量蛋白学提供了简化的协议。我们使用了含有8M尿素的缓冲器进行组织解质制备，因为该缓冲器与基于质谱的调查相容。但是，在将盐注入质谱仪之前，必须清洁肽以去除盐分。需要记住的一个重要点是将尿素浓度降低到1米以下，然后加入蛋白消化的试丁二辛，因为试丁二酯在8M尿素浓度下表现出低活性。我们解释了两种定量全球定性定性学方法：使用 iTRAQ（用于相对和绝对量化的同质标记）和无标签量化 （LFQ） 进行基于标签的量化。基于 iTRAQ 的定量蛋白术主要用于比较多种生物条件不同的样本（例如，正常与疾病或经过处理的样本）。该方法利用异位试剂标记肽12的N终端原胺。iTRAQ试剂含有一个N-甲基管道拉齐辛记者组，一个平衡组，和一个N-羟基苏奇尼米德酯组，与肽13的N终端初级胺反应。从每个条件中消化的肽都标有特定的 iTRAQ 试剂。标记后，停止反应，将不同条件下的多肽标记为单管。这种组合样品混合物通过质谱仪进行分析，以进行识别和量化。经过MS/MS分析，生成分子质量低的记者离子片段，并利用这些记者离子的离子强度进行蛋白质的定量。
另一种方法是，无标签量化用于确定复杂样品中蛋白质的相对数量，而无需用稳定的同位素标记肽。
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Protocol
这项研究得到了孟买印度理工学院（IITB-IEC/2016/026）机构审查委员会和道德委员会的审查和批准。患者/参与者表示书面同意参加本研究。
1. 组织解解剂制备
注意：在冰上执行以下所有步骤，以保持蛋白酶处于非活动状态。确保手术刀和使用的任何管子是无菌的，以避免任何交叉污染。
- 在珠子跳动管中加入 +30 毫克组织，加入 200 微升 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 并旋转它。
注：在这项研究中，新鲜冷冻的人类脑肿瘤组织被用于解冻准备。该协议可用于任何新鲜冷冻组织，根据组织类型（软组织或硬组织）和组织细胞的复杂性，进行一些更改。 - 之后，旋转管子以安定组织，并使用移液器小心地取出 PBS。如果组织中仍有血迹，则进行另一次 PBS 清洗。
- 根据制造商协议，加入 300 μL 尿素裂解缓冲器（8 M 尿素、50 m Tris pH 8.0、75 m M NaCl、1 mM MgCl2）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒 （PIC）。
注：裂解缓冲器的体积应足以在声波处理过程中研磨组织并暂停提取的组织。裂解缓冲器太少可能导致组织裂解效率低下，而过多的裂解缓冲会稀释蛋白质裂解。 - 将管子放在冰上，将组织振幅为 40%，为 2.5 分钟，脉冲周期为 5s（分别为 ON/OFF）。
- 在管子中加入硅珠，用珠子搅拌器使组织均质90秒，在冰上孵育5分钟。重复此步骤两次。
- 一旦组织充分同质化，在冰上孵育管子10分钟。
- 孵化后，在 6，018 x g 下离心取样 15 分钟，在 4 °C 下将细胞碎片与超高纳特分离。
- 在新鲜标记管中收集超高纳特，并在 -80 °C 下存储为阿利报价，直到进一步使用。
2. 组织解质的蛋白质定量和质量检查
- 使用补充 文件1中描述的布拉德福德试剂对组织解化物中的蛋白质浓度进行量化。
- 蛋白质量化后，在 12% SDS-PAGE 凝胶上运行 10 μg 的组织解质，以检查解质的质量。
注：必须进行进一步的下游处理，只对清除质量检查的解质进行。
3. 蛋白质的酶消化
注：酶消化的步骤显示在 图1a中。
- 对于消化，服用50微克蛋白质，并加入dH2O，以弥补体积到20微克。
- 现在，从库存中加入 20 m M Tris （2-carboxyethyl） 磷化物 （TCEP）， 将 0.8 μL 从库存添加到蛋白质裂解物中，以减少蛋白质中的脱硫键，并在 37 °C 下孵育样品 60 分钟。
- 在 ddH2O 中准备 40 mM 碘酰胺 （IAA），并添加 1.6 μL 来减少的西苯乙烯残留物。在室温下在黑暗中孵育10分钟。
- 加入含25m Tris pH 8.0和1 mM CaCl2 的稀释缓冲器，以1：8的比例稀释尿素浓度，使样品中的尿素浓度低于1M。此时，请检查 pH 值。
注意：如果使用试丁香作为消化酶，请确保尿素的浓度小于1M。 - 要进行消化，请在酶/基质比为 1：50 时添加试丁香。在37°C的摇晃干浴中将管子孵育16小时，以便过夜消化。
