Summary
वर्णित प्रोटोकॉल दो दृष्टिकोणों का उपयोग करके ऊतक नमूनों का एक अनुकूलित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण प्रदान करता है: लेबल-आधारित और लेबल मुक्त क्वांटिटेशन। लेबल आधारित दृष्टिकोण प्रोटीन के अधिक सटीक मात्रा का लाभ है, जबकि एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण अधिक लागत प्रभावी है और एक पलटन के नमूनों के सैकड़ों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया ।
Abstract
बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में हाल की प्रगति के परिणामस्वरूप मजबूत और प्रजनन योग्य डेटासेट की पीढ़ी के साथ-साथ गहरे प्रोटेओमिक विश्लेषण हुए हैं। हालांकि, काफी तकनीकी प्रगति के बावजूद, रोगी रक्त, सीएसएफ और ऊतक जैसे बायोस्पेसिमेन से नमूना तैयारी अभी भी काफी चुनौतियां बन गई है। बायोमार्कर की पहचान करने के लिए, ऊतक प्रोटेओमिक्स अक्सर बेंच से क्लिनिक में अनुसंधान निष्कर्षों का अनुवाद करने के लिए एक आकर्षक नमूना स्रोत प्रदान करता है। यह कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग आदि के शीघ्र निदान के लिए संभावित उम्मीदवार बायोमार्कर प्रकट कर सकता है। ऊतक प्रोटेओमिक्स भी प्रोटीन की बहुतायत के आधार पर प्रणालीगत जानकारी का खजाना पैदावार और दिलचस्प जैविक सवालों को संबोधित करने में मदद करता है ।
मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण को दो व्यापक श्रेणियों में बांटा जा सकता है: एक लेबल-आधारित और लेबल-मुक्त दृष्टिकोण। लेबल-आधारित दृष्टिकोण में, प्रोटीन या पेप्टाइड्स को स्थिर आइसोटोप जैसे एसिलैक (सेल कल्चर में अमीनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग) या आईसीएटी (आइसोटोप-कोडित एफ़िनिटी टैग), टीएमटी (टैंडेम मास टैग) या आईएआरएक्यू (सापेक्ष और पूर्ण क्वांटिटेशन के लिए आइसोकरिक टैग) जैसे रासायनिक टैग द्वारा लेबल किया जाता है। लेबल-आधारित दृष्टिकोणों में प्रोटीन के अधिक सटीक मात्रा का लाभ होता है और आइसोकरिक लेबल का उपयोग करके, एक ही प्रयोग में कई नमूनों का विश्लेषण किया जा सकता है। लेबल-मुक्त दृष्टिकोण लेबल-आधारित दृष्टिकोणों के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है। एक विशेष पलटन से संबंधित रोगी नमूनों के सैकड़ों विश्लेषण किया जा सकता है और नैदानिक सुविधाओं के आधार पर अन्य साथियों के साथ तुलना में। यहां, हमने लेबल-मुक्त और लेबल-आधारित प्रोटेओम प्रोफाइलिंग विधियों का उपयोग करके ऊतक नमूनों के लिए एक अनुकूलित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो का वर्णन किया है, जो जीवन विज्ञान, विशेष रूप से बायोमार्कर खोज आधारित परियोजनाओं में अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
प्रोटेओमिक्स प्रौद्योगिकियों में संभावित उम्मीदवार मार्कर की पहचान और मात्रा को सक्षम करने की क्षमता है जो रोग का पता लगाने और शकुन में सहायता कर सकते हैं1। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के क्षेत्र में हाल की प्रगति ने प्रोटीन स्तर पर नैदानिक अनुसंधान में तेजी लाई है। शोधकर्ता बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स का उपयोग करके कई बीमारियों के जटिल रोगविज्ञान की चुनौती का समाधान करने की कोशिश कर रहे हैं, जो अब प्रोटीन पहचान और मात्रा2के लिए बढ़ी हुई संवेदनशीलता प्रदान करता है । प्रोटीन का सटीक मात्रात्मक मापन स्वस्थ और रोगग्रस्त व्यक्तियों में प्रोटीन के बीच गतिशील और स्थानिक सहयोग को समझने के लिए महत्वपूर्ण है3. हालांकि, प्रोटेम-वाइड पैमाने पर इस तरह का विश्लेषण आसान नहीं है।
नैदानिक नमूनों की प्रोटेओमिक प्रोफाइलिंग की एक प्रमुख सीमा जैविक नमूनों की जटिलता है। कई विभिन्न प्रकार के नमूनों की जांच की गई है, जैसे सेल लाइन्स, प्लाज्मा, औरऊतकों 4,5जैसे रोग प्रोटेम का अध्ययन करने के लिए। कोशिका लाइनों को व्यापक रूप से रोग प्रगति के विभिन्न चरणों की नकल करने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि, सेल लाइनों के साथ एक प्रमुख सीमा यह है कि वे सेल संस्कृति 6 की प्रक्रिया के दौरान आसानी से जीनोटिपिक और फेनोटाइपिक परिवर्तन प्राप्तकरतेहैं। प्लाज्मा जैसे शरीर के तरल पदार्थ बायोमार्कर खोज के लिए एक आकर्षक स्रोत हो सकते हैं; हालांकि, अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन और प्रोटीन एकाग्रता की गतिशील रेंज के कारण, प्लाज्मा प्रोटेओमिक्स थोड़ा और अधिक चुनौतीपूर्ण7है . यहां, पेप्टाइड्स सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से उत्पन्न कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से प्राप्त उन लोगों को दबा सकते हैं, भले ही द्रव्यमान/प्रभारी अनुपात एक ही6है । यद्यपि पिछले कुछ वर्षों में कमी और अंश प्रौद्योगिकियों में प्रगति हुई है, लेकिन अच्छी कवरेज प्राप्त करना अभी भी प्लाज्मा प्रोटेओमिक्स8,9की एक प्रमुख सीमा बनी हुई है। रोग जीव विज्ञान की प्रोटेओमिक जांच के लिए ऊतकों के उपयोग को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि ऊतक के नमूने रोग स्थलों के लिए सबसे समीपस्थ होते हैं और रोग जीव विज्ञान10,11में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उच्च शारीरिक और रोग संबंधी जानकारी प्रदान करते हैं ।
इस पांडुलिपि में, हमने ऊतक नमूनों के मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल प्रदान किया है। हमने टिश्यू लिएट तैयार करने के लिए 8 एम यूरिया युक्त बफर का इस्तेमाल किया है क्योंकि यह बफर मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित जांच के साथ संगत है। हालांकि, पेप्टाइड्स को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्शन लगाने से पहले लवण को हटाने के लिए साफ करना अनिवार्य है। याद रखने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु प्रोटीन पाचन के लिए ट्राइप्सिन जोड़ने से पहले यूरिया एकाग्रता को 1 मीटर से कम करना है क्योंकि ट्राइप्सिन 8 एम यूरिया एकाग्रता पर कम गतिविधि प्रदर्शित करता है। हमने मात्रात्मक वैश्विक प्रोटेओमिक्स के दो दृष्टिकोणों की व्याख्या की है: iTRAQ (सापेक्ष और पूर्ण मात्राकरण के लिए आइसोकरिक टैग) और लेबल-मुक्त क्वांटिफिकेशन (एलएफक्यू) का उपयोग करके लेबल-आधारित मात्राकरण। आईआरएक्यू-आधारित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स का उपयोग मुख्य रूप से उनकी जैविक स्थिति (जैसे, सामान्य बनाम रोग या उपचारित नमूनों) में भिन्न कई नमूनों की तुलना करने के लिए किया जाता है। यह दृष्टिकोण पेप्टाइड्स12के एन-टर्मिनल प्राइमरी अमीनों को लेबल करने के लिए आइसोकरिक रिएजेंट्स का उपयोग करता है। आईट्रैका अभिकर्मकों में एक एन-मिथाइल पिपराज़ीन रिपोर्टर समूह, एक बैलेंसर समूह और एक एन-हाइड्रोक्सी सक्सिमाइड एस्टर समूह होता है जो पेप्टाइड्स13के एन-टर्मिनल प्राइमरी अमीनों के साथ प्रतिक्रिया करता है । प्रत्येक स्थिति से पचा पेप्टाइड्स एक विशेष iTRAQ अभिकर्ती के साथ लेबल कर रहे हैं। लेबलिंग के बाद, प्रतिक्रिया बंद कर दी जाती है और विभिन्न स्थितियों से पेप्टाइड्स लेबल को एक ही ट्यूब में जमा किया जाता है। इस संयुक्त नमूना मिश्रण पहचान और मात्राकरण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा विश्लेषण किया जाता है। एमएस/एमएस विश्लेषण के बाद, कम आणविक जनता के साथ रिपोर्टर आयन टुकड़े उत्पन्न होते हैं और इन रिपोर्टर आयनों की आयन तीव्रता का उपयोग प्रोटीन की मात्रा के लिए किया जाता है ।
एक अन्य दृष्टिकोण, लेबल-मुक्त मात्राकरण का उपयोग स्थिर आइसोटोप के साथ पेप्टाइड्स लेबलिंग के बिना जटिल नमूनों में प्रोटीन की सापेक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
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Protocol
इस अध्ययन की समीक्षा की गई और संस्थागत समीक्षा बोर्डों और भारतीय प्रौद्योगिकी संस्थान बंबई (आईआईटीबी-आईईसी/2016/026) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । रोगियों/प्रतिभागियों ने इस अध्ययन में भाग लेने के लिए अपनी लिखित सहमति प्रदान की ।
