Summary
Den beskrevne protokol giver en optimeret kvantitativ proteomics analyse af vævsprøver ved hjælp af to tilgange: etiket-baseret og etiket fri kvantitet. Etiketbaserede tilgange har den fordel, at proteiner kvantificeres mere præcist, mens en etiketfri tilgang er mere omkostningseffektiv og bruges til at analysere hundredvis af prøver af en kohorte.
Abstract
Nylige fremskridt inden for massespektrometri har resulteret i dyb proteomisk analyse sammen med generering af robuste og reproducerbare datasæt. Men på trods af de betydelige tekniske fremskridt, prøve forberedelse fra biospecimens såsom patientblod, CSF, og væv stadig udgør betydelige udfordringer. Til identifikation af biomarkører giver vævsproolics ofte en attraktiv prøvekilde til at oversætte forskningsresultaterne fra bænken til klinikken. Det kan afsløre potentielle kandidat biomarkører for tidlig diagnosticering af kræft og neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, osv. Væv proteomics giver også et væld af systemiske oplysninger baseret på overflod af proteiner og hjælper med at løse interessante biologiske spørgsmål.
Kvantitativ proteomics analyse kan grupperes i to brede kategorier: en etiketbaseret og en etiketfri tilgang. I den etiketbaserede tilgang mærkes proteiner eller peptider ved hjælp af stabile isotoper som SILAC (stabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur) eller ved kemiske tags som ICAT (isotopkodede affinitetsmærker), TMT (tandem mass tag) eller iTRAQ (isoobar tag for relativ og absolut kvantitet). Etiketbaserede tilgange har den fordel, at proteiner kvantificeres mere præcist, og ved hjælp af isobariske etiketter kan flere prøver analyseres i et enkelt eksperiment. Den etiketfrie tilgang er et omkostningseffektivt alternativ til etiketbaserede tilgange. Hundredvis af patientprøver, der tilhører en bestemt kohorte, kan analyseres og sammenlignes med andre kohorter baseret på kliniske træk. Her har vi beskrevet en optimeret kvantitativ proteomics workflow for vævsprøver ved hjælp af etiketfri og etiketbaserede proteomprofileringsmetoder, som er afgørende for anvendelser inden for biovidenskab, især biomarkøropdagelsesbaserede projekter.
Introduction
Proteomics-teknologier har potentiale til at muliggøre identifikation og kvantificering af potentielle kandidatmarkører, der kan hjælpe med at opdage og forsmæde sygdommen1. Nylige fremskridt inden for massespektrometri har accelereret klinisk forskning på proteinniveau. Forskere forsøger at løse udfordringen med kompliceret patobiologi af flere sygdomme ved hjælp af massespektrometribaserede proteomics, som nu giver øget følsomhed for proteinidentifikation og kvantificering2. Nøjagtig kvantitativ måling af proteiner er afgørende for at forstå det dynamiske og rumlige samarbejde mellem proteiner hos raske og syge individer3; en sådan analyse i proteom-dækkende skala er dog ikke let.
En væsentlig begrænsning af proteomisk profilering af kliniske prøver er kompleksiteten af biologiske prøver. Mange forskellige typer prøver er blevet undersøgt for at studere sygdommen proteom, såsom cellelinjer, plasma og væv4,5. Cellelinjer er meget udbredt som modeller i in vitro eksperimenter til at efterligne forskellige stadier af sygdomsprogression. Men en stor begrænsning med cellelinjer er, at de let erhverve genotypic og fænotypiske ændringer i løbet af processen med cellekultur6. Kropsvæsker såsom plasma kan være en attraktiv kilde til opdagelse af biomarkører; men på grund af de meget rigelige proteiner og dynamikken i proteinkoncentrationen er plasmaproatomics lidt mere udfordrende7. Her kan peptider stammer fra de mest rigelige proteiner undertrykke dem, der stammer fra de lave rigelige proteiner, selvom masse / opladningsforholdet er det samme6. Selv om der har været fremskridt i udtømning og fraktionering teknologier i de sidste par år, at få god dækning stadig en stor begrænsning af plasma proteomics8,9. Brugen af væv til proteomisk undersøgelse af sygdomsbiologi foretrækkes, da vævsprøver er mest proksimale for sygdomsstederne og tilbyder høj fysiologisk og patologisk information for at give bedre indsigt i sygdomsbiologien10,11.
I dette manuskript har vi leveret en forenklet protokol for kvantitative proteomics af vævsprøver. Vi har brugt en buffer, der indeholder 8 M urinstof til vævslysetpræparatet, da denne buffer er kompatibel med massespektrometribaserede undersøgelser. Det er dog obligatorisk at rengøre peptider for at fjerne salte, før de injiceres i massespektrometeret. Et vigtigt punkt at huske er at reducere urinstofkoncentrationen til mindre end 1 M, før du tilføjer trypsin til proteinfordøjelse, da trypsin udviser lav aktivitet ved 8 M urinstofkoncentration. Vi har forklaret to tilgange til kvantitative globale proteomics: etiketbaseret kvantificering ved hjælp af iTRAQ (isobar tags til relativ og absolut kvantificering) og etiketfri kvantificering (LFQ). De iTRAQ-baserede kvantitative proteomics anvendes hovedsageligt til sammenligning af flere prøver, der varierer i deres biologiske tilstand (f.eks. normal versus sygdom eller behandlede prøver). Tilgangen udnytter isobar reagenser til at mærke N-terminal primære aminer af peptider12. ITRAQ reagenser indeholder en N-methyl piperazin reporter gruppe, en balancer gruppe, og en N-hydroxy kortfattet ester gruppe, der reagerer med N-terminal primære aminer af peptider13. Fordøjede peptider fra hver tilstand er mærket med et bestemt iTRAQ reagens. Efter mærkningen stoppes reaktionen, og mærkede peptider fra forskellige forhold samles i et enkelt rør. Denne kombinerede prøveblanding analyseres med massespektrometer til identifikation og kvantificering. Efter MS/MS-analysen genereres der reporterefragmenter med lave molekylære masser, og disse reporteres ionintensitet anvendes til kvantificering af proteinerne.
En anden tilgang, etiketfri kvantificering bruges til at bestemme det relative antal proteiner i komplekse prøver uden at mærke peptider med stabile isotoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af institutionelle klagenævn og den etiske komité under Det Indiske Teknologiske Institut Bombay (IITB-IEC/2016/026). Patienterne/deltagerne gav deres skriftlige samtykke til at deltage i denne undersøgelse.
1. Væv lysat forberedelse
BEMÆRK: Udfør alle følgende trin på isen for at holde proteaserne inaktive. Sørg for, at skalpellerne og de anvendte rør er sterile for at undgå krydskontaminering.
- Tag ~ 30 mg væv i en perle slå rør, tilsæt 200 μL af 1x fosfat buffer saltvand (PBS) og vortex det.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der taget friske frosne hjernetumorer fra mennesker til lysatpræparatet. Protokollen kan bruges til frisk frosset væv med nogle ændringer afhængigt af typen af væv (blødt eller hårdt væv) og cellulære kompleksitet af væv. - Derefter drejes røret for at afregne vævet og forsigtigt fjerne PBS ved hjælp af en pipette. Udfør en anden PBS vask, hvis der stadig er spor af blod tilbage i vævet.
- Der tilsættes 300 μL urinstof lysisbuffer (8 M urinstof, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2) og proteasehæmmercocktail (PIC) i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: Volumenet af lysis buffer bør være nok til at male vævet under sonikeringsprocessen og til at suspendere, hvad der er ekstraheret. For lidt lysis buffer kan resultere i ineffektive væv lysis, mens for meget lysis buffer vil fortynde proteinlyset. - Placer røret på is og sonikere vævet ved en amplitud på 40% i 2,5 min med puls cyklusser på 5 s (ON / OFF, henholdsvis).
- Tilsæt zirconiumperler til rørene og homogeniser vævet ved hjælp af en perle tæppebanker i 90 s med 5 minutters inkubation på is. Gentag dette trin to gange.
