Summary
Den beskrevne protokollen gir en optimalisert kvantitativ proteomikkanalyse av vevsprøver ved hjelp av to tilnærminger: etikettbasert og etikettfri kvantasjon. Etikettbaserte tilnærminger har fordelen av mer nøyaktig mengde proteiner, mens en etikettfri tilnærming er mer kostnadseffektiv og brukes til å analysere hundrevis av prøver av en kohort.
Abstract
Nylige fremskritt innen massespektrometri har resultert i dyp proteomisk analyse sammen med generering av robuste og reproduserbare datasett. Til tross for de betydelige tekniske fremskrittene, gir prøvepreparering fra biospecimens som pasientblod, CSF og vev fortsatt betydelige utfordringer. For å identifisere biomarkører gir vevsproteomikk ofte en attraktiv prøvekilde for å oversette forskningsfunnene fra benken til klinikken. Det kan avsløre potensielle kandidatbiomarkører for tidlig diagnose av kreft og nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, etc. Vevsproteomikk gir også et vell av systemisk informasjon basert på overflod av proteiner og bidrar til å løse interessante biologiske spørsmål.
Kvantitativ proteomikkanalyse kan grupperes i to brede kategorier: en etikettbasert og en etikettfri tilnærming. I den etikettbaserte tilnærmingen er proteiner eller peptider merket med stabile isotoper som SILAC (stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekulturen) eller av kjemiske koder som ICAT (isotopkodede affinitetskoder), TMT (tandemmassemerke) eller iTRAQ (isobarisk tag for relativ og absolutt kvantitet). Etikettbaserte tilnærminger har fordelen av mer nøyaktig mengde proteiner og ved hjelp av isobariske etiketter, kan flere prøver analyseres i et enkelt eksperiment. Den etikettfrie tilnærmingen gir et kostnadseffektivt alternativ til etikettbaserte tilnærminger. Hundrevis av pasientprøver som tilhører en bestemt kohort kan analyseres og sammenlignes med andre kohorter basert på kliniske egenskaper. Her har vi beskrevet en optimalisert kvantitativ proteomisk arbeidsflyt for vevsprøver ved hjelp av etikettfrie og etikettbaserte proteomprofileringsmetoder, som er avgjørende for anvendelser i biovitenskap, spesielt biomarkøroppdagelsesbaserte prosjekter.
Introduction
Proteomiske teknologier har potensial til å muliggjøre identifisering og kvantifisering av potensielle kandidatmarkører som kan hjelpe til med deteksjon og prognostisering av sykdommen1. Nylige fremskritt innen massespektrometri har akselerert klinisk forskning på proteinnivå. Forskere prøver å løse utfordringen med komplisert patobiologi av flere sykdommer ved hjelp av massespektrometribasert proteomikk, som nå gir økt følsomhet for proteinidentifikasjon og kvantifisering2. Nøyaktig kvantitativ måling av proteiner er avgjørende for å forstå det dynamiske og romlige samarbeidet mellom proteiner hos friske og syke individer3; Imidlertid er en slik analyse på en proteome-bred skala ikke lett.
En stor begrensning ved proteomisk profilering av kliniske prøver er kompleksiteten i biologiske prøver. Mange forskjellige typer prøver har blitt undersøkt for å studere sykdommen proteom, for eksempel cellelinjer, plasma og vev4,5. Cellelinjer er mye brukt som modeller i in vitro-eksperimenter for å etterligne ulike stadier av sykdomsprogresjon. En stor begrensning med cellelinjer er imidlertid at de lett får genotypiske og fenotypiske endringer under prosessen med cellekultur6. Kroppsvæsker som plasma kan være en attraktiv kilde for biomarkøroppdagelse; På grunn av de svært rikelige proteinene og det dynamiske spekteret av proteinkonsentrasjon, er plasmaproteomikk imidlertid litt mer utfordrende7. Her stammer peptider fra de mest tallrike proteinene kan undertrykke de som er avledet fra de lave rikelige proteinene, selv om masse / ladningsforholdet er det samme6. Selv om det har vært fremskritt i uttømmings- og fraksjoneringsteknologiene de siste årene, er det fortsatt en stor begrensning av plasmaproteomikk8,9. Bruk av vev for proteomisk undersøkelse av sykdomsbiologi foretrekkes da vevsprøver er mest proksimale for sykdomsstedene og tilbyr høy fysiologisk og patologisk informasjon for å gi bedre innsikt i sykdomsbiologien10,11.