1. टिश्यू lysate तैयारी
नोट: प्रोटेज को निष्क्रिय रखने के लिए बर्फ पर निम्नलिखित सभी चरणों को करें। सुनिश्चित करें कि स्केलपेल और उपयोग की जाने वाली कोई भी ट्यूब किसी भी क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए बाँझ हैं।
- एक मनका पिटाई ट्यूब में ~ 30 मिलीग्राम ऊतक लें, 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 200 माइक्रोन जोड़ें और इसे भंवर।
नोट: इस अध्ययन में, ताजा जमे हुए मानव ब्रेन ट्यूमर ऊतकों लाइसेट तैयारी के लिए लिया गया था। प्रोटोकॉल ऊतकों के प्रकार (नरम या कठिन ऊतकों) और ऊतकों की सेलुलर जटिलता के आधार पर कुछ परिवर्तनों के साथ किसी भी ताजा जमे हुए ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - उसके बाद, ऊतक को व्यवस्थित करने के लिए ट्यूब को स्पिन करें और एक पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को ध्यान से हटा दें। यदि ऊतक में अभी भी रक्त के निशान बचे हैं तो एक और पीबीएस वॉश करें।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार यूरिया लाइसिस बफर (8 मीटर यूरिया, 50 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 75 एमएमएम एनएसीएल, 1 एमएमएम एमजीसीएल2)और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (पीआईसी) जोड़ें।
नोट: लाइसिस बफर की मात्रा सोनीशन प्रक्रिया के दौरान ऊतक को पीसने और निकाले गए हिस्से को निलंबित करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए। बहुत कम लाइसिस बफर के परिणामस्वरूप अक्षम ऊतक लाइसिस हो सकता है, जबकि बहुत अधिक लाइसिस बफर प्रोटीन लाइसेट को पतला कर देगा। - बर्फ पर ट्यूब रखें और ऊतक को 2.5 मिनट के लिए 40% के आयाम पर 5 एस (ऑन/ऑफ, क्रमशः) के पल्स चक्रों के साथ रखें।
- ट्यूबों में जिरकोनियम मोती जोड़ें और बर्फ पर 5 मिनट इनक्यूबेशन के साथ 90 एस के लिए एक मनका डिब्बा का उपयोग करके ऊतक को समरूप करें। इस स्टेप को दो बार दोहराएं।
- एक बार जब ऊतक पर्याप्त रूप से समरूप हो जाता है, तो ट्यूब को 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 6,018 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित्र करें ताकि सेल मलबे को सुपरनेट से अलग किया जा सके।
- ताजा लेबल ट्यूब में सुपरनैंट ले लीजिए और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के रूप में स्टोर करें।
2. प्रोटीन मात्राकरण और ऊतक ों की गुणवत्ता की जांच
- पूरक फ़ाइल 1में वर्णित ब्रैडफोर्ड के अभिकर्ण का उपयोग करके ऊतक में प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें ।
- प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के बाद, lysate की गुणवत्ता की जांच करने के लिए 12% SDS-पेज जेल पर 10 माइक्रोन टिश्यू lysate चलाएं।
नोट: गुणवत्ता जांच को साफ करने वाले lysates के लिए केवल डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग किया जाना चाहिए।
3. प्रोटीन का एंजाइमेटिक पाचन
नोट: एंजाइमेटिक पाचन के लिए कदम चित्रा 1aमें दिखाए गए हैं ।
- पाचन के लिए, 50 माइक्रोन प्रोटीन लें और वॉल्यूम को20माइक्रोल तक बनाने के लिए डीडीएच 2 ओ जोड़ें।
- अब, प्रोटीन में डिफाइड बांड को कम करने और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इन्यूबेट करने के लिए स्टॉक से 0.8 माइक्रोन जोड़कर स्टॉक (0.5 M TCEP) से 20 एमएम ट्रिस (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन (टीसीईपी) तैयार करें।
- डीडीएच2ओ में 40 mM iodoacetamide (आईएए) तैयार करें और कम सिस्टीन अवशेषों को एल्किलेट करने के लिए 1.6 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट।
- नमूने में यूरिया एकाग्रता को 1 मीटर से कम करने के लिए 1:8 अनुपात में25 एमएम ट्राइस पीएच 8.0 और 1 एमएमएम सीएसीएल 2 युक्त कमजोर पड़ने वाले बफर जोड़ें। इस बिंदु पर, पीएच की जांच करें।
नोट: यदि पाचन एंजाइम के रूप में ट्रिप्पसिन का उपयोग करते हैं, तो सुनिश्चित करें कि यूरिया की एकाग्रता 1 मीटर से कम है। - पाचन क्रिया करने के लिए, 1:50 के एंजाइम/सब्सट्रेट अनुपात में ट्राइप्सिन जोड़ें। रात भर के पाचन के लिए 16 घंटे के लिए एक मिलाते हुए शुष्क स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
नोट: ट्राइप्सिन एंजाइम एक अत्यधिक प्रतिक्रियाशील प्रोटीज है जो आत्म-पाचन से ग्रस्त है। अतिरिक्त देखभाल करें और बर्फ पर तेजी से ट्राइपसिन के अलावा प्रदर्शन करें। - 16 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, पचा पेप्टाइड्स को वैक्यूम सांस्टसेटर में सुखा लें।
4. पचा पेप्टाइड्स की डेसाल्टिंग
नोट: पेप्टाइड्स की डीसल्टिंग करने के लिए, C18 स्टेज टिप्स का उपयोग करें।
- मेथनॉल के 50 माइक्रोन जोड़कर C18 स्टेज टिप को सक्रिय करें। आरटी में 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर टिप को अपकेंद्रित्र करें। ट्यूब के नीचे एकत्र किए गए फिलेट्रेट को छोड़ें। दो बार दोहराएं।
- स्टेज टिप को धोने के लिए 0.1% फोर्मिक एसिड में एसीटोनीट्रिल का 50 माइक्रोन जोड़ें। आर टी में 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। ट्यूब के नीचे एकत्र किए गए फिलट्रेट को छोड़ दें। इस स्टेप को दो बार दोहराएं।
- कॉलम को बराबर करने के लिए 0.1% (v/v) एफए के 50 माइक्रोन जोड़ें। फिर, आरटी में 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र प्रदर्शन करें और फिलट्रेट को त्यागें।
- 0.1% फोर्मिक एसिड के 50 माइक्रोन में सूखे पचा पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें।
नोट: नमूना पास करते समय स्टेज टिप्स के अंदर हवा बुलबुला गठन से बचें। स्टेज टिप्स को सेंट्रलाइजिंग स्टेप के दौरान पूरी तरह से सूख नहीं जाना चाहिए, क्योंकि सूखने से पेप्टाइड लॉस हो सकता है। - सक्रिय चरण टिप में पुनर्गठित पेप्टाइड्स जोड़ें और 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा चरण टिप के माध्यम से नमूना पारित करें। इस स्टेप को कम से कम चार बार दोहराएं। प्रवाह के माध्यम से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- नमूना धोने के लिए, 0.1% (v/v) फोर्मिक एसिड के 50 माइक्रोन जोड़ें। अपकेंद्रित्र चरण दोहराएं और फिलेट को त्याग दें।
- पेप्टाइड्स के उन्मूलन के लिए, 0.1% फॉरमिक एसिड (v/v) में 40% (v/v) ACN के 50 माइक्रोन जोड़ें और इसे अपकेंद्रित्र द्वारा चरण टिप के माध्यम से पारित करें। एक ताजा ट्यूब में फिल्ट्रेट ले लीजिए। 0.1% फोर्मिक एसिड में 50% और 60% ACN के साथ कदम दोहराएं और एक ही ताजा ट्यूब में फिल्ट्रेट इकट्ठा करें।
- वैक्यूम सांचित का उपयोग करके ताजा ट्यूब में एकत्र किए गए डेसाल्टेड पेप्टाइड्स को सुखाएं।
नोट: सूखे डेसाल्टेड पेप्टाइड्स इंजेक्शन के लिए तैयार हैं, या इसे 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण (>6 महीने) के लिए, पेप्टाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
5. डिसाल्टेड पेप्टाइड्स का मात्राकरण
- 0.1% एफए में सूखे डेसाल्टेड पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें।
- 70% इथेनॉल का उपयोग करके लिंट-फ्री ऊतक के साथ फोटोमेट्रिक माप प्लेट को मिटा दें।
- खाली सेट करने के लिए 0.1% एफए के 2 माइक्रोन का उपयोग करें।
- प्रतिकृति में प्लेट पर पुनर्गठित नमूनों के 2 μL जोड़ें ।
- प्लेट को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें और 205 एनएम और 280 एनएम पर अवशोषण को मापें।
- निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके मोलर अवशोषण (ε) की गणना करें:
ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205]
नोट: मोलर अवशोषण (ε) इलेक्ट्रॉनिक संक्रमण की संभावना का एक उपाय है या कितनी अच्छी तरह एक प्रजाति विकिरण की विशेष तरंगदैर्ध्य को अवशोषित करती है जो उस पर घटना हो रही है। ε का मूल्य 31 मिलीग्राम -1 सेमी-1से 33 एमएल एमजी-1 सेमी-1की सीमा में होना चाहिए। यदि मूल्य सीमा में नहीं आता है, तो यह इंगित करता है कि नमूने ठीक से पचा नहीं रहे हैं। - निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर μg/μL में पेप्टाइड एकाग्रता की गणना करें:
पेप्टाइड की एकाग्रता = नेट ओडी (205) / 0.051 * ε
6. पचा पेप्टाइड्स के लेबल मुक्त क्वांटिटेशन (LFQ)
नोट: लेबल-मुक्त मात्रा के लिए, पूरक फ़ाइल 2में उल्लिखित एलसी और एमएस मापदंडों का उपयोग करें। एक उच्च कवरेज डेटा प्राप्त किया गया था जब नमूने के एक ही प्रकार के तीन जैविक प्रतिकृति बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में चला रहे थे ।
- लिक्विड क्रोमेटोग्राफी सेटअप
- डेसाल्टेड पेप्टाइड्स के मात्राकरण के बाद, एक शीशी में पेप्टाइड्स के 2 माइक्रोन लें और 0.1% एफए का उपयोग करके वॉल्यूम को 10 माइक्रोन तक बनाएं। डेसाल्टेड पेप्टाइड्स की सांद्रता 200 एनजी/माइक्रोन होगी।
- तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली के ऑटो-पारखी को खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) और शीशी को ऑटोस्मलर के अंदर रखें।
- प्री-कॉलम और एनालिटिकल कॉलम को बराबर करने के लिए 0.1% (v/v) एफए का उपयोग करें।
- शीशी से 1 माइक्रोन डिसाल्टेड पचा पेप्टाइड लें और इसे कॉलम पर लोड करें।
- नमूना जटिलता के अनुसार एलसी ढाल निर्धारित करें। इस प्रयोग में, ऊतक नमूनों के लेबल-मुक्त क्वांटिटेशन के लिए एलसी ढाल का उपयोग 120 मिनट के लिए किया गया था।
- एमएस सेटअप: किसी भी प्रोटेओमिक्स परख का अनुकूलन करने से पहले, सिस्टम उपयुक्तता के लिए किसी भी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के कुछ पेप्टाइड्स की निगरानी करके उपकरण की गुणवत्ता नियंत्रण जांच करें और बीएसए(चित्रा 2 ए,बी)के कवरेज का विश्लेषण करें। अधिग्रहण मापदंडों को एमएस डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके उपकरण में स्थापित किया गया था।
- सॉफ्टवेयर खोलें, इंस्ट्रूमेंट सेट अप पर डबल क्लिक करें और डिफॉल्ट पैरामीटर के साथ पेप्टाइड्स-आईडी से टेम्पलेट का चयन करें।
- पूरक फ़ाइल 2 का उपयोग करके एमएस पैरामीटर सेट करें और इसे एक नई विधि के रूप में सहेजें।
- अब, नमूना विवरण भरने के लिए सॉफ्टवेयर खोलें; अनुक्रम सेटअपपर डबल क्लिक करें, और नमूना प्रकार, नमूना नाम, फ़ाइल सेव स्थान, साधन विधि फ़ाइल, इंजेक्शन की मात्रा, और नमूने की स्थिति जैसे विवरण भरें।
- एक बार सारी जानकारी भर जाने के बाद, पंक्ति का चयन करें और रन शुरू करें।
7. पचा पेप्टाइड्स के लेबल आधारित क्वांटिटेशन (iTRAQ)
नोट: लेबल-आधारित मात्राकरण विभिन्न आइसोकरिक लेबल जैसे आईआरएक्यू या टीएमटी रिएजेंट्स आदि का उपयोग करके किया जा सकता है। यहां तीन टिश्यू सैंपल से पचाए पेप्टाइड्स की लेबलिंग के लिए आईएआरएक्यू 4-प्लेक्स का इस्तेमाल किया गया । iTRAQ 4-plex लेबलिंग की प्रक्रिया नीचे उल्लेख किया गया है।
- iTRAQ अभिकर् प का उपयोग करके पचा पेप्टाइड्स की लेबलिंग।
नोट: इस प्रयोग में, तीन ऊतक नमूनों से पेप्टाइड्स का उपयोग किया जाता है। प्रत्येक ऊतक नमूने से, मैंनेराक्यू रिएजेंट्स (114, 115, 116, और 117) (विस्तृत प्रायोगिक मापदंडों के लिए पूरक फ़ाइल 3 देखें) के साथ लेबलिंग के लिए चार ट्यूबों में पचा पेप्टाइड्स के 80 माइक्रोन लिए जाते हैं।- iTRAQ अभिवाचित का उपयोग करने से पहले, अभिकर्ण की प्रत्येक शीशी को कमरे के तापमान (लगभग 5 मिनट) में लाएं। प्रत्येक शीशी के तल पर समाधान लाने के लिए लगभग 30 एस की एक संक्षिप्त स्पिन दें।
नोट: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक शीशी में, 10-15 μL समाधान मौजूद होना चाहिए। - आईएआरएक्यू लेबलिंग के लिए, आईएआरएक्यू लेबलिंग किट में प्रदान किए गए विघटन बफर के 20 माइक्रोल में सूखे पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें।
- किट में प्रदान की गई शीशी से इथेनॉल के 70 माइक्रोन जोड़कर लेबल का पुनर्गठन करें और 30 एस के लिए समाधान मिलाएं और इसे 10 एस के लिए स्पिन करें।
नोट: यह सलाह दी जाती है कि निर्माता के निर्देशों के अनुसार सभी कदम उठाए जाएं। - पेप्टाइड नमूनों वाले अपने संबंधित ट्यूबों में सजातीय मिश्रित iTRAQ लेबल (114, 115, 116 और 117) जोड़ें और लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए अनुमति दें।
- 30 एस के लिए ट्यूब को भंवर से जोड़कर प्रत्येक ट्यूब के घटकों को मिलाएं, और फिर मिश्रण को ट्यूब के नीचे वापस लाने के लिए ट्यूब को 10 एस के लिए स्पिन करें।
नोट: पीएच पेपर का उपयोग करके समाधान के पीएच की जांच करें। पीएच 8 से अधिक होना चाहिए; यदि नहीं, तो पीएच को समायोजित करने के लिए विघटन बफर के 10 माइक्रोन तक जोड़ें। - 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रत्येक ट्यूब इनक्यूबेट। प्रतिक्रिया के अंत में, एमएस ग्रेड पानी जोड़कर ट्यूब में किसी भी अतिरिक्त अनबाउंड लेबल को बुझाएं।
- 30 मिनट से 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
- एक बार इनक्यूबेशन खत्म हो जाने के बाद, सभी लेबल वाली सामग्री को एक ही ट्यूब में स्थानांतरित करें और लेबल वाले पेप्टाइड्स को वैक्यूम सांद्रता में सुखा लें।
नोट: टीएमटी लेबलिंग के लिए इसी तरह की लेबलिंग प्रक्रिया का पालन किया जा सकता है।
- iTRAQ अभिवाचित का उपयोग करने से पहले, अभिकर्ण की प्रत्येक शीशी को कमरे के तापमान (लगभग 5 मिनट) में लाएं। प्रत्येक शीशी के तल पर समाधान लाने के लिए लगभग 30 एस की एक संक्षिप्त स्पिन दें।
- लिक्विड क्रोमेटोग्राफी सेटअप
- नमूनों को 0.1% फॉर्मिक एसिड में पुनर्गठित करें, नैनो एलसी के ऑटोसंप्लर को खोलें, और नमूनों को ऑटोसंप्लर के अंदर रखें। एलसी सेटअप के लिए सप्लीमेंट्री फाइल 2 में बताए गए मापदंडों का उपयोग करें।
- नमूने की जटिलता के अनुसार एलसी ढाल सेट करें। ऊतक नमूनों के लेबल-आधारित क्वांटिटेशन (iTRAQ) के लिए इस प्रयोग में 180 मिनट के एलसी ढाल का उपयोग किया गया था।
नोट: कम जटिल नमूनों के लिए, छोटे ढाल कुशलता से सबसे पेप्टाइड्स अलग कर सकते हैं । हालांकि, यदि नमूना बहुत जटिल है, तो पेप्टाइड्स के बेहतर पृथक्करण के लिए लंबे समय तक ढाल का उपयोग करें।
- iTRAQ तकनीक के लिए एमएस सेटअप
- लेबल आधारित क्वांटिटेशन के लिए सभी एमएस पैरामीटर उसी तरह सेट करें, जैसे कि टक्कर ऊर्जा को छोड़कर लेबल-फ्री क्वांटिटेशन के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जिसे लेबल-आधारित क्वांटिटेशन में एमएस/एमएस विखंडन के लिए ३५% तक सेट किया गया था ।
8. डेटा विश्लेषण
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके एलसी-मास स्पेक्ट्रोमीटर से प्राप्त कच्चे (एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम) फाइलों का विश्लेषण करें ।
नोट: यूनिप्रोट (UP000005640) से मानव संदर्भ प्रोटेम डेटाबेस जिसमें 71,785 प्रोटीन दृश्य शामिल हैं, का उपयोग सेक्वेस्ट एचटी और शुभंकर (v2.6.0) खोज इंजन का उपयोग करके प्रोटीन पहचान प्राप्त करने के लिए किया गया था। लेबल-मुक्त क्वांटिटेशन और लेबल-आधारित क्वांटिटेशन के मापदंडों को पूरक फाइल 4में वर्णित किया गया है।
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Representative Results
हमने डिस्कवरी प्रोटेओमिक्स के लिए दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग किया है: लेबल-मुक्त और लेबल-आधारित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण। एसडीएस-पेज पर ऊतक नमूनों के प्रोटीन प्रोफ़ाइल बरकरार प्रोटीन दिखाया और प्रोटेओमिक विश्लेषण(चित्रा 2A)के लिए विचार किया जा सकता है । उपकरण की गुणवत्ता नियंत्रण जांच सिस्टम उपयुक्तता सॉफ्टवेयर के माध्यम से निगरानी की गई थी और यह साधन प्रदर्शन(चित्रा 2B)में दिन के लिहाज से भिन्नता दिखाया । हमने एलसी ग्रेडिएंट(चित्रा 2 सी)के 30 मिनट में बीएसए नमूने का 91% अनुक्रम कवरेज देखा। एलसी ढाल को वाणिज्यिक हेला सेल डाइजेस्ट के 500 एनजी का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था और हमने 1 घंटे ढाल (चित्रा 2डी) में 1488 प्रोटीन की तुलना में 2 घंटे ढाल में2425प्रोटीन देखे। हम एक पूल ऊतक नमूने (चित्रा 2E) के सभी तीन तकनीकी प्रतिकृति में औसतन,2428प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम थे।