注：试丁酶是一种反应性极强的蛋白酶，容易自我消化。格外小心，并在冰上快速添加试丁二肌。 - 孵化16小时后，在真空浓缩器中干燥消化的肽。
4. 消化肽的脱盐
注意：要执行多肽的脱盐，请使用 C18 阶段提示。
- 通过添加 50 μL 甲醇来激活 C18 阶段提示。在 Rt. 将尖端离心 1，000 x g 2 分钟， 丢弃在管子底部收集的过滤液。重复两次。
- 在 0.1% 的丙酮酸中加入 50 μL 的丙酮酸来洗涤舞台尖端。在 RT 时，以 1，000 x g 的速度离心管 2 分钟，丢弃管底收集的过滤液。重复此步骤两次。
- 添加 50 μL 的 0.1% （v/v） FA 以平衡该列。再次，在 RT 以 1，000 x g 的速度执行离心机 2 分钟，然后丢弃过滤。
- 在 50 μL 的 0.1% 的富酸中重组干燥消化的肽。
注意：在通过样品时避免在舞台提示内形成气泡。在离心过程中，阶段尖端不应完全干燥，因为干燥会导致肽损失。 - 将重组后的肽添加到激活的阶段尖端中，然后以 1，000 x g 的离心离心方法将样品通过舞台尖端，持续 2 分钟。重复此步骤至少四次。将流经存储在 4 °C 下。
- 要清洗样品，请添加 50 μL 的 0.1% （v/v） 福米奇酸。重复离心步骤并丢弃过滤器。
- 对于多肽的消解，在 0.1% 的原酸 （v/v） 中加入 40% （v/v） ACN 的 50 μL，并通过离心通过舞台尖端。用新管收集过滤水。重复步骤与 50% 和 60% ACN 在 0.1% 的原酸，并收集在同一新鲜管中的过滤液。
- 使用真空浓缩器干燥收集在新鲜管中的脱盐肽。
注：干燥的脱盐肽已准备好注射，或可在-20°C下储存6个月。对于长期存储（>6个月），将肽存储在 -80 °C。
5. 脱盐肽的量化
- 在 0.1% FA 中重建干燥的脱盐肽。
- 使用 70% 乙醇用无绒组织擦拭光度测量板。
- 使用 2 μL 的 0.1% FA 设置空白。
- 在复制品中将 2 μL 的重组样品添加到板上。
- 将板放在光谱仪中，测量 205 nm 和 280 nm 的吸收量。
- 使用以下公式计算摩尔吸附率（ε）：
ε = 27 / [1 - 3.85 ] A280 / A205]
注：摩尔吸收（ε）是衡量电子过渡概率或物种吸收电子过渡上特定波长辐射的程度的指标。ε值应在31 mL毫克-1厘米-1至33mL毫克-1厘米-1厘米-1的范围内。如果值不落在范围内，则表示样本未正确消化。 - 使用以下公式计算 μg/μL 中的肽浓度：
肽浓度 = 净 OD （205） / 0.051 * ε
6. 消化肽的无标签定量 （LFQ）
注：对于无标签量化，请使用 补充文件 2中提及的 LC 和 MS 参数。当在质谱仪中运行三个同类型样品的生物复制时，获得了高覆盖率数据。
- 液相色谱设置
- 脱盐肽量化后，在小瓶中取 2 μg 肽，使用 0.1% FA 将体积增加到 10 μL。脱盐肽的浓度为200 ng/μL。
- 打开液相色谱系统的自动采样器（参见 材料表），将小瓶放在自动取样器内。
- 使用 0.1% （v/v） FA 来平衡预列和分析列。
- 从小瓶中取出1微克脱盐消化肽，并将其加载到柱子上。
- 根据样本复杂性设置 LC 梯度。在本实验中，LC梯度用于组织样本的无标签量化 120 分钟。
- MS 设置：在优化任何蛋白酶检测之前，使用任何适合系统软件监测牛血清白蛋白 （BSA） 的一些肽并分析 BSA 的覆盖范围（图 2A，B），对仪器进行质量控制检查。使用 MS 数据采集软件（参见材料表）将采集参数设置到仪器中。
- 打开软件，双击 "设置"仪器 ，并从具有默认参数的肽 ID 中选择模板。
- 使用 补充文件 2 设置 MS 参数并将其 保存 为新方法。
- 现在，打开软件以填写示例详细信息;双击 序列设置，并填写样品类型、样本名称、文件保存位置、仪器方法文件、注射量和样品位置等详细信息。
- 填写完所有信息后，选择行并开始 运行。
7. 消化肽的标签定量 （iTRAQ）
注：基于标签的量化可以使用不同的同质标签（如 iTRAQ 或 TMT 试剂等）进行。在这里，iTRAQ 4-plex用于标记从三个组织样本中消化的肽。下面提到 iTRAQ 4 丛标记的程序。
- 使用 iTRAQ 试剂标记消化肽。
