Summary
El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.
Abstract
Los avances recientes en espectrometría de masas han dado como resultado un análisis proteómico profundo junto con la generación de conjuntos de datos robustos y reproducibles. Sin embargo, a pesar de los considerables avances técnicos, la preparación de muestras a partir de bioespecímenes como la sangre del paciente, el CSF y el tejido todavía plantea desafíos considerables. Para identificar biomarcadores, la proteómica tisular a menudo proporciona una fuente de muestra atractiva para traducir los hallazgos de la investigación del banco a la clínica. Puede revelar posibles biomarcadores candidatos para el diagnóstico precoz del cáncer y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, etc. La proteómica tisular también produce una gran cantidad de información sistémica basada en la abundancia de proteínas y ayuda a abordar preguntas biológicas interesantes.
El análisis proteómico cuantitativo se puede agrupar en dos grandes categorías: un enfoque basado en etiquetas y un enfoque sin etiquetas. En el enfoque basado en etiquetas, las proteínas o péptidos se etiquetan utilizando isótopos estables como SILAC (etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular) o mediante etiquetas químicas como ICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopos), TMT (etiqueta de masa en tándem) o iTRAQ (etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta). Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas y, utilizando etiquetas isobáricas, se pueden analizar múltiples muestras en un solo experimento. El enfoque sin etiquetas proporciona una alternativa rentable a los enfoques basados en etiquetas. Cientos de muestras de pacientes pertenecientes a una cohorte en particular pueden ser analizadas y comparadas con otras cohortes en función de las características clínicas. Aquí, hemos descrito un flujo de trabajo de proteómica cuantitativa optimizada para muestras de tejido utilizando métodos de perfiles de proteoma sin etiquetas y basados en etiquetas, que es crucial para las aplicaciones en ciencias de la vida, especialmente los proyectos basados en el descubrimiento de biomarcadores.
Introduction
Las tecnologías proteómicas tienen el potencial de permitir la identificación y cuantificación de posibles marcadores candidatos que pueden ayudar en la detección y pronóstico de la enfermedad1. Los recientes avances en el campo de la espectrometría de masas han acelerado la investigación clínica a nivel de proteínas. Los investigadores están tratando de abordar el desafío de la patobiología complicada de varias enfermedades utilizando proteómica basada en espectrometría de masas, que ahora ofrece una mayor sensibilidad para la identificación y cuantificación de proteínas2. La medición cuantitativa precisa de las proteínas es crucial para comprender la cooperación dinámica y espacial entre las proteínas en individuos sanos y enfermos3; sin embargo, tal análisis a escala de proteoma no es fácil.
Una limitación importante del perfil proteómico de las muestras clínicas es la complejidad de las muestras biológicas. Se han investigado muchos tipos diferentes de muestras para estudiar el proteoma de la enfermedad, como líneas celulares, plasma y tejidos4,5. Las líneas celulares son ampliamente utilizadas como modelos en experimentos in vitro para imitar diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, una limitación importante con las líneas celulares es que adquieren fácilmente cambios genotípicos y fenotípicos durante el proceso de cultivo celular6. Los fluidos corporales como el plasma podrían ser una fuente atractiva para el descubrimiento de biomarcadores; sin embargo, debido a las proteínas altamente abundantes y al rango dinámico de concentración de proteínas, la proteómica plasmática es un poco más desafiante7. Aquí, los péptidos originados a partir de las proteínas más abundantes pueden suprimir los derivados de las proteínas poco abundantes, incluso si la relación masa/carga es la misma6. Aunque ha habido avances en las tecnologías de agotamiento y fraccionamiento en los últimos años, obtener una buena cobertura sigue siendo una limitación importante de la proteómica plasmática8,9. Se prefiere el uso de tejidos para la investigación proteómica de la biología de la enfermedad, ya que las muestras de tejido son más proximales a los sitios de la enfermedad y ofrecen alta información fisiológica y patológica para proporcionar una mejor comprensión de la biología de la enfermedad10,11.
En este manuscrito, hemos proporcionado un protocolo simplificado para la proteómica cuantitativa de muestras de tejido. Hemos utilizado un tampón que contiene 8 M de urea para la preparación de lisato tisular, ya que este tampón es compatible con las investigaciones basadas en espectrometría de masas. Sin embargo, es obligatorio limpiar los péptidos para eliminar las sales antes de inyectarlas en el espectrómetro de masas. Un punto importante a recordar es reducir la concentración de urea a menos de 1 M antes de agregar tripsina para la digestión de proteínas, ya que la tripsina exhibe baja actividad a una concentración de urea de 8 M. Hemos explicado dos enfoques de la proteómica global cuantitativa: la cuantificación basada en etiquetas utilizando iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) y la cuantificación sin etiquetas (LFQ). La proteómica cuantitativa basada en iTRAQ se utiliza principalmente para comparar múltiples muestras que varían en su condición biológica (por ejemplo, muestras normales versus de enfermedades o tratadas). El enfoque utiliza reactivos isobáricos para etiquetar las aminas primarias N-terminales de los péptidos12. Los reactivos iTRAQ contienen un grupo reportero N-metil piperazina, un grupo equilibrador y un grupo éster N-hidroxi succinimida que reacciona con aminas primarias N-terminales de péptidos13. Los péptidos digeridos de cada afección se etiquetan con un reactivo iTRAQ particular. Después del etiquetado, la reacción se detiene y los péptidos etiquetados de diferentes condiciones se agrupan en un solo tubo. Esta mezcla de muestra combinada se analiza mediante espectrómetro de masas para su identificación y cuantificación. Después del análisis MS/MS, se generan fragmentos de iones reporteros con bajas masas moleculares y se utilizan las intensidades iónicas de estos iones reporteros para la cuantificación de las proteínas.
Otro enfoque, la cuantificación sin etiquetas, se utiliza para determinar el número relativo de proteínas en muestras complejas sin etiquetar péptidos con isótopos estables.
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Protocol
Este estudio fue revisado y aprobado por las juntas de revisión institucional y el comité de ética del Instituto Indio de Tecnología de Bombay (IITB-IEC/2016/026). Los pacientes/participantes dieron su consentimiento por escrito para participar en este estudio.
1. Preparación de lisato tisular
NOTA: Realice todos los pasos siguientes en el hielo para mantener las proteasas inactivas. Asegúrese de que los bisturíes y los tubos utilizados sean estériles para evitar cualquier contaminación cruzada.
- Tome ~ 30 mg de tejido en un tubo de batido de cuentas, agregue 200 μL de solución salina tampón de fosfato 1x (PBS) y vórtice.
NOTA: En este estudio, se tomaron tejidos frescos congelados del tumor cerebral humano para la preparación del lisato. El protocolo se puede utilizar para cualquier tejido fresco congelado con algunos cambios dependiendo del tipo de tejidos (tejidos blandos o duros) y la complejidad celular de los tejidos. - Después de eso, gire el tubo para asentar el tejido y retire cuidadosamente el PBS con una pipeta. Realice otro lavado de PBS si todavía quedan rastros de sangre en el tejido.
- Agregue 300 μL de tampón de lisis de urea (8 M de urea, 50 mM Tris pH 8.0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2)y cóctel inhibidor de proteasa (PIC) según el protocolo del fabricante.
NOTA: El volumen del tampón de lisis debe ser suficiente para moler el tejido durante el proceso de sonicación y suspender lo que se extrae. Muy poco tampón de lisis puede resultar en una lisis tisular ineficiente, mientras que demasiado tampón de lisis diluirá el lisato de proteína. - Coloque el tubo sobre hielo y sonice el tejido a una amplitud del 40% durante 2,5 min con ciclos de pulso de 5 s (ON/OFF, respectivamente).
- Agregue perlas de circonio a los tubos y homogeneice el tejido usando un batidor de cuentas durante 90 s con 5 minutos de incubación en hielo. Repita este paso dos veces.
- Una vez que el tejido esté adecuadamente homogeneizado, incubar el tubo en hielo durante 10 min.
- Después de la incubación, centrífuga la muestra a 6.018 x g durante 15 min a 4 °C para separar los restos celulares del sobrenadante.
- Recoger el sobrenadante en el tubo fresco etiquetado y conservar a -80 °C como alícuotas hasta su posterior uso.
2. Cuantificación de proteínas y control de calidad de lisatos tisulares
- Cuantificar la concentración de proteínas en el lisato tisular utilizando el reactivo de Bradford como se describe en el Archivo Suplementario 1.
- Después de la cuantificación de la proteína, ejecute 10 μg de lisado tisular en un gel SDS-PAGE al 12% para verificar la calidad del lisato.
NOTA: El procesamiento posterior posterior debe llevarse a cabo solo para los lisados que compensan los controles de calidad.
3. Digestión enzimática de proteínas
NOTA: Los pasos para la digestión enzimática se muestran en la Figura 1a.
- Para la digestión, tome 50 μg de proteínas y agregue ddH2O para compensar el volumen a 20 μL.
- Ahora, prepare 20 mM Tris (2-carboxietilo) fosfina (TCEP) del stock (0.5 M TCEP) agregando 0.8 μL de stock al lisato de proteína para reducir los enlaces disulfuro en las proteínas e incubar la muestra a 37 ° C durante 60 min.
- Preparar 40 mM de yodoacetamida (IAA) en ddH2O y añadir 1,6 μL para alquilar los residuos reducidos de cisteína. Incubar en la oscuridad durante 10 min a temperatura ambiente.
- Añadir tampón de dilución que contenga 25 mM Tris pH 8.0 y 1 mM CaCl2 en una proporción de 1:8 para diluir la concentración de urea a menos de 1 M en la muestra. En este punto, verifique el pH.
NOTA: Si usa tripsina como enzima de digestión, asegúrese de que la concentración de urea sea inferior a 1 M. - Para realizar la digestión, agregue tripsina en una proporción enzima/sustrato de 1:50. Incubar los tubos a 37 °C en un baño seco agitado durante 16 h para la digestión durante la noche.
NOTA: La enzima tripsina es una proteasa altamente reactiva que es propensa a la auto digestión. Tenga especial cuidado y realice la adición de tripsina rápidamente sobre el hielo. - Después de 16 h de incubación, seque los péptidos digeridos en un concentrador de vacío.
4. Desalinación de péptidos digeridos
NOTA: Para realizar la desalinación de péptidos, use puntas de etapa C18.
- Active la punta de la etapa C18 agregando 50 μL de metanol. Centrifugar la punta a 1.000 x g durante 2 min en RT. Desechar el filtrado recogido en la parte inferior del tubo. Repetir dos veces.
- Añadir 50 μL de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1% para lavar la punta del estadio. Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 2 min en RT. Deseche el filtrado recogido en la parte inferior del tubo. Repita este paso dos veces.
- Agregue 50 μL de 0.1% (v/v) FA para equilibrar la columna. De nuevo, realice la centrifugación a 1.000 x g durante 2 min en RT y deseche el filtrado.
- Reconstituir los péptidos digeridos secos en 50 μL de ácido fórmico al 0,1%.
NOTA: Evite la formación de burbujas de aire dentro de las puntas del escenario mientras pasa la muestra. Las puntas de la etapa no deben secarse completamente durante la etapa de centrifugación, ya que el secado puede provocar la pérdida de péptidos. - Agregue los péptidos reconstituidos en la punta de la etapa activada y pase la muestra a través de la punta de la etapa por centrifugación a 1,000 x g durante 2 min. Repita este paso al menos cuatro veces. Almacene el flujo a 4 °C.
- Para lavar la muestra, agregue 50 μL de ácido fórmico al 0.1% (v / v). Repita el paso de centrifugación y deseche el filtrado.
- Para la elución de péptidos, agregue 50 μL de 40% (v / v) ACN en ácido fórmico al 0.1% (v / v) y páselo a través de la punta de la etapa por centrifugación. Recoger el filtrado en un tubo fresco. Repita el paso con 50% y 60% de ACN en ácido fórmico al 0,1% y recoja el filtrado en el mismo tubo fresco.
- Seque los péptidos desalados recogidos en el tubo fresco utilizando un concentrador de vacío.
NOTA: Los péptidos desalados secos están listos para ser inyectados, o se pueden almacenar a -20 °C durante 6 meses. Para el almacenamiento a largo plazo (>6 meses), guarde los péptidos a -80 °C.
5. Cuantificación de péptidos desalados
- Reconstituir los péptidos desalados secos en FA al 0,1%.
- Limpie la placa de medición fotométrica con tejido libre de pelusa con etanol al 70%.
- Use 2 μL de 0.1% FA para establecer el espacio en blanco.
- Agregue 2 μL de muestras reconstituidas a la placa en réplicas.
- Coloque la placa en el espectrofotómetro y mida la absorbancia a 205 nm y 280 nm.
- Calcule la absorción molar (ε) utilizando la siguiente fórmula:
ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205]
NOTA: La absorción molar (ε) es una medida de la probabilidad de la transición electrónica o qué tan bien una especie absorbe la longitud de onda particular de la radiación que está siendo incidente en ella. El valor de ε debe estar en el rango de 31 ml mg-1cm-1 a 33 ml mg-1cm-1. Si el valor no cae en el rango, esto indica que las muestras no se digieren correctamente. - Calcule la concentración de péptidos en μg/μL utilizando la siguiente fórmula:
Concentración de péptido = OD neto (205) / 0.051 * ε
6. Cuantificación sin etiqueta (LFQ) de los péptidos digeridos
NOTA: Para la cuantificación sin etiquetas, utilice los parámetros LC y MS mencionados en el archivo complementario 2. Se obtuvo un dato de alta cobertura cuando se ejecutaron tres réplicas biológicas del mismo tipo de muestra en el espectrómetro de masas.
- Configuración de cromatografía líquida
- Después de la cuantificación de péptidos desalados, tome 2 μg de péptidos en un vial y haga el volumen a 10 μL usando 0.1% FA. La concentración de péptidos desalados será de 200 ng/μL.
- Abra el muestreador automático del sistema de cromatografía líquida (consulte la Tabla de materiales)y coloque el vial dentro del muestreador automático.