I dette manuskriptet har vi gitt en forenklet protokoll for kvantitativ proteomikk av vevsprøver. Vi har brukt en buffer som inneholder 8 M urea for vevslyspreparatet, da denne bufferen er kompatibel med massespektrometribaserte undersøkelser. Det er imidlertid obligatorisk å rengjøre peptidene for å fjerne salter før du injiserer dem i massespektrometeret. Et viktig poeng å huske er å redusere ureakonsentrasjonen til mindre enn 1 M før du legger til trypsin for protein fordøyelse som trypsin viser lav aktivitet ved 8 M urea konsentrasjon. Vi har forklart to tilnærminger til kvantitativ global proteomikk: etikettbasert kvantifisering ved hjelp av iTRAQ (isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering) og etikettfri kvantifisering (LFQ). ITRAQ-basert kvantitativ proteomikk brukes hovedsakelig til å sammenligne flere prøver som varierer i deres biologiske tilstand (f.eks. normal versus sykdom eller behandlede prøver). Tilnærmingen benytter isobariske reagenser for å merke N-terminal primære aminer av peptider12. ITRAQ-reagensene inneholder en N-metyl piperazinreportergruppe, en balansergruppe og en N-hydroksy succinimide estergruppe som reagerer med N-terminal primære aminer av peptider13. Fordøyde peptider fra hver tilstand er merket med et bestemt iTRAQ-reagens. Etter merkingen stoppes reaksjonen og merkede peptider fra forskjellige forhold samles i et enkelt rør. Denne kombinerte prøveblandingen analyseres av massespektrometer for identifisering og kvantifisering. Etter MS/MS-analysen genereres reporterionfragmenter med lave molekylære masser, og ionintensitetene til disse reporterionene brukes til kvantifisering av proteinene.
En annen tilnærming, etikettfri kvantifisering, brukes til å bestemme det relative antallet proteiner i komplekse prøver uten å merke peptider med stabile isotoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle kontrollkomiteer og etikkkomiteen til Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). Pasientene/deltakerne ga skriftlig samtykke til å delta i denne studien.
1. Vev lysat forberedelse
MERK: Utfør alle følgende trinn på isen for å holde proteasene inaktive. Pass på at skalpellene og eventuelle rør som brukes er sterile for å unngå krysskontaminering.
- Ta ~ 30 mg vev i et perleslagsrør, tilsett 200 μL 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) og virvel det.
MERK: I denne studien ble fersk frossent humant hjernesvulstvev tatt for lysatpreparatet. Protokollen kan brukes til ferskt frossent vev med noen endringer avhengig av type vev (mykt eller hardt vev) og cellulær kompleksitet i vevet. - Deretter spinner du røret for å avgjøre vevet og forsiktig fjerne PBS ved hjelp av en pipette. Utfør en annen PBS-vask hvis det fortsatt er spor av blod igjen i vevet.
- Tilsett 300 μL urea lysis buffer (8 M urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2) og proteasehemmercocktail (PIC) i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Volumet av lysisbufferen skal være nok til å male vevet under sonikeringsprosessen og suspendere det som ekstraheres. For lite lysisbuffer kan føre til ineffektiv vevslys, mens for mye lysisbuffer vil fortynne proteinlyset. - Plasser røret på isen og soniker vevet med en amplitude på 40% i 2,5 min med pulssykluser på henholdsvis 5 s (ON/OFF).
- Tilsett zirkoniumperler i rørene og homogeniser vevet ved hjelp av en perle beater i 90 s med 5 min inkubasjon på is. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Når vevet er tilstrekkelig homogenisert, inkuber røret på is i 10 min.
- Etter inkubasjon sentrifugerer du prøven ved 6018 x g i 15 minutter ved 4 °C for å skille celleavfallet fra supernatanten.
- Samle supernatanten i det ferske merkede røret og oppbevar det ved -80 °C som aliquots inntil videre bruk.
2. Protein kvantifisering og kvalitetskontroll av vev lysater
- Kvantifisere proteinkonsentrasjonen i vevslyset ved hjelp av Bradfords reagens som beskrevet i Supplementary File 1.
- Etter protein kvantifisering, kjør 10 μg vev lysat på en 12% SDS-PAGE gel for å sjekke kvaliteten på lysatet.
MERK: Videre nedstrømsbehandling må kun utføres for lysates som fjerner kvalitetskontrollene.
3. Enzymatisk fordøyelse av proteiner
MERK: Trinnene for enzymatisk fordøyelse er vist i figur 1a.
- For fordøyelsen, ta 50 μg proteiner og tilsett ddH2O for å utgjøre volumet til 20 μL.
- Nå, forbered 20 mM Tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) fra lageret (0,5 M TCEP) ved å tilsette 0,8 μL fra lager til proteinlyset for å redusere disulfidbindingene i proteinene og inkubere prøven ved 37 °C i 60 minutter.
- Forbered 40 mM iodoacetamid (IAA) i ddH2O og tilsett 1,6 μL for å alkylere de reduserte cysteinrester. Inkuber i mørket i 10 min ved romtemperatur.
- Tilsett fortynningsbuffer som inneholder 25 mM Tris pH 8,0 og 1 mM CaCl2 i et 1:8-forhold for å fortynne ureakonsentrasjonen til mindre enn 1 M i prøven. På dette tidspunktet, sjekk pH.
MERK: Hvis du bruker trypsin som fordøyelsesenzym, må du sørge for at konsentrasjonen av urea er mindre enn 1 M. - For å utføre fordøyelsen, legg til trypsin ved et enzym / substratforhold på 1:50. Inkuber rørene ved 37 °C i et tørt badekar i 16 timer for fordøyelsen over natten.
MERK: Trypsin-enzymet er en svært reaktiv protease som er utsatt for selvfordøyelse. Vær ekstra forsiktig og utfør tilsetningen av trypsin raskt over isen. - Etter 16 timers inkubasjon, tørk de fordøyde peptidene i en vakuumkonsentrator.
4. Avsalting av fordøyde peptider
MERK: For å utføre avsalting av peptider, bruk C18 trinnspisser.
- Aktiver C18-trinnsspissen ved å legge til 50 μL metanol. Sentrifuger spissen på 1000 x g i 2 min ved RT. Kast filtratet som er samlet inn nederst på røret. Gjenta to ganger.
- Tilsett 50 μL acetonitril i 0,1% maursyre for å vaske scenespissen. Sentrifuger røret ved 1000 x g i 2 min ved RT. Kast filtratet som er samlet inn nederst på røret. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Legg til 50 μL 0,1 % (v/v) FA for å likevekte kolonnen. Igjen, utfør sentrifugeringen på 1000 x g i 2 min ved RT og kast filtratet.
- Rekonstituer de tørkede fordøyde peptidene i 50 μL 0,1% maursyre.
MERK: Unngå luftbobledannelse inne i trinnspissene mens du passerer prøven. Trinntipsene bør ikke tørkes helt under sentrifugeringstrinnet, da tørking kan føre til peptidtap. - Legg de rekonstituerte peptidene i den aktiverte trinnspissen og før prøven gjennom trinnspissen ved sentrifugering ved 1000 x g i 2 minutter. Gjenta dette trinnet minst fire ganger. Oppbevar gjennomstrømningen ved 4 °C.
- For å vaske prøven, tilsett 50 μL 0,1% (v / v) maursyre. Gjenta sentrifugeringstrinnet og kast filtratet.
- For elution av peptider, tilsett 50 μL 40% (v / v) ACN i 0,1% maursyre (v / v) og send den gjennom trinnspissen ved sentrifugering. Samle filtratet i et friskt rør. Gjenta trinnet med 50% og 60% ACN i 0,1% maursyre og samle filtratet i samme friske rør.
- Tørk de avsaltede peptidene som samles inn i det friske røret ved hjelp av en vakuumkonsentrator.
MERK: De tørkede avsaltede peptidene er klare til å injiseres, eller de kan oppbevares ved -20 °C i 6 måneder. For langtidslagring (>6 måneder) må peptidene oppbevares ved -80 °C.
5. Kvantifisering av avsaltede peptider
- Rekonstituer de tørkede avsaltede peptidene i 0,1% FA.
- Tørk av den fotometriske måleplaten med lofritt vev ved hjelp av 70% etanol.
- Bruk 2 μL 0,1 % aktiva for å angi feltet tomt.
- Tilsett 2 μL rekonstituerte prøver på platen i repliker.
- Plasser platen i spektrofotometeret og mål absorbansen ved 205 nm og 280 nm.
- Beregn Molar Absorptivity (ε) ved hjelp av følgende formel:
ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
MERK: Molar absorptivity (ε) er et mål på sannsynligheten for den elektroniske overgangen eller hvor godt en art absorberer den spesielle bølgelengden av stråling som er tilfelle på den. Verdien av ε skal være i området 31 ml mg-1cm-1 til 33 ml mg-1cm-1. Hvis verdien ikke faller i området, indikerer dette at prøvene ikke er riktig fordøyd. - Beregn peptidkonsentrasjonen i μg/μL ved hjelp av følgende formel:
Konsentrasjon av peptid = Netto OD (205) / 0,051 * ε
6. Etikettfri kvantasjon (LFQ) av de fordøyde peptidene
MERK: For etikettfri kvantum, bruk LC- og MS-parameterne som er nevnt i Tilleggsfil 2. Det ble innhentet data med høy dekning da tre biologiske replikeringer av samme type prøve ble kjørt i massespektrometeret.
- Oppsett av flytende kromatografi
- Etter kvantifisering av avsaltede peptider, ta 2 μg peptider i et hetteglass og utgjør volumet til 10 μL ved hjelp av 0,1% FA. Konsentrasjonen av avsaltede peptider vil være 200 ng / μL.
- Åpne den automatiske prøvetakeren til det flytende kromatografisystemet (se Materialtabell) og plasser hetteglasset inne i autosampleren.
- Bruk 0,1 % (v/v) FA til å likevekte kolonnen før kolonnen og analytisk.
- Ta 1 μg avsaltet fordøyd peptid fra hetteglasset og last det på kolonnen.
- Angi LC-graderingen i henhold til prøvekompleksiteten. I dette eksperimentet ble LC gradient brukt i 120 min for etikettfri kvantum av vevsprøvene.
- MS-oppsett: Før du optimaliserer noen proteomiske analyser, må du utføre en kvalitetskontroll av instrumentet ved å overvåke noen peptider av Bovine Serum Albumin (BSA) ved hjelp av programvare for systemtilnærbarhet og analyse av dekning av BSA (Figur 2A,B). Anskaffelsesparameterne ble satt inn i instrumentet ved hjelp av MS-datainnsamlingsprogramvaren (se Tabell over materialer).
- Åpne programvaren, dobbeltklikk på Instrumentoppsett og velg malen fra peptid-ID med standardparametere.
- Angi MS-parameterne ved hjelp av Tilleggsfil 2 og Lagre den som en ny metode.
- Nå åpner du programvaren for å fylle prøvedetaljene; Dobbeltklikk Sekvensoppsett, og fyll ut detaljene som eksempeltype, eksempelnavn, lagringssted for fil, instrumentmetodefil, injeksjonsvolumet og plasseringen av eksemplet.
- Når all informasjonen er fylt ut, merker du raden og starter Kjør.
7. Etikettbasert kvantasjon (iTRAQ) av fordøyde peptider
MERK: Etikettbasert kvantifisering kan utføres ved hjelp av forskjellige isobariske etiketter som iTRAQ- eller TMT-reagenser, etc. Her ble iTRAQ 4-plex brukt til merking av fordøyde peptider fra tre vevsprøver. Prosedyren for iTRAQ 4-plex merking er nevnt nedenfor.
- Merking av fordøyde peptider ved hjelp av iTRAQ-reagenser.
MERK: I dette eksperimentet brukes peptider fra tre vevsprøver. Fra hver vevsprøve tas 80 μg fordøyde peptider i fire rør for merking med iTRAQ-reagenser (114, 115, 116 og 117) (se Tilleggsfil 3 for detaljerte eksperimentelle parametere).- Før du bruker iTRAQ-reagenset, må du bringe hvert hetteglass med reagenset til romtemperatur (ca. 5 min). Gi et kort spinn på ca. 30 s for å bringe løsningen nederst i hvert hetteglass.
MERK: Pass på at det skal være 10-15 μL oppløsning i hvert hetteglass. - For iTRAQ-merking rekonstituerer du de tørkede peptidene i 20 μL oppløsningsbuffer som følger med i iTRAQ-merkingssettet.
- Rekonstituer etikettene ved å tilsette 70 μL etanol fra hetteglasset som følger med i settet, og bland oppløsningen i 30 s og spinn den i 10 s.
MERK: Det anbefales at alle trinnene utføres i henhold til produsentens anvisninger. - Legg til de homogent blandede iTRAQ-etikettene (114, 115, 116 og 117) i de respektive rørene som inneholder peptidprøver og la merkingsreaksjonen finne sted.
- Bland komponentene i hvert rør ved å virvelere røret i 30 s, og spinn deretter røret i 10 s for å bringe blandingen tilbake til bunnen av røret.
MERK: Kontroller pH-en på oppløsningen ved hjelp av pH-papir. pH bør være større enn 8; Hvis ikke, tilsett opptil 10 μL av oppløsningsbufferen for å justere pH. - Inkuber hvert rør ved romtemperatur i 90 min. På slutten av reaksjonen slukker du overflødig ubundet etikett i røret ved å tilsette MS-klasse vann.
- Inkuber rørene ved romtemperatur i 30 min til 1 time.
- Når inkubasjonen er over, overfør alt merket innhold til et enkelt rør og tørk de merkede peptidene i en vakuumkonsentrator.
MERK: En lignende merkingsprosedyre kan følges for TMT-merking.
- Før du bruker iTRAQ-reagenset, må du bringe hvert hetteglass med reagenset til romtemperatur (ca. 5 min). Gi et kort spinn på ca. 30 s for å bringe løsningen nederst i hvert hetteglass.
- Oppsett av flytende kromatografi
- Rekonstituer prøvene i 0,1% maursyre, åpne autosampleren til nano LC, og plasser prøvene inne i autosampleren. Bruk parameterne som er nevnt i Tilleggsfil 2 for LC-oppsett.
- Angi LC-graderingen i henhold til kompleksiteten i prøven. LC gradient på 180 min ble brukt i dette eksperimentet for etikettbasert kvantum (iTRAQ) av vevsprøvene.
MERK: For mindre komplekse prøver kan kort gradient effektivt skille de fleste peptider. Men hvis prøven er svært kompleks, bruk en lengre gradient for bedre separasjon av peptider.
- MS-oppsett for iTRAQ-teknikk
- Definer alle MS-parameterne for etikettbasert kvantasjon på samme måte som brukt for etikettfri kvantasjon, bortsett fra kollisjonsenergien, som ble satt til 35 % for MS/MS-fragmentering i etikettbasert kvantasjon.
8. Dataanalyse
- Analyser råfiler (MS/MS-spektrum) hentet fra LC-massspektrometer ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig analyseprogramvare (se Materialfortegnelser).
MERK: Human Reference Proteome-databasen fra Uniprot (UP000005640) bestående av 71 785 proteinsekvenser ble brukt til å skaffe proteinidentiteter ved hjelp av Sequest HT og Mascot (v2.6.0) søkemotorer. Parameterne for etikettfri kvantum og etikettbasert kvantum er beskrevet i Tilleggsfil 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brukt to forskjellige tilnærminger for oppdagelsesproteomikk: etikettfrie og etikettbaserte proteomiske tilnærminger. Proteinprofilen til vevsprøver på SDS-PAGE viste de intakte proteinene og kunne vurderes for proteomisk analyse (figur 2A). Kvalitetskontrollkontrollen av instrumentet ble overvåket via programvare for systemtilførbarhet, og den viste den daglige variasjonen i instrumentytelsen (Figur 2B). Vi observerte 91 % sekvensdekning av BSA-prøven i 30 minutter med LC-gradient (figur 2C). LC-gradienten ble optimalisert ved hjelp av 500 ng kommersielt HeLa-cellesammendrag, og vi observerte 2425 proteiner i en 2 h gradient sammenlignet med 1488 proteiner i en 1 t gradient (Figur 2D). Vi var i stand til å identifisere i gjennomsnitt 2428 proteiner på tvers av alle tre tekniske replikeringer av en bassengvevsprøve (figur 2E).
De optimaliserte LC- og MS-parametrene ble brukt på tre forskjellige biologiske vevsprøver (Figur 3 og Tilleggsfil 2). Kromatogrammet viste god reproduserbarhet mellom tre forskjellige biologiske vevsprøver. Vi identifiserte henholdsvis 2725, 2748 og 2718 kvantifiserbare proteiner fra vevsprøver 1, 2 og 3 ved hjelp av en etikettfri basert tilnærming. Vi observerte at 151 proteiner var vanlige i første og andre LFQ-eksperimenter, 163 proteiner ble delt mellom andre og tredje LFQ-eksperimenter, og 187 proteiner ble delt mellom første og tredje eksperiment, mens 2190 proteiner var vanlige i alle tre vevsprøver (Figur 4A).
Vi inspiserte kromatogrammet og sjekket iTRAQ-etikettene og fant ut at det var til stede i nesten alle MS / MS-spektrum. De tre settene er kjørt for iTRAQ-eksperimentet. Proteiner oppnådd fra hvert sett var henholdsvis 2455, 2285 og 2307. 287 proteiner ble funnet å være vanlige i prøve 1 og prøve 2, 183 proteiner var vanlige i prøve 2 og prøve 3, og 195 proteiner var vanlige i prøve 1 og prøve 3. Totalt antall proteiner som er vanlige i alle tre prøvene var 1557 (figur 4B).
Vi sammenlignet totale peptidspektralkamper (PSMs), peptidgrupper, totale proteiner, proteingrupper og antall proteiner oppnådd etter 1% FDR fra LFQ- og iTRAQ-eksperimentet (Figur 4C).
Figur 1: Arbeidsflyt for vevsproteomikk. (A) Prøvebehandlingstrinnene for å forberede prøver fra vevslys for MS-analysen. (B) Trinn for etikettfri kvantasjon. (C) Trinn for etikettbasert kvantasjon. (D) Trinn for dataanalyse ved hjelp av en proteom oppdager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvalitetskontroll av vevsprøver og reproduserbarhet av instrumentet. (A) Kvalitetskontroll av vevslys på 12% SDS-PAGE (B) Overvåking av noen peptider av BSA ved hjelp av Panorama for å sjekke instrumentvariabiliteten gjennom de forskjellige dagene. (C) Sekvensdekningen av BSA i tre tekniske replikeringer. (D) Optimalisering av LC-parametere for vevsprøver. (E) Antall peptidspektralkamper, peptider og proteiner i tre forskjellige biologiske prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: LC- og MS-parametere for proteomikkanalyse av vevsprøve. (A,B) Væskekromatografigradienten som brukes til å skille peptidene for etikettfri kvantum (A) og etikettbasert kvantum (B) i vevsprøven. (C) MS-parameterne for etikettfri kvantasjon og etikettbasert kvantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Etikettfri og etikettbasert mengde vevsprøve. (A) Venn-diagram representerer de vanlige og eksklusive proteinene i vevsprøver 1, 2 og 3 av det etikettfrie eksperimentet. (B) Venn-diagrammet representerer de vanlige og eksklusive proteinene i vevsprøver 1, 2 og 3 i det etikettbaserte eksperimentet. (C) Den komparative analysen av antall peptidspektrale treff (PSMs), peptidgrupper, totale proteiner, proteingrupper og proteintall etter 1% FDR i etikettfri kvantasjon (LFQ) og etikettbasert eksperiment (iTRAQ). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfiler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vevsproteomikk av biologiske prøver gjør det mulig for oss å utforske nye potensielle biomarkører forbundet med ulike stadier av sykdomsprogresjon. Det forklarer også mekanismen for signalering og veier forbundet med sykdomsprogresjon. Den beskrevne protokollen for vevse kvantitativ proteomikkanalyse gir reproduserbare gode dekningsdata. De fleste trinnene er tilpasset produsentens instruksjoner. For å få data av høy kvalitet er følgende trinn mest avgjørende. Derfor bør det utvises ekstra forsiktighet mens du utfører disse trinnene.
Den ufullstendige fordøyelsen av proteiner og forurensning av keratin kan gi mindre dekning av proteiner (n < 1000), og dermed påvirke det totale eksperimentet. pH av prøver (pH 8) og konsentrasjon av urea i prøvene (mindre enn 1 M) vil sikre effektiv fordøyelse av proteiner. Bruk av fersk buffer og håndtering av prøver med forsiktighet vil redusere sjansene for keratinforurensning. iTRAQ-reagenser er ekstremt kostbare, og det krever en sofistikert MS-plattform for å utføre MS / MS og programvare for å analysere dataene. Proteomikkforsøkene er følsomme for forurensning fra salter, peptid-kvantifisering og merkingseffektivitet for iTRAQ/TMT-reagenser. Før MS/MS-analysen må du sørge for at fordøyde peptider er riktig avsaltet for å redusere bakgrunnsstøyen i dataene. Når det gjelder iTRAQ-teknikken, genererer fragmentering av den vedlagte taggen en lavmolekylær massereporterion som kan brukes til å relativt kvantifisere peptidene og proteinene de har oppstått fra, mens for etikettfri tilnærming vurderes området under kurven for kvantgering. For å øke tilliten til mengden proteiner, spesielt uavhengige valideringseksperimenter, bør MRM / PRM utføres.
Analysen av vevsprøver ved hjelp av to mengdemetoder (etikettfri og etikettbasert proteomikk) er beskrevet for å oppnå en god dekning av proteiner. Den etikettfrie kvantitative proteomikktilnærmingen gir flere fordeler for bruken i kliniske studier. Prøvene kjøres uavhengig, og dette er spesielt viktig for studier som gjennomføres for en pasientkohort, da det er et stort antall prøver som skal analyseres via massespektrometer. Ved hjelp av en teknisk replikering som et utvalg av optimaliserte peptider, kan man sikre god reproduserbarhet selv om prøvene kjøres på forskjellige tidspunkter. Denne tilnærmingen har blitt brukt i store kohortstudier som CPTAC, som er et forsøk fra mange internasjonale samfunn14.
De potensielle målene som kommer ut av studien kan vurderes for validering ved hjelp av målrettede proteomiske tilnærminger. Vi konkluderer med at prosjektene basert på vevsprøveanalyse kan ha stor nytte av de detaljerte arbeidsflytene for kvantitativ proteomikk som er gitt i denne studien. De nevnte trinnene vil bidra til å optimalisere metoden og kartlegge proteomet av vevsprøver. Valg av kvantitative proteomiske teknikker kan avhenge av antall prøver, tilgjengeligheten av MS-plattformer og det biologiske spørsmålet som skal tas opp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), prosjekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility ved IIT Bombay støttet av Institutt for bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) for å utføre alle MS-relaterte eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