注：在本实验中，使用了来自三个组织样本的肽。从每个组织样本中，80微克消化肽被分四个管中取出，用于用iTRAQ试剂（114、115、116和117）标记（详见补充文件3）。- 在使用 iTRAQ 试剂之前，将试剂的每个小瓶置于室温（约 5 分钟）。给一个大约30s的短暂旋转，使解决方案在每小瓶的底部。
注意：请确保每个小瓶中都存在 10-15 μL 解决方案。 - 对于 iTRAQ 标签，在 iTRAQ 标签套件中提供的 20 μL 溶解缓冲中重新构用干燥肽。
- 通过从套件中提供的小瓶中加入 70 μL 乙醇，将溶液混合 30 秒，旋转 10 秒，重新构造标签。
注：建议所有步骤均按制造商的说明执行。 - 将同质混合的 iTRAQ 标签（114、115、116 和 117）添加到含有肽样品的各自管中，并允许发生标签反应。
- 将每个管子的部件旋转 30s，然后旋转管子 10s，将混合物带回管底。
注：使用 pH 纸检查解决方案的 pH 值。pH 值应大于 8：如果没有，将溶解缓冲器的加起来高达 10 μL 以调整 pH 值。 - 在室温下将每根管子孵育90分钟。在反应结束时，通过添加 MS 级水来淬火管中多余的未绑定标签。
- 在室温下孵育管子30分钟至1小时。
- 孵化结束后，将所有标记的内容转移到单个管中，并在真空浓缩器中干燥标记的肽。
注：对于 TMT 标签，可以遵循类似的标记程序。
- 在使用 iTRAQ 试剂之前，将试剂的每个小瓶置于室温（约 5 分钟）。给一个大约30s的短暂旋转，使解决方案在每小瓶的底部。
- 液相色谱设置
- 将样品重新计算在 0.1% 的富酸中，打开纳米 LC 的自动采样器，并将样品放入自动采样器内。使用 补充文件 2 中提及的参数进行 LC 设置。
- 根据样本的复杂性设置 LC 梯度。LC梯度为180分钟，用于组织样本的标签定量（iTRAQ）。
注：对于不太复杂的样品，短梯度可以有效地分离大多数肽。但是，如果样品非常复杂，请使用更长的梯度来更好地分离多肽。
- iTRAQ 技术的 MS 设置
- 设置基于标签的量化的所有 MS 参数，其方式与无标签量化所用的方式相同，但碰撞能量除外，碰撞能量在基于标签的量化中将 MS/MS 碎片设定为 35%。
8. 数据分析
- 使用商用分析软件分析从 LC 质量光谱仪获得的原始 （MS/MS 频谱） 文件（参见 材料表）。
注：Uniprot （UP000005640） 的人类参考蛋白质组数据库，包括 71，785 个蛋白质序列，用于使用封存 HT 和吉祥物 （v2.6.0） 搜索引擎获取蛋白质标识。无标签量化和基于标签的量化参数在 补充文件4中描述。
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Representative Results
我们使用两种不同的方法来发现蛋白学：无标签和基于标签的蛋白造物学方法。SDS-PAGE上组织样本的蛋白质特征显示了完整的蛋白质，可以考虑进行蛋白质组分析（图2A）。仪器的质量控制检查通过系统适宜性软件进行监控，并显示仪器性能的日变化（图2B）。我们在 LC 梯度 （图 2C）的 30 分钟内观察到 BSA 样本的 91% 序列覆盖。LC梯度使用500 ng的商业HLa细胞消化进行优化，我们观察到2小时梯度中的2425种蛋白质，而1小时梯度中的1488种蛋白质（图2D）。我们能够平均识别池组织样本的所有三个技术复制物中的2428种蛋白质（图2E）。
优化的LC和MS参数应用于三个不同的生物组织样本（图3和补充文件2）。色谱图显示三种不同的生物组织样本之间有良好的可重复性。我们分别从组织样本1、2和3中识别出2725、2748和2718种可量化蛋白质，采用无标签方法。我们观察到，在第一和第二个LFQ实验中，151种蛋白质是常见的，第二和第三个LFQ实验之间共有163种蛋白质，第一次和第三次实验共分187种蛋白质，而所有三个组织样本中共有2190种蛋白质（图4A）。
我们检查了色谱，并检查了 iTRAQ 标签，发现它几乎存在于所有 MS/MS 光谱中。这三套已经运行为 iTRAQ 实验。从每组获得的蛋白质数量分别为2455、2285和2307。287种蛋白质在样本1中很常见，2号样本2，183种蛋白质在样本2和样本3中常见，195种蛋白质在样本1和样本3中常见。所有三个样本中常见的蛋白质总数为1557（图4B）。
我们比较了总肽光谱匹配（PSM）、肽组、总蛋白质、蛋白质组以及从LFQ和iTRAQ实验（图4C）中获得1%FDR后获得的蛋白质数量。
图1：组织蛋白化物的工作流程。（A）样品处理步骤，为MS分析准备组织解析样本。（B） 无标签量化步骤。（C） 基于标签的量化步骤。（D） 使用蛋白质组发现器进行数据分析的步骤。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：组织样本的质量检查控制和仪器的可重复性。 （A） 组织裂解物的质量检查在12%SDS-PAGE（B） 监测BSA的一些肽使用全景检查仪器的变异性在不同的天。（C） BSA 的序列覆盖范围为三个技术复制。（D） 优化组织样本的LC参数。（E） 三种不同生物样本中的肽光谱匹配、肽和蛋白质的数量。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：组织样本蛋白造影分析的LC和MS参数。（A，B）用于分离无标签定量（A）和基于标签的组织样本的肽的液相色谱梯度。（C） 无标签量化和基于标签的量化的 MS 参数。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：无标签和基于标签的组织样本定量。 （A） Venn图表示无标签实验1、2和3组织样本中常见的和排他性的蛋白质。（B） Venn 图表示组织样本中基于标签的实验中的常见和排他性蛋白质 1、2 和 3。（C） 无标签定量 （LFQ） 和基于标签的实验 （iTRAQ） 中，对无标签定量 （LFQ） 和基于标签的实验 （iTRAQ） 中 1% FDR 后肽光谱匹配 （PSM）、 肽组、总蛋白质、蛋白质组和蛋白质数的比较分析。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充文件。请点击这里下载此文件。
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Discussion
生物样本的组织蛋白解学使我们能够探索与疾病进展的不同阶段相关的新的潜在生物标志物。它还解释了信号和与疾病进展相关的通路机制。所述的组织定量蛋白学分析协议提供了可重复的良好覆盖数据。大部分步骤都根据制造商的说明进行了调整。为了获得高质量的数据，以下步骤最为关键。因此，在执行这些步骤时应给予额外的注意。
蛋白质的不完全消化和角蛋白的污染可能会减少蛋白质的覆盖面（n <1000），从而影响整个实验。样品的pH值（pH 8）和样品中尿素的浓度（小于1M）将确保蛋白质的有效消化。使用新鲜缓冲器和小心处理样品将减少角蛋白污染的机会。iTRAQ 试剂成本极高，需要一个复杂的 MS 平台来执行 MS/MS 和软件来分析数据。蛋白造物学实验对盐的污染、肽的量化和iTRAQ/TMT试剂的标签效率很敏感。在 MS/MS 分析之前，请确保消化的肽正确脱盐，以减少数据中的背景噪声。在 iTRAQ 技术中，附加标签的碎片会产生低分子质量的记者离子，可用于相对量化肽及其来源的蛋白质，而对于无标签方法，曲线下的区域则被视为定量。为了增强对蛋白质定量的信心，尤其应进行自主验证实验，进行MM/PRM。
使用两种定量方法（无标签和基于标签的蛋白质解毒术）对组织样本进行分析，以获得蛋白质的良好覆盖。无标签定量蛋白术方法为临床研究提供了多种优点。样品是独立运行的，这对于对患者群体进行的研究尤其重要，因为有大量的样本需要通过质谱仪进行分析。使用技术复制，如优化肽池，即使样品在不同的时间点运行，也可以确保良好的可重复性。这种方法已被用于大型的队列研究，如CPTAC，这是许多国际社会的努力14。
研究中出现的潜在目标可以考虑使用有针对性的蛋白学方法进行验证。我们的结论是，基于组织样本分析的项目可以从本研究中提供的定量蛋白学的详细工作流程中获益匪浅。上述步骤将有助于优化方法并绘制组织样本的蛋白质组图。定量蛋白技术的选择可能取决于样本数量、MS平台的可用性和要解决的生物学问题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们承认MHRD-UAY项目（UCHHATAR AVISHKAR YOJANA），该项目#34_IITB在生物技术部的支持下，在孟买国际信息技术研究所（BT/PR13114/INF/206/206/2015）进行所有MS相关实验。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
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