- Når vævet er tilstrækkeligt homogeniseret, inkuberes røret på is i 10 min.
- Efter inkubation centrifugerer prøven ved 6.018 x g i 15 min ved 4 °C for at adskille celleaffaldet fra supernatanten.
- Supernatanten opsamles i det friske mærkede rør, og opbevar det ved -80 °C som aliquots indtil videre brug.
2. Protein kvantificering og kvalitetskontrol af vævslyater
- Kvantificer proteinkoncentrationen i vævslyset ved hjælp af Bradfords reagens som beskrevet i supplerende fil 1.
- Efter proteinkvantificeringen skal du køre 10 μg vævslyt på en 12% SDS-PAGE gel for at kontrollere lysatets kvalitet.
BEMÆRK: Yderligere downstream-behandling må kun udføres for lysater, der rydder kvalitetskontrol.
3. Enzymatisk fordøjelse af proteiner
BEMÆRK: Trinene til enzymatisk fordøjelse er vist i figur 1a.
- For fordøjelsen skal du tage 50 μg proteiner og tilsættes ddH2O for at udgøre volumen til 20 μL.
- Tilbered nu 20 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP) fra bestanden (0,5 M TCEP) ved at tilsætte 0,8 μL fra lager til proteinlyd for at reducere disulfidbindingerne i proteinerne og inkubere prøven ved 37 °C i 60 min.
- Der tilsættes 40 mM iodoacetamid (IAA) i ddH2O og tilsættes 1,6 μL for at alkylere de reducerede cysteinrester. Inkuber i mørket i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fortyndingsbufferen indeholdende 25 mM Tris pH 8,0 og 1 mM CaCl2 i et 1:8-forhold for at fortynde urinstofkoncentrationen til mindre end 1 M i prøven. På dette tidspunkt skal du kontrollere pH-
BEMÆRK: Hvis du bruger trypsin som fordøjelsesenzym, skal du sørge for, at koncentrationen af urinstof er mindre end 1 M. - For at udføre fordøjelsen tilsættes trypsin ved et enzym/substratforhold på 1:50. Inkuberes rørene ved 37 °C i et tørt rystende bad i 16 timer for fordøjelse natten over.
BEMÆRK: Trypsinenzymet er en meget reaktiv protease, der er tilbøjelig til selvfordøjelse. Vær ekstra forsigtig og udfør tilsætning af trypsin hurtigt over isen. - Efter 16 timers inkubation tørres de fordøjede peptider i en vakuumkoncentrator.
4. Afsaltning af fordøjede peptider
BEMÆRK: For at udføre afsaltning af peptider skal du bruge C18-trinstips.
- Aktivér C18-trinspidsen ved at tilsætte 50 μL methanol. Centrifuge spidsen ved 1.000 x g i 2 min på RT. Kassér filtratet indsamlet i bunden af røret. Gentag to gange.
- Der tilsættes 50 μL acetonitril i 0,1% myresyre for at vaske scenespidsen. Centrifuge røret ved 1.000 x g i 2 min på RT. Kassér filtratet indsamlet i bunden af røret. Gentag dette trin to gange.
- Der tilsættes 50 μL på 0,1% (v/v) FA for at ekvilibrere kolonnen. Igen skal du udføre centrifugeringen ved 1.000 x g i 2 min ved RT og kassere filtratet.
- Rekonstruer de tørrede fordøjede peptider i 50 μL på 0,1% myresyre.
BEMÆRK: Undgå dannelse af luftboble inde i scenespidserne, mens prøven passerer. Fasespidserne bør ikke tørres helt under centrifugeringstrinnet, da tørring kan føre til peptidtab. - Tilsæt de rekonstituerede peptider i den aktiverede fasespids og før prøven gennem scenespidsen ved centrifugering ved 1.000 x g i 2 min. Gentag dette trin mindst fire gange. Gem gennemstrømningen ved 4 °C.
- Hvis prøven vaskes, tilsættes 50 μL 0,1 % (v/v) myresyre. Gentag centrifugeringstrinnet, og kassér filtratet.
- Ved fortynding af peptider tilsættes 50 μL på 40% (v/v) ACN i 0,1% myresyre (v/v) og passerer den gennem fasespidsen ved centrifugering. Saml filtratet i et nyt rør. Gentag trinnet med 50% og 60% ACN i 0,1% myresyre og saml filtratet i samme friske rør.
- Tør de afsaltede peptider, der opsamles i det friske rør, ved hjælp af en vakuumkoncentrator.
BEMÆRK: De tørrede afsaltede peptider er klar til at blive injiceret, eller de kan opbevares ved -20 °C i 6 måneder. Ved langtidsopbevaring (>6 måneder) opbevares peptiderne ved -80 °C.
5. Kvantificering af afsaltede peptider
- Rekonstruer de tørrede afsaltede peptider i 0,1% FA.
- Tør den fotometriske måleplade af med fnugfrit væv med 70 % ethanol.
- Brug 2 μL på 0,1% FA til at indstille den tomme.
- Der tilsættes 2 μL rekonstituerede prøver på pladen i replikater.
- Placer pladen i spektrofotometret, og mål absorbansen ved 205 nm og 280 nm.
- Beregn Molar Absorptivity (ε) ved hjælp af følgende formel:
ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
BEMÆRK: Molar absorptivity (ε) er et mål for sandsynligheden for den elektroniske overgang, eller hvor godt en art absorberer den særlige bølgelængde af stråling, der bliver hændelse på den. Værdien af ε skal ligge i intervallet 31 mL mg-1cm-1 til 33 mL mg-1cm-1. Hvis værdien ikke falder i området, indikerer dette, at prøverne ikke fordøjes korrekt. - Peptidkoncentrationen beregnes i μg/μL ved hjælp af følgende formel:
Koncentration af peptid = Netto OD (205) / 0,051 * ε
6. Etiketfri kvantitet (LFQ) af de fordøjede peptider
BEMÆRK: For etiketfri kvantitet skal du bruge de remburs- og MS-parametre, der er nævnt i supplerende fil 2. Der blev indhentet data om høj dækning, da der blev kørt tre biologiske kopier af samme type af prøven i massespektrometeret.
- Opsætning af flydende kromatografi
- Efter kvantificeringen af afkalkede peptider skal du tage 2 μg peptider i et hætteglas og fyldes op til 10 μL ved hjælp af 0,1% FA. Koncentrationen af afsaltede peptider vil være 200 ng/μL.
- Åbn auto-sampleren af det flydende kromatografisystem (se Materialetabel) og placer hætteglasset inde i autosampleren.
- Brug 0,1% (v/v) FA til at ekvilibrere kolonnen for kolonne og analytisk.
- Tag 1 μg af afsaltet fordøjet peptid fra hætteglasset og læg det på kolonnen.
- Indstil remburs-gradienten i henhold til stikprøvens kompleksitet. I dette eksperiment blev LC gradient anvendt i 120 min til etiketfri kvantificering af vævsprøverne.
- MS setup: Før du optimerer proteomics assays, udføre en kvalitetskontrol af instrumentet ved at overvåge nogle peptider af Kvæg Serum Albumin (BSA) ved hjælp af software til systemets egnethed og analysere dækning af BSA (Figur 2A, B). Anskaffelsesparametrene blev sat ind i instrumentet ved hjælp af MS-dataindsamlingssoftwaren (se Materialetabel).
- Åbn softwaren, dobbeltklik på Opsætning af instrument, og vælg skabelonen fra peptid-id med standardparametre.
- Angiv MS-parametrene ved hjælp af supplerende fil 2, og gem den som en ny metode.
- Åbn nu softwaren for at udfylde eksempeloplysningerne; dobbeltklik på sekvensopsætningen, og udfyld detaljerne, f.eks.
- Når alle oplysningerne er udfyldt, skal du markere rækken og starte Kørslen.
7. Etiketbaseret kvantitet (iTRAQ) af fordøjede peptider
BEMÆRK: Etiketbaseret kvantificering kan udføres ved hjælp af forskellige isobariske etiketter såsom iTRAQ- eller TMT-reagenser osv. Her blev iTRAQ 4-plex brugt til mærkning af fordøjede peptider fra tre vævsprøver. Proceduren for iTRAQ 4-plex mærkning er nævnt nedenfor.
- Mærkning af fordøjede peptider ved hjælp af iTRAQ reagenser.
BEMÆRK: I dette eksperiment anvendes peptider fra tre vævsprøver. Fra hver vævsprøve udtages der 80 μg fordøjede peptider i fire rør til mærkning med iTRAQ-reagenser (114, 115, 116 og 117) (se supplerende fil 3 for de detaljerede eksperimentelle parametre).- Før du bruger iTRAQ-reagenset, skal hvert hætteglas i reagenset til stuetemperatur (ca. 5 min). Giv et kort spin på ca. 30 s for at bringe opløsningen i bunden af hvert hætteglas.
BEMÆRK: Sørg for, at der i hvert hætteglas skal være 10-15 μL-opløsning til stede. - Ved iTRAQ-mærkning rekonstitueres de tørrede peptider i 20 μL opløsningsbuffer, der er angivet i iTRAQ-mærkningssættet.
- Rekonstruer etiketterne ved at tilsætte 70 μL ethanol fra hætteglasset i sættet og bland opløsningen til 30 s og drej den i 10 s.
BEMÆRK: Det er tilrådeligt, at alle trin udføres i henhold til producentens anvisninger. - De homogent blandede iTRAQ-etiketter (114, 115, 116 og 117) tilsættes til deres respektive rør, der indeholder peptidprøver, og gør det muligt at mærke reaktionen.
- Bland komponenterne i hvert rør ved at hvirvle røret i 30 s, og drej derefter røret i 10 s for at bringe blandingen tilbage til bunden af røret.
BEMÆRK: Kontroller pH-løsningen ved hjælp af pH-papir. pH skal være større end 8; hvis ikke, tilsættes op til 10 μL af opløsningsbufferen for at justere pH-omkostningerne. - Inkuber hvert rør ved stuetemperatur i 90 min. I slutningen af reaktionen skal du slukke overskydende ubundet etiket i røret ved at tilsætte MS-vand.
- Inkuber rørene ved stuetemperatur i 30 min til 1 time.
- Når inkubationen er overstået, overføres alt det mærkede indhold til et enkelt rør og de mærkede peptider tørres i en vakuumkoncentrator.
BEMÆRK: En lignende mærkningsprocedure kan følges for TMT-mærkning.
- Før du bruger iTRAQ-reagenset, skal hvert hætteglas i reagenset til stuetemperatur (ca. 5 min). Giv et kort spin på ca. 30 s for at bringe opløsningen i bunden af hvert hætteglas.
- Opsætning af flydende kromatografi
- Rekonstituere prøverne i 0,1% myresyre, åbn autosampleren af nano-rems og placer prøverne inde i autosampleren. Brug de parametre, der er nævnt i supplerende fil 2 til LC-opsætning.
- Indstil remburs-gradienten i overensstemmelse med prøvens kompleksitet. LC gradient på 180 min blev anvendt i dette eksperiment til etiketbaseret kvantitet (iTRAQ) af vævsprøverne.
BEMÆRK: For mindre komplekse prøver kan kort gradient effektivt adskille de fleste peptider. Men hvis prøven er meget kompleks, skal du bruge en længere gradient for bedre adskillelse af peptider.
- MS-opsætning til iTRAQ-teknik
- Konfigurer alle MS-parametre for etiketbaseret kvantificering på samme måde som anvendt til den etiketfrie kvantitet med undtagelse af kollisionsenergien, som blev fastsat til 35 % for fragmentering af ms/ms i den etiketbaserede kvantitet.
8. Dataanalyse
- Analysere de rå (MS/MS-frekvenser) filer, der er hentet fra LC-massespektrometer ved hjælp af en kommercielt tilgængelig analysesoftware (se Materialetabel).
BEMÆRK: Human Reference Proteome-databasen fra Uniprot (UP000005640), der omfatter 71.785 proteinsekvenser, blev brugt til at opnå proteinidentiteter ved hjælp af Sequest HT og Mascot (v2.6.0) søgemaskiner. Parametrene for etiketfri kvantitet og etiketbaseret kvantitet er beskrevet i supplerende fil 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brugt to forskellige tilgange til opdagelse proteomics: label-fri og label-baserede proteomics tilgange. Proteinprofilen af vævsprøver på SDS-PAGE viste de intakte proteiner og kunne komme i betragtning til proteomisk analyse (Figur 2A). Kvalitetskontrol af instrumentet blev overvåget via systemegnet software, og det viste den daglige variation i instrumentets ydeevne (figur 2B). Vi observerede 91% sekvensdækning af BSA-prøven i 30 min LC gradient (Figur 2C). LC gradienten blev optimeret ved hjælp af 500 ng kommerciel HeLa cellefordøjelse, og vi observerede 2425 proteiner i en 2 timers gradient sammenlignet med 1488 proteiner i en 1 timers gradient (Figur 2D). Vi var i stand til at identificere i gennemsnit 2428 proteiner på tværs af alle tre tekniske kopier af en poolvævsprøve(Figur 2E).
De optimerede remburs- og MS-parametre blev anvendt på tre forskellige biologiske vævsprøver (figur 3 og supplerende fil 2). Kromatogrammet viste god reproducerbarhed mellem tre forskellige biologiske vævsprøver. Vi identificerede 2725, 2748 og 2718 kvantificerbare proteiner fra vævsprøver 1, 2 og 3 ved hjælp af en etiketfri baseret tilgang. Vi observerede, at 151 proteiner var almindelige i det første og andet LFQ-forsøg, 163 proteiner blev delt mellem det andet og tredje LFQ-forsøg, og 187 proteiner blev delt mellem det første og tredje forsøg, mens 2190 proteiner var almindelige i alle tre vævsprøver (Figur 4A).
Vi inspicerede kromatogrammet og kontrollerede iTRAQ-etiketterne og fandt, at det var til stede i næsten alle MS / MS-spektrum. De tre sæt er kørt til iTRAQ-eksperimentet. Proteintallet fra hvert sæt var henholdsvis 2455, 2285 og 2307. Det viste sig, at 287 proteiner var almindelige i prøve 1, og prøve 2, 183 proteiner var almindelige i prøve 2 og prøve 3, og 195 proteiner var almindelige i prøve 1 og prøve 3. Det samlede antal proteiner, der var almindelige i alle tre prøver, var 1557 (figur 4B).
Vi sammenlignede samlede peptidspektrale (PPM'er), peptidgrupper, samlede proteiner, proteingrupper og antallet af proteiner opnået efter 1% FDR fra LFQ- og iTRAQ-eksperimentet (Figur 4C).
Figur 1: Arbejdsgang for vævsproomomics. (A) Prøvebehandlingstrinene til fremstilling af prøver fra vævslyt til MS-analysen. (B) Trin til etiketfri kvantitet. (C) Trin til etiketbaseret kvantitet. (D) Trin til dataanalyse ved hjælp af en proteomopdager. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvalitetskontrol kontrol af vævsprøver og reproducerbarhed af instrumentet. (A) Kvalitetskontrol af vævslytter på 12% SDS-PAGE (B) Overvågning af nogle peptider af BSA ved hjælp af Panorama for at kontrollere instrumentets variabilitet på tværs af de forskellige dage. (C) Sekvensdækningen af BSA i tre tekniske replikter. (D) Optimering af LC-parametre for vævsprøver. (E) Antallet af peptidspektrale, peptider og proteiner i tre forskellige biologiske prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: LC- og MS-parametre til proteomicsanalyse af vævsprøven. (A,B) Vævsprøvens væskekromatografigradient, der anvendes til at adskille peptider for etiketfri kvantitet (A) og etiketbaseret kvantitet (B). (C) MS-parametrene for kvantificering uden etiketter og etiketbaseret kvantitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Etiketfri og etiketbaseret kvantificering af vævsprøven. (A) Venn-diagrammet repræsenterer de almindelige og eksklusive proteiner i vævsprøverne 1, 2 og 3 i det etiketfrie eksperiment. (B) Venn-diagrammet repræsenterer de almindelige og eksklusive proteiner i vævsprøver 1, 2 og 3 i det etiketbaserede eksperiment. (C) Den sammenlignende analyse af antallet af peptidspektrale (PPM'er), peptidgrupper, samlede proteiner, proteingrupper og proteintal efter 1% FDR i etiketfri kvantitet (LFQ) og etiketbaseret eksperiment (iTRAQ). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende filer. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Væv proteomics af biologiske prøver gør det muligt for os at udforske nye potentielle biomarkører forbundet med forskellige stadier af sygdomsprogression. Det forklarer også mekanismen for signalering og veje forbundet med sygdomsprogression. Den beskrevne protokol for væv kvantitative proteomics analyse giver reproducerbare gode dækningsdata. De fleste af trinene er blevet tilpasset fra producentens anvisninger. For at opnå data af høj kvalitet er følgende trin mest afgørende. Derfor bør der udvises ekstra omhu, mens du udfører disse trin.
Den ufuldstændige fordøjelse af proteiner og forurening af keratin kan give mindre dækning af proteiner (n < 1000), hvilket påvirker det samlede eksperiment. pH-fejl (pH 8) og koncentrationen af urinstof i prøverne (mindre end 1 M) vil sikre en effektiv fordøjelse af proteiner. Brugen af frisk buffer og håndtering af prøver med omhu vil reducere chancerne for keratinforurening. iTRAQ reagenser er ekstremt dyre, og det kræver en sofistikeret MS-platform til at udføre MS / MS og software til at analysere dataene. Proteomics eksperimenterne er følsomme over for forurening fra salte, peptidkvantificering og mærkning af effektiviteten af iTRAQ/TMT-reagenser. Før MS/MS-analysen skal du sikre, at fordøjede peptider afsaltet korrekt for at reducere baggrundsstøjen i dataene. I tilfælde af iTRAQ-teknikken genererer fragmenteringen af det vedhæftede mærke en lav molekylær massereporterion, der kan bruges til relativt at kvantificere peptider og proteiner, hvorfra de stammer fra, mens området under kurven for etiketfri tilgang tages i betragtning til kvantificering. For at øge tilliden til kvantificeringen af proteiner bør der udføres især uafhængige valideringsforsøg, MRM/PRM.
Analysen af vævsprøver ved hjælp af to kvantificeringsmetoder (etiketfri og etiketbaseret proteomics) er blevet beskrevet for at opnå en god dækning af proteiner. Den etiketfri kvantitative proteomics-tilgang giver flere fordele ved dens anvendelse i kliniske undersøgelser. Prøverne køres uafhængigt, og dette er især vigtigt for undersøgelser, der udføres for en patientkohorte, da der er et stort antal prøver, der skal analyseres via massespektrometer. Ved hjælp af en teknisk replikation såsom en pulje af optimerede peptider, kan man sikre god reproducerbarhed, selvom prøverne køres på forskellige tidspunkter. Denne tilgang er blevet brugt i store kohorteundersøgelser såsom CPTAC, som er en indsats fra mange internationale samfund14.
De potentielle mål, der kommer ud af undersøgelsen, kan overvejes med henblik på validering ved hjælp af målrettede proteomics-tilgange. Vi konkluderer, at projekterne baseret på analyse af vævsprøver kunne drage stor fordel af de detaljerede arbejdsgange for kvantitative proteomics, der leveres i denne undersøgelse. De nævnte trin vil bidrage til at optimere metoden og kortlægge proteomet af vævsprøver. Udvælgelsen af kvantitative proteomiske teknikker kan afhænge af antallet af prøver, tilgængeligheden af MS-platforme og det biologiske spørgsmål, der skal behandles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility på IIT Bombay støttet af Department of Biotechnology (BT/PR13114/INF/22/206/2015) til at udføre alle MS-relaterede eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