- Utilice 0.1% (v/v) FA para equilibrar la columna previa y la columna analítica.
- Tome 1 μg de péptido digerido desatado del vial y cárgelo en la columna.
- Establezca el gradiente LC de acuerdo con la complejidad de la muestra. En este experimento, se utilizó el gradiente LC durante 120 minutos para la cuantificación sin etiqueta de las muestras de tejido.
- Configuración de MS: Antes de optimizar cualquier ensayo de proteómica, realice una verificación de control de calidad del instrumento monitoreando algunos péptidos de albúmina sérica bovina (BSA) utilizando cualquier software para la idoneidad del sistema y analizando la cobertura de BSA(Figura 2A,B). Los parámetros de adquisición se establecieron en el instrumento utilizando el software de adquisición de datos MS (ver Tabla de Materiales).
- Abra el software, haga doble clic en Configuración de instrumentos y seleccione la plantilla de peptides-ID con los parámetros predeterminados.
- Establezca los parámetros de MS utilizando el archivo suplementario 2 y guárdelo como un nuevo método.
- Ahora, abra el software para completar los detalles de la muestra; Haga doble clic en Configuración de secuenciay complete los detalles como el tipo de muestra, el nombre de la muestra, la ubicación de guardado del archivo, el archivo del método del instrumento, el volumen de inyección y la posición de la muestra.
- Una vez completada toda la información, seleccione la fila e inicie el botón Ejecutar.
7. Cuantificación basada en etiquetas (iTRAQ) de péptidos digeridos
NOTA: La cuantificación basada en etiquetas se puede realizar utilizando diferentes etiquetas isobáricas como reactivos iTRAQ o TMT, etc. Aquí, iTRAQ 4-plex se utilizó para el etiquetado de péptidos digeridos de tres muestras de tejido. El procedimiento de etiquetado iTRAQ 4-plex se menciona a continuación.
- Etiquetado de péptidos digeridos utilizando reactivos iTRAQ.
NOTA: En este experimento, se utilizan péptidos de tres muestras de tejido. De cada muestra de tejido, se toman 80 μg de péptidos digeridos en cuatro tubos para su etiquetado con reactivos iTRAQ (114, 115, 116 y 117) (consulte el Archivo Complementario 3 para los parámetros experimentales detallados).- Antes de usar el reactivo iTRAQ, lleve cada vial del reactivo a temperatura ambiente (aproximadamente 5 min). Dé un breve giro de aproximadamente 30 s para llevar la solución en la parte inferior de cada vial.
NOTA: Asegúrese de que en cada vial, 10-15 μL de solución debe estar presente. - Para el etiquetado de iTRAQ, reconstituya los péptidos secos en 20 μL de tampón de disolución proporcionado en el kit de etiquetado de iTRAQ.
- Reconstituir las etiquetas añadiendo 70 μL de etanol del vial suministrado en el kit y mezclar la solución durante 30 s y girarla durante 10 s.
NOTA: Es aconsejable que todos los pasos se lleven a cabo según las instrucciones del fabricante. - Agregue las etiquetas iTRAQ mezcladas homogéneamente (114, 115, 116 y 117) a sus respectivos tubos que contienen muestras de péptidos y permita que se produzca la reacción de etiquetado.
- Mezcle los componentes de cada tubo vórtice el tubo durante 30 s, y luego gire el tubo durante 10 s para llevar la mezcla de vuelta al fondo del tubo.
NOTA: Compruebe el pH de la solución con papel de pH. el pH debe ser superior a 8; de lo contrario, agregue hasta 10 μL del tampón de disolución para ajustar el pH. - Incubar cada tubo a temperatura ambiente durante 90 min. Al final de la reacción, sucle cualquier exceso de etiqueta sin encuadernar en el tubo agregando agua de grado MS.
- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 30 min a 1 h.
- Una vez que termine la incubación, transfiera todo el contenido etiquetado en un solo tubo y seque los péptidos etiquetados en un concentrador de vacío.
NOTA: Se puede seguir un procedimiento de etiquetado similar para el etiquetado TMT.
- Antes de usar el reactivo iTRAQ, lleve cada vial del reactivo a temperatura ambiente (aproximadamente 5 min). Dé un breve giro de aproximadamente 30 s para llevar la solución en la parte inferior de cada vial.
- Configuración de cromatografía líquida
- Reconstituya las muestras en ácido fórmico al 0,1%, abra el muestreador automático de nano LC y coloque las muestras dentro del muestreador automático. Utilice los parámetros mencionados en el archivo complementario 2 para la configuración de LC.
- Establezca el gradiente LC de acuerdo con la complejidad de la muestra. En este experimento se utilizó un gradiente LC de 180 min para la cuantificación basada en etiquetas (iTRAQ) de las muestