Summary
Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.
Abstract
Kütle spektrometreslerindeki son gelişmeler, sağlam ve tekrarlanabilir veri kümelerinin üretimiyle birlikte derin proteomik analizlerle sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, önemli teknik gelişmelere rağmen, hasta kanı, CSF ve doku gibi biyospepsimenlerden örnek hazırlama hala önemli zorluklar oluşturmaktadır. Biyobelirteçleri tanımlamak için, doku proteomik genellikle araştırma bulgularını kürsüden kliniğe çevirmek için çekici bir örnek kaynak sağlar. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı gibi kanser ve nörodejeneratif hastalıkların erken tanısı için potansiyel aday biyobelirteçleri ortaya alabilir. Doku proteomik ayrıca proteinlerin bolluğuna dayanan çok sayıda sistemik bilgi verir ve ilginç biyolojik soruların ele alınmasına yardımcı olur.
Nicel proteomik analiz iki geniş kategoride gruplandırılabilir: etiket tabanlı ve etiketsiz bir yaklaşım. Etiket tabanlı yaklaşımda, proteinler veya peptitler SILAC (hücre kültüründe amino asitlerle kararlı izotop etiketlemesi) gibi kararlı izotoplar veya ICAT (izotop kodlu benzeşim etiketleri), TMT (tandem kütle etiketi) veya iTRAQ (göreceli ve mutlak nicelik için izobarik etiket) gibi kimyasal etiketler kullanılarak etiketlenir. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahiptir ve izobarik etiketler kullanılarak, tek bir deneyde birden fazla örnek analiz edilebilir. Etiketsiz yaklaşım, etiket tabanlı yaklaşımlara uygun maliyetli bir alternatif sağlar. Belirli bir kohorta ait yüzlerce hasta örneği, klinik özelliklere göre analiz edilebilir ve diğer kohortlarla karşılaştırılabilir. Burada, yaşam bilimlerindeki uygulamalar, özellikle biyobelirteç keşfi tabanlı projeler için çok önemli olan etiketsiz ve etiket tabanlı proteom profilleme yöntemlerini kullanan doku örnekleri için optimize edilmiş bir nicel proteomik iş akışı tanımladık.
Introduction
Proteomik teknolojiler, hastalığın tespiti ve prognostikasyonuna yardımcı olabilecek potansiyel aday belirteçlerinin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlama potansiyeline sahiptir1. Kütle spektrometresi alanındaki son gelişmeler protein düzeyinde klinik araştırmaları hızlandırmıştır. Araştırmacılar, şimdi protein tanımlama ve niceleme için daha fazla hassasiyet sunan kütle spektrometrisi bazlı proteomik kullanarak birkaç hastalığın karmaşık patobiyolojisinin zorluğunu ele almaya çalışıyorlar2. Proteinlerin doğru nicel ölçümü, sağlıklı ve hastalıklı bireylerde proteinler arasındaki dinamik ve mekansal işbirliğini anlamak için çok önemlidir3; ancak, proteome çapında bu tür bir analiz kolay değildir.
Klinik örneklerin proteomik profillemesinin önemli bir sınırlaması biyolojik örneklerin karmaşıklığıdır. Hücre hatları, plazma ve dokular4,5gibi hastalık proteomunun incelenmesi için birçok farklı örnek türü araştırılmıştır. Hücre hatları, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarını taklit etmek için in vitro deneylerde model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, hücre hatları ile ilgili önemli bir sınırlama, hücre kültürü sürecinde genotipik ve fenotipik değişiklikleri kolayca edinmeleridir6. Plazma gibi vücut sıvıları biyobelirteç keşfi için çekici bir kaynak olabilir; bununla birlikte, oldukça bol proteinler ve dinamik protein konsantrasyonu aralığı nedeniyle, plazma proteomik biraz daha zordur7. Burada, en bol proteinlerden kaynaklanan peptitler, kütle / yük oranı aynı olsa bile düşük bol proteinlerden elde edilenleri bastırabilir6. Son birkaç yılda tükenme ve fraksiyonasyon teknolojilerinde gelişmeler olmasına rağmen, iyi kapsama almak hala plazma proteomik8,9'un önemli bir sınırlaması olmaya devam etmektedir. Doku örnekleri hastalık bölgelerine en proksimal olduğu ve hastalık biyolojisi hakkında daha iyi içgörüler sağlamak için yüksek fizyolojik ve patolojik bilgiler sunduğu için dokuların hastalık biyolojisinin proteomik araştırılması için kullanılması tercih edilir10,11.
Bu yazıda doku örneklerinin nicel proteomikleri için basitleştirilmiş bir protokol sağladık. Bu tampon kütle spektrometresi bazlı incelemelerle uyumlu olduğu için doku lysate hazırlığı için 8 M üre içeren bir tampon kullandık. Bununla birlikte, tuzları kütle spektrometresine enjekte etmeden önce çıkarmak için peptitlerin temizlenmesi zorunludur. Unutulmaması gereken önemli bir nokta, trypsin 8 M üre konsantrasyonunda düşük aktivite sergilediğinden protein sindirimi için tripsin eklemeden önce üre konsantrasyonunu 1 M'nin altına düşürmektir. Nicel küresel proteomik iki yaklaşımı açıkladık: iTRAQ (göreceli ve mutlak niceleme için izobarik etiketler) ve etiketsiz nicelik (LFQ) kullanılarak etiket tabanlı nicelik. iTRAQ tabanlı nicel proteomik esas olarak biyolojik durumlarına göre değişen birden fazla numuneyi (örneğin, normal ve hastalık veya tedavi edilen örnekler) karşılaştırmak için kullanılır. Yaklaşım peptitlerin N-terminal birincil aminlerini etiketlemek için izobarik reaktifleri kullanır12. iTRAQ reaktifleri bir N-metil piperazin muhabir grubu, bir dengeleyici grubu ve N-terminal birincil peptit aminleri13ile reaksiyona sokulan bir N-hidroksi süksinid ester grubu içerir. Her durumdan sindirilmiş peptitler belirli bir iTRAQ reaktifi ile etiketlenir. Etiketlemenin ardından reaksiyon durdurulur ve farklı koşullardan etiketli peptitler tek bir tüpte biriktirilir. Bu kombine numune karışımı, tanımlama ve nicelik için kütle spektrometresi ile analiz edilir. MS/MS analizinden sonra düşük moleküler kütleli muhabir iyon parçaları üretilir ve proteinlerin nicelleştirilmesinde bu muhabir iyonlarının iyon yoğunlukları kullanılır.
Başka bir yaklaşım, etiketsiz niceleme, peptitleri kararlı izotoplarla etiketlemeden karmaşık numunelerdeki proteinlerin göreceli sayısını belirlemek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma kurumsal inceleme kurulları ve Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay etik komitesi (IITB-IEC/2016/026) tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Hastalar/katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı onaylarını sundular.
1. Doku lysate hazırlığı
NOT: Proteazları etkin tutmamak için buz üzerinde aşağıdaki adımların tümlerini uygulayın. Çapraz bulaşmayı önlemek için neşterlerin ve kullanılan tüplerin steril olduğundan emin olun.
- Boncuk dövme tüpüne ~ 30 mg doku alın, 200 μL 1x fosfat tampon salin (PBS) ekleyin ve girdap ekleyin.
NOT: Bu çalışmada lysate hazırlığı için taze dondurulmuş insan beyin tümörü dokuları alınmıştır. Protokol, dokuların türüne (yumuşak veya sert dokular) ve dokuların hücresel karmaşıklığına bağlı olarak bazı değişikliklerle taze donmuş herhangi bir doku için kullanılabilir. - Bundan sonra, dokuyu yerleştirmek için tüpü döndürün ve PBS'yi bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın. Dokuda hala kan izleri kaldıysa başka bir PBS yıkama gerçekleştirin.
- Üreticinin protokolüne göre 300 μL üre liziz tamponu (8 M üre, 50 mM Tris pH 8.0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2)ve proteaz inhibitörü kokteyli (PIC) ekleyin.
NOT: Lizis tamponunun hacmi, sonikasyon işlemi sırasında dokuyu öğütmek ve çıkarılanı askıya almak için yeterli olmalıdır. Çok az lizis tamponu verimsiz doku lizi ile sonuçlanabilirken, çok fazla lizis tamponu protein lizatını seyreltecektir. - Tüpü buza yerleştirin ve dokuyu 5 s'lik nabız döngüleri (sırasıyla ON/KAPATIK) ile 2,5 dakika boyunca% 40'luk bir genlikte sonicate edin.
- Tüplere zirkonyum boncuklar ekleyin ve buz üzerinde 5 dakikalık inkübasyon ile 90 sn boncuk çırpıcı kullanarak dokuyu homojenize edin. Bu adımı iki kez yineleyin.
- Doku yeterince homojenize olduktan sonra, tüpü 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, hücre kalıntılarını süperndan ayırmak için numuneyi 6.018 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantı taze etiketli tüpte toplayın ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de aliquots olarak saklayın.
2. Doku lysates protein nicelleştirme ve kalite kontrolü
- Ek Dosya 1'de açıklandığı gibi Bradford'un reaktifini kullanarak doku lysate'deki protein konsantrasyonu ölçün.
- Protein nicelimini takiben, kalsat kalitesini kontrol etmek için% 12 SDS-PAGE jel üzerinde 10 μg doku lysate çalıştırın.
NOT: Daha fazla aşağı akış işleme sadece kalite kontrollerini temizleyen lysates için yapılmalıdır.
3. Proteinlerin enzymatic sindirimi
NOT: Enzymatic sindirim adımları Şekil 1a'da gösterilmiştir.
- Sindirim için, 50 μg protein alın ve hacmi20μL'ye çıkarmak için ddH 2 O ekleyin.
- Şimdi, proteinlerdeki disülfit bağlarını azaltmak için stoktan 0,8 μL ekleyerek stoktan (0,5 M TCEP) 20 mM Tris (2 karboksitetil) fosfin (TCEP) hazırlayın ve numuneyi 60 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- DDH2O'da 40 mM iodoasetamid (IAA) hazırlayın ve azaltılmış sistein kalıntılarını alkilize etmek için 1,6 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
- Üre konsantrasyonunu numunede 1 M'nin altına seyreltmek için 1:8 oranında25 mM Tris pH 8.0 ve 1 mM CaCl 2 içeren seyreltme tamponu ekleyin. Bu noktada, pH'ı kontrol edin.
NOT: Trypsin'i sindirim enzimi olarak kullanıyorsanız, üre konsantrasyonunun 1 M'den az olduğundan emin olun. - Sindirimi gerçekleştirmek için, 1:50 enzim / substrat oranında tripsin ekleyin. Tüpleri 37 °C'de, gece sindirimi için 16 saat boyunca sallanan kuru bir banyoda kuluçkaya yatırın.
NOT: Tripsin enzimi, kendi kendine sindirime eğilimli oldukça reaktif bir proteazdır. Ekstra özen gösterin ve trypsin ilavesini buzun üzerine hızlı bir şekilde gerçekleştirin. - 16 saat inkübasyondan sonra, sindirilen peptitleri bir vakum konsantratöründe kurutun.
4. Sindirilmiş peptitlerin tuzdan arındırılmış
NOT: Peptitlerin tuzdan arındırmasını gerçekleştirmek için C18 sahne uçlarını kullanın.
- 50 μL metanol ekleyerek C18 sahne ucunu etkinleştirin. UCU RT'de 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin. İki kez tekrarlayın.
- Aşama ucunu yıkamak için % 0,1 formik aside 50 μL asetonitril ekleyin. Rt'de tüpü 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin. Bu adımı iki kez yineleyin.
- Sütunun aşındırması için %0,1 (v/v) FA'nın 50 μL'sini ekleyin. Yine, rt'de 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleme gerçekleştirin ve filtratı atın.
- Kurutulmuş sindirilmiş peptitleri% 0.1 formik asitin 50 μL'sinde yeniden inşa edin.
NOT: Numuneyi geçirirken sahne uçlarının içinde hava kabarcığı oluşumundan kaçının. Kurutma peptit kaybına yol açabileceği için, santrifüjleme adımı sırasında aşama uçları tamamen kurutulmamalıdır. - Yeniden inşa edilen peptitleri aktif sahne ucuna ekleyin ve numuneyi 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleme ile sahne ucundan geçirin. Bu adımı en az dört kez yineleyin. Akışı 4 °C'de saklayın.
- Numuneyi yıkamak için% 0,1 (v/ v) formik asit 50 μL ekleyin. Santrifüjasyon adımını tekrarlayın ve filtratı atın.
- Peptitlerin elüasyonu için% 0.1 formik asit (v / v) içine% 40 (v / v) ACN'nin 50 μL'sini ekleyin ve santrifüjleme ile sahne ucundan geçirin. Filtrat taze bir tüpte toplayın. Adımı% 0.1 formik asitte% 50 ve% 60 ACN ile tekrarlayın ve filtratları aynı taze tüpte toplayın.
- Taze tüpte toplanan tuzdan arındırılanmış peptitleri vakumlu bir konsantratör kullanarak kurutun.
NOT: Kurutulmuş tuzdan arındırılmış peptitler enjekte edilmeye hazırdır veya 6 ay boyunca -20 °C'de saklanabilir. Uzun süreli depolama için (>6 ay), peptitleri -80 ° C'de saklayın.
5. Tuzdan arındırılanmış peptitlerin nicelleştirilmesi
- Kurutulmuş tuzdan arındırılanmış peptitleri% 0.1 SK'da yeniden inşa edin.
- Fotometrik ölçüm plakasını %70 etanol kullanarak tüy bırakmayan doku ile silin.
- Boşluğu ayarlamak için 2 μL%0,1 FA kullanın.
- Plakaya 2 μL yeniden inşa edilmiş numuneleri çoğaltarak ekleyin.
- Plakayı spektrofotometreye yerleştirin ve emiciliği 205 nm ve 280 nm olarak ölçün.
- Aşağıdaki formülü kullanarak Molar Absorptivity (ε) hesaplayın:
ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205]
NOT: Molar absorptivity (ε), elektronik geçiş olasılığının veya bir türün üzerinde meydana gelen belirli radyasyon dalga boylarını ne kadar iyi emdiğinin bir ölçüsüdür. ε değeri 31 mL mg -1 cm-1ila33 mL mg-1cm-1aralığında olmalıdır. Değer aralıkta düşmezse, bu örneklerin düzgün sindirilmediğini gösterir. - Aşağıdaki formülü kullanarak peptit konsantrasyonu μg/μL olarak hesaplayın:
Peptit konsantrasyonu = Net OD (205) / 0.051 * ε
6. Sindirilen peptitlerin etiketsiz niceliği (LFQ)
NOT: Etiketsiz miktar için, Ek Dosya 2'de belirtilen LC ve MS parametrelerini kullanın. Kütle spektrometresinde aynı tipte üç biyolojik kopya çalıştırıldığında yüksek kapsama alanı verileri elde edildi.
- Sıvı kromatografi kurulumu
- Tuzdan arındırılanmış peptitlerin ölçülmesinin ardından, bir şişeye 2 μg peptit alın ve hacmi% 0,1 FA kullanarak 10 μL'ye kadar yapın. Tuzdan arındırılan peptitlerin konsantrasyonu 200 ng/μL olacaktır.
- Sıvı kromatografi sisteminin otomatik örnekleyicisini açın (bkz. Malzeme Tablosu)ve şişeyi otomatik örnekleyicinin içine yerleştirin.
- Sütun öncesi ve analitik sütunu aşındırmak için %0,1 (v/v) SK kullanın.
- Şişeden 1 μg tuzdan sindirilmiş peptit alın ve sütuna yükleyin.
- LC gradyanını örnek karmaşıklığına göre ayarlayın. Bu deneyde, doku örneklerinin etiketsiz niceliği için 120 dakika boyunca LC gradyanı kullanılmıştır.
- MS kurulumu: Herhangi bir proteomik testi optimize etmeden önce, sistem uygunluğu için herhangi bir yazılım kullanarak ve BSA kapsamını analiz ederek Bovine Serum Albumin'in (BSA) bazı peptitlerini izleyerek cihazın kalite kontrol kontrolünü gerçekleştirin (Şekil 2A,B). Edinme parametreleri MS veri toplama yazılımı kullanılarak cihaza ayarlanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Yazılımı açın, Enstrüman Kurulumu'na çift tıklayın ve varsayılan parametrelere sahip peptitler-ID'den şablonu seçin.
- Tamamlayıcı Dosya 2'yi kullanarak MS parametrelerini ayarlayın ve yeni bir yöntem olarak kaydedin.
- Şimdi, örnek ayrıntıları doldurmak için yazılımı açın; sıralı kur'u çift tıklatın ve örnek türü, örnek adı, dosya kaydetme konumu, enstrüman yöntem dosyası, ekleme hacmi ve örneğin konumu gibi ayrıntıları doldurun.
- Tüm bilgiler doldurulduktan sonra satırı seçin ve Çalıştır 'ıbaşlatın.
7. Sindirilmiş peptitlerin etiket bazlı niceliği (iTRAQ)
NOT: Etiket tabanlı niceleme, iTRAQ veya TMT reaktifleri gibi farklı izobarik etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada üç doku örneğinden sindirilmiş peptitlerin etiketlenmesi için iTRAQ 4-pleks kullanılmıştır. iTRAQ 4-plex etiketleme prosedürü aşağıda belirtilmiştir.
- Sindirilmiş peptitlerin iTRAQ reaktifleri kullanılarak etiketlanması.
NOT: Bu deneyde üç doku örneğinden peptitler kullanılmaktadır. Her doku örneğinden, iTRAQ reaktifleri (114, 115, 116 ve 117) ile etiketleme için dört tüpte 80 μg sindirilmiş peptit alınır (ayrıntılı deneysel parametreler için ek dosya 3'e bakın).- iTRAQ reaktifini kullanmadan önce, reaktifin her şişesini oda sıcaklığına getirin (yaklaşık 5 dk). Çözeltiyi her şişenin altına getirmek için yaklaşık 30 s'lik kısa bir dönüş verin.
NOT: Her şişede 10-15 μL çözelti bulunması gerektiğinden emin olun. - iTRAQ etiketleme için, kurutulmuş peptitleri iTRAQ etiketleme kitinde sağlanan 20 μL çözünme tamponunda yeniden inşa edin.
- Kitte bulunan şişeden 70 μL etanol ekleyerek etiketleri yeniden inşa edin ve çözeltiyi 30 s karıştırın ve 10 sn döndürün.
NOT: Tüm adımların üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmesi tavsiye edilir. - Peptit örnekleri içeren ilgili tüplerine homojen olarak karıştırılan iTRAQ etiketlerini (114, 115, 116 ve 117) ekleyin ve etiketleme reaksiyonun gerçekleşmesini sağlar.
- Tüpü 30 sn boyunca girdaplayarak her tüpün bileşenlerini karıştırın ve ardından karışımı tüpün dibine geri getirmek için tüpü 10 s döndürün.
NOT: pH kağıdı kullanarak çözeltinin pH'ını kontrol edin. pH 8'den büyük olmalıdır; değilse, pH'ı ayarlamak için 10 μL'ye kadar çözünme tamponu ekleyin. - Her tüpü oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın. Reaksiyonun sonunda, MS sınıfı su ekleyerek tüpteki fazla ilişkisiz etiketi söndür.
- Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika ila 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Kuluçka bittikten sonra, etiketli tüm içeriği tek bir tüpe aktarın ve etiketli peptitleri bir vakum konsantratöründe kurutun.
NOT: TMT etiketleme için benzer bir etiketleme prosedürü izlenebilir.
- iTRAQ reaktifini kullanmadan önce, reaktifin her şişesini oda sıcaklığına getirin (yaklaşık 5 dk). Çözeltiyi her şişenin altına getirmek için yaklaşık 30 s'lik kısa bir dönüş verin.
- Sıvı kromatografi kurulumu
- Örnekleri % 0.1 formik asitte yeniden inşa edin, nano LC'nin otomatik örneklemini açın ve örnekleri otomatik örnekleyicinin içine yerleştirin. LC kurulumu için Tamamlayıcı Dosya 2'de belirtilen parametreleri kullanın.
- LC gradyanını numunenin karmaşıklığına göre ayarlayın. Bu deneyde doku örneklerinin etiket bazlı niceliği (iTRAQ) için 180 dk LC gradyanı kullanılmıştır.
NOT: Daha az karmaşık numuneler için, kısa gradyan çoğu peptidi verimli bir şekilde ayırabilir. Bununla birlikte, örnek çok karmaşıksa, peptitlerin daha iyi ayrılması için daha uzun bir gradyan kullanın.
- iTRAQ tekniği için MS kurulumu
- Etiket tabanlı nicelik için tüm MS parametrelerini, etiket tabanlı nicelikte MS/MS parçalanması için %35 olarak ayarlanan çarpışma enerjisi dışında etiketsiz nicelik için kullanılanla aynı şekilde ayarlayın.
8. Veri analizi
- Ticari olarak kullanılabilen bir analiz yazılımı kullanarak LC kütle spektrometresinden elde edilen ham (MS/MS spektrumu) dosyaları analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Uniprot'tan İnsan Referansı Proteome veritabanı (UP000005640), Sequest HT ve Maskot (v2.6.0) arama motorlarını kullanarak protein kimlikleri elde etmek için 71.785 protein dizisinden oluşmaktadır. Etiketsiz nicelik ve etiket tabanlı nicelik parametreleri Ek Dosya 4'te açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Keşif proteomik için iki farklı yaklaşım kullandık: etiketsiz ve etiket tabanlı proteomik yaklaşımlar. SDS-PAGE'deki doku örneklerinin protein profili bozulmamış proteinleri göstermiştir ve proteomik analiz için düşünülebilir (Şekil 2A). Cihazın kalite kontrol kontrolü sistem uygunluk yazılımı ile izlendi ve cihaz performansındaki günsel varyasyonu gösterdi (Şekil 2B). BSA örneğinin 30 dakikalık LC gradyanı(Şekil 2C)içinde % 91 sıra kapsamını gözlemledik. LC gradyanı 500 ng ticari HeLa hücre sindirmesi kullanılarak optimize edildi ve 1 saat gradyanda 1488 proteine kıyasla 2 saat gradyanda 2425 protein gözlemledik(Şekil 2D). Bir havuz dokusu örneğinin üç teknik tekrarında da ortalama 2428 protein tanımlayabildik (Şekil 2E).
Optimize edilmiş LC ve MS parametreleri üç farklı biyolojik doku örneğine uygulanmıştır (Şekil 3 ve Ek Dosya 2). Kromatogram üç farklı biyolojik doku örneği arasında iyi tekrarlanabilirlik gösterdi. Etiketsiz bir yaklaşım kullanarak sırasıyla 1, 2 ve 3 doku örneklerinden 2725, 2748 ve 2718 ölçülebilir protein belirledik. Birinci ve ikinci LFQ deneylerinde 151 proteinin ortak olduğunu, ikinci ve üçüncü LFQ deneyleri arasında 163 proteinin, birinci ve üçüncü deneyler arasında ise 187 proteinin paylaşıldığını, her üç doku örneğinde de 2190 proteinin yaygın olduğunu gözlemledik (Şekil 4A).
Kromatogramı inceledik ve iTRAQ etiketlerini kontrol ettik ve hemen hemen tüm MS /MS spektrumlarında mevcut olduğunu gördük. Üç set iTRAQ deneyi için çalıştırıldı. Her setten elde edilen protein sayısı sırasıyla 2455, 2285 ve 2307'dir. Örnek 1'de 287 protein, örnek 2'de 183 protein, örnek 2 ve örnek 3'te 183 protein, örnek 1 ve örnek 3'te ise 195 proteinin yaygın olduğu bulunmuştur. Her üç örnekte de yaygın olan toplam protein sayısı 1557 idi(Şekil 4B).
Toplam peptit spektral eşleşmelerini (PSM'ler), peptit gruplarını, toplam proteinleri, protein gruplarını ve LFQ ve iTRAQ deneyinden %1 FDR'den sonra elde edilen protein sayısını karşılaştırdık (Şekil 4C).
Şekil 1: Doku proteomik için iş akışı. (A) MS analizi için doku lysate'den numune hazırlamak için örnek işleme adımları. (B) Etiketsiz miktarlama adımları. (C) Etiket tabanlı nicelik için adımlar. (D) Proteom keşfedici kullanarak veri analizi adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Doku örneklerinin kalite kontrolü ve cihazın tekrarlanabilirliği. (A) %12 SDS-PAGE(B)Üzerinde doku lysates kalite kontrolü farklı günlerde enstrüman değişkenliğini kontrol etmek için Panorama kullanılarak BSA bazı peptitlerin izlenmesi. (C) BSA'nın üç teknik yinelemede sıra kapsamı. (D) Doku örnekleri için LC parametrelerinin optimizasyonu. (E) Üç farklı biyolojik örnekteki peptit spektral eşleşmeleri, peptitler ve proteinlerin sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Doku örneğinin proteomik analizi için LC ve MS parametreleri. (A,B) Doku örneğinin etiketsiz niceliği (A) ve etiket bazlı nicelik (B) için peptitleri ayırmak için kullanılan sıvı kromatografi gradyanı. (C) Etiketsiz nicelik ve etiket tabanlı nicelik için MS parametreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Doku örneğinin etiketsiz ve etiket bazlı niceliği. (A) Venn diyagramı, etiketsiz deneyin 1, 2 ve 3 no'lu doku örneklerinde yaygın ve özel proteinleri temsil eder. (B) Venn diyagramı, etiket tabanlı deneyin 1, 2 ve 3 no'lu doku örneklerinde yaygın ve özel proteinleri temsil eder. (C) Etiketsiz nicelikte (LFQ) ve etiket bazlı deneyde (iTRAQ) %1 FDR'den sonra peptit spektral eşleşmelerinin (PSM' ler), peptit gruplarının, toplam proteinlerin, protein gruplarının ve protein sayısının karşılaştırmalı analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Dosyalar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyolojik örneklerin doku proteomikleri, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarıyla ilişkili yeni potansiyel biyobelirteçleri keşfetmemizi sağlar. Ayrıca sinyalizasyon mekanizmasını ve hastalığın ilerlemesiyle ilişkili yolları açıklar. Doku nicel proteomik analizi için açıklanan protokol tekrarlanabilir iyi kapsama verileri sağlar. Adımların çoğu üreticinin talimatlarından uyarlanmıştır. Yüksek kaliteli veri elde etmek için aşağıdaki adımlar çok önemlidir. Bu nedenle, bu adımları gerçekleştirirken ekstra özen gösterilmelidir.
Proteinlerin eksik sindirimi ve keratin kontaminasyonu proteinlerin daha az kapsamasını sağlayabilir (n < 1000), böylece genel deneyi etkileyebilir. Numunelerin pH'ı (pH 8) ve numunelerdeki üre konsantrasyonu (1 M'den az) proteinlerin verimli bir şekilde sindirilmesini sağlayacaktır. Taze tampon kullanımı ve numunelerin özenle işlenmesi keratin kontaminasyon olasılığını azaltacaktır. iTRAQ reaktifleri son derece maliyetlidir ve verileri analiz etmek için MS / MS ve yazılımı gerçekleştirmek için sofistike bir MS platformu gerektirir. Proteomik deneyler tuzlardan kaynaklanan kirlenmeye, peptit nicelemesine ve iTRAQ/TMT reaktiflerinin etiketleme verimliliğine karşı hassastır. MS/MS analizinden önce, verilerdeki arka plan gürültüsünü azaltmak için sindirilmiş peptitlerin düzgün bir şekilde tuzdan arındırıldığından emin olun. iTRAQ tekniği durumunda, ekli etiketin parçalanması, peptitleri ve ortaya çıktıkları proteinleri nispeten ölçmek için kullanılabilecek düşük moleküler kütleli bir muhabir iyonu oluştururken, etiketsiz yaklaşım için eğrinin altındaki alan nicellik için kabul edilir. Proteinlerin niceliklerine olan güveni artırmak için özellikle bağımsız doğrulama deneyleri yapılmalıdır, MRM/PRM yapılmalıdır.
Proteinlerin iyi bir şekilde kapsanması için doku örneklerinin iki nicellik yöntemi (etiketsiz ve etiket bazlı proteomik) kullanılarak analizi tanımlanmıştır. Etiketsiz nicel proteomik yaklaşım, klinik çalışmalarda kullanımı için çeşitli avantajlar sunmaktadır. Numuneler bağımsız olarak çalıştırılır ve bu, kütle spektrometresi ile analiz edilecek çok sayıda örnek olduğu için bir hasta kohort için yapılan çalışmalar için özellikle önemlidir. Optimize edilmiş peptit havuzu gibi teknik bir çoğaltma kullanarak, numuneler farklı zaman noktalarında çalıştırılsa bile iyi tekrarlanabilirlik sağlayabilir. Bu yaklaşım, birçok uluslararası topluluğun çabası olan CPTAC gibi büyük kohort çalışmalarında kullanılmıştır14.
Çalışmadan ortaya çıkan potansiyel hedefler, hedeflenen proteomik yaklaşımlar kullanılarak doğrulama için düşünülebilir. Doku örnekleri analizine dayalı projelerin, bu çalışmada sağlanan nicel proteomiklerin ayrıntılı iş akışlarından yoğun bir şekilde yararlanabileceği sonucuna varıyoruz. Bahsedilen adımlar yöntemi optimize etmeye ve doku örneklerinin proteom haritasını almaya yardımcı olacaktır. Nicel proteomik tekniklerin seçimi, numune sayısına, MS platformlarının kullanılabilirliğine ve ele alınacak biyolojik soruya bağlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
MS ile ilgili tüm deneyleri gerçekleştirmek için Biyoteknoloji Bölümü (BT/PR13114/INF/22/206/2015) tarafından desteklenen IIT Bombay'daki SS ve MASSFIITB Tesisi'ne #34_IITB MHRD-UAY Projesi'ni (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA) kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