अनुकूलित एलसी और एमएस पैरामीटर तीन अलग-अलग जैविक ऊतक नमूनों(चित्र 3 और अनुपूरक फ़ाइल 2) परलागू किए गए थे। क्रोमेटोग्राम ने तीन विभिन्न जैविक ऊतक नमूनों के बीच अच्छी प्रजनन क्षमता दिखाई। हमने लेबल-मुक्त आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके ऊतक नमूनों 1, 2 और 3 से क्रमशः 2725, 2748 और 2718 मात्रात्मक प्रोटीन की पहचान की। हमने देखा कि पहले और दूसरे एलएफक्यू प्रयोगों में १५१ प्रोटीन आम थे, दूसरे और तीसरे एलएफक्यू प्रयोगों के बीच १६३ प्रोटीन साझा किए गए थे, और पहले और तीसरे प्रयोगों के बीच १८७ प्रोटीन साझा किए गए थे, जबकि तीनों ऊतक नमूनों(चित्रा 4A)में २१९० प्रोटीन आम थे ।
हमने क्रोमाटोग्राम का निरीक्षण किया और आईआरएक्यू लेबल की जांच की और पाया कि यह लगभग सभी एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम में मौजूद है । तीन सेट iTRAQ प्रयोग के लिए चलाया गया है । प्रत्येक सेट से प्राप्त प्रोटीन संख्या क्रमशः 2455, 2285 और 2307 थी। सैंपल 1 में 287 प्रोटीन आम पाए गए और सैंपल 2, सैंपल 2 में 183 प्रोटीन आम थे और सैंपल 3 में 195 प्रोटीन आम थे और सैंपल 1 और सैंपल 3 में 195 प्रोटीन आम थे। तीनों नमूनों में प्रोटीन की कुल संख्या 1557(चित्रा 4B)थी।
हमने कुल पेप्टाइड स्पेक्ट्रल मैचों (पीएसएम), पेप्टाइड समूहों, कुल प्रोटीन, प्रोटीन समूहों और एलएफक्यू और आईआरएक्यू प्रयोग(चित्रा 4C)से 1% एफडीआर के बाद प्राप्त प्रोटीन की संख्या की तुलना की।
चित्रा 1:ऊतक प्रोटेओमिक्स के लिए कार्यप्रवाह। (ए)एमएस विश्लेषण के लिए ऊतक ों से नमूने तैयार करने के लिए नमूना प्रसंस्करण कदम। (ख)लेबल-मुक्त क्वांटिटेशन के लिए कदम । (ग)लेबल आधारित क्वांटिटेशन के लिए कदम । (घ)प्रोटेम डिस्कवरर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण के लिए कदम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2-टिश्यू सैंपल की क्वालिटी चेक कंट्रोल और इंस्ट्रूमेंट की प्रजनन क्षमता। 12% एसडीएस-पेज(बी)पर टिश्यू की क्वालिटी चेकिंग अलग-अलग दिनों में इंस्ट्रूमेंट वेरिबिलिटी की जांच के लिए पैनोरमा का इस्तेमाल करते हुए बीएसए के कुछ पेप्टाइड्स की मॉनिटरिंग होती है। (ग)तीन तकनीकी प्रतिकृति में बीएसए का अनुक्रम कवरेज । (घ)ऊतक नमूनों के लिए एलसी मापदंडों का अनुकूलन। (ङ)तीन अलग-अलग जैविक नमूनों में पेप्टाइड स्पेक्ट्रल मैच, पेप्टाइड्स और प्रोटीन की संख्या। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:ऊतक नमूने के प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए एलसी और एमएस पैरामीटर। (ए, बी)तरल क्रोमेटोग्राफी ढाल ऊतक नमूने के लेबल-मुक्त क्वांटिटेशन(ए)और लेबल आधारित क्वांटिटेशन(बी)के लिए पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है। (ग)लेबल-मुक्त क्वांटिटेशन और लेबल आधारित क्वांटिटेशन के लिए एमएस पैरामीटर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:ऊतक नमूने का लेबल-मुक्त और लेबल-आधारित मात्रा। (ए)वेन आरेख लेबल-मुक्त प्रयोग के ऊतक नमूनों 1, 2 और 3 में आम और अनन्य प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है। (ख)वेन आरेख ऊतक नमूनों में सामान्य और अनन्य प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है 1, 2, और लेबल आधारित प्रयोग के 3 । (ग)लेबल-मुक्त क्वांटिटेशन (एलएफक्यू) और लेबल आधारित प्रयोग (TRATRAQ) में 1% एफडीआर के बाद पेप्टाइड स्पेक्ट्रल मैचों (पीएसएम), पेप्टाइड समूहों, कुल प्रोटीन, प्रोटीन समूहों और प्रोटीन संख्या की संख्या का तुलनात्मक विश्लेषण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
जैविक नमूनों के ऊतक प्रोटेओमिक्स हमें रोग प्रगति के विभिन्न चरणों से जुड़े नए संभावित बायोमार्कर का पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसमें सिग्नलिंग के तंत्र और रोग प्रगति से जुड़े रास्तों के बारे में भी बताया गया है। ऊतक मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए वर्णित प्रोटोकॉल प्रजनन योग्य अच्छा कवरेज डेटा प्रदान करता है। अधिकांश चरणों को निर्माता के निर्देशों से अनुकूलित किया गया है। उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित कदम सबसे महत्वपूर्ण हैं। इसलिए इन कदमों को अंजाम देते समय अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए।
प्रोटीन का अधूरा पाचन और केराटिन का संदूषण प्रोटीन (एन < 1000) का कम कवरेज प्रदान कर सकता है, जिससे समग्र प्रयोग प्रभावित होता है। नमूनों का पीएच (पीएच 8) और नमूनों में यूरिया की एकाग्रता (1 एम से कम) प्रोटीन के कुशल पाचन को सुनिश्चित करेगी। ताजा बफर के उपयोग और देखभाल के साथ नमूनों की हैंडलिंग केराटिन संदूषण की संभावना को कम करेगा। iTRAQ अभिकर्दक बेहद महंगे होते हैं और डेटा का विश्लेषण करने के लिए एमएस/एमएस और सॉफ्टवेयर का प्रदर्शन करने के लिए एक परिष्कृत एमएस प्लेटफॉर्म की आवश्यकता होती है। प्रोटेओमिक्स प्रयोग लवण, पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन और आईएआरएक्यू/टीएमटी रिएजेंट्स की लेबलिंग दक्षता से संदूषण के प्रति संवेदनशील होते हैं । एमएस/एमएस विश्लेषण से पहले, यह सुनिश्चित करें कि डेटा में पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए पचा पेप्टाइड्स को ठीक से desalted हैं । iTRAQ तकनीक के मामले में, संलग्न टैग का विखंडन एक कम आणविक मास रिपोर्टर आयन उत्पन्न करता है जिसका उपयोग पेप्टाइड्स और प्रोटीन को अपेक्षाकृत निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जहां से उनकी उत्पत्ति हुई है, जबकि लेबल-मुक्त दृष्टिकोण के लिए, वक्र के तहत क्षेत्र को मात्रा के लिए माना जाता है। प्रोटीन के क्वांटिटेशन में कॉन्फिडेंस बढ़ाने के लिए खासतौर पर इंडिपेंडेंट वेरीफिकेशन प्रयोग किए जाने चाहिए।
प्रोटीन का एक अच्छा कवरेज प्राप्त करने के लिए दो क्वांटिटेशन विधियों (लेबल-मुक्त और लेबल-आधारित प्रोटेओमिक्स) का उपयोग करके ऊतक नमूनों के विश्लेषण का वर्णन किया गया है। लेबल-मुक्त मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण नैदानिक अध्ययनों में इसके उपयोग के लिए कई फायदे प्रदान करता है। नमूने स्वतंत्र रूप से चलाए जाते हैं, और यह उन अध्ययनों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो रोगी पलटन के लिए किए जाते हैं क्योंकि बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के माध्यम से बड़ी संख्या में नमूनों का विश्लेषण किया जाता है। अनुकूलित पेप्टाइड्स के पूल जैसे तकनीकी दोहराने का उपयोग करना, भले ही नमूनों को विभिन्न समय बिंदुओं पर चलाया जाता हो, तो भी अच्छी प्रजनन क्षमता सुनिश्चित कर सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग सीपीटीएसी जैसे बड़े पलटनअध्ययनोंमें किया गया है, जो कई अंतरराष्ट्रीय समुदायों का प्रयास है।
अध्ययन से उभरने वाले संभावित लक्ष्यों को लक्षित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोणों का उपयोग करके सत्यापन के लिए विचार किया जा सकता है। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि ऊतक नमूनों के विश्लेषण पर आधारित परियोजनाओं को इस अध्ययन में प्रदान किए गए मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के विस्तृत कार्यप्रवाह से भारी लाभान्वित किया जा सकता है। उल्लिखित चरण विधि को अनुकूलित करने और ऊतक नमूनों के प्रोटेम को मैप करने में मदद करेंगे। मात्रात्मक प्रोटेओमिक तकनीकों का चयन नमूनों की संख्या, एमएस प्लेटफार्मों की उपलब्धता और जैविक प्रश्न को संबोधित करने पर निर्भर कर सकता है ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम एमएस से संबंधित सभी प्रयोगों को पूरा करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी विभाग (बीटी/PR13114/INF/22/206/2015) द्वारा समर्थित आईआईटी बॉम्बे में एसएस और मासफिट्ब सुविधा के लिए #34_IITB एमएचआरडी-यूएवाई परियोजना (उछतर एविक योजना) को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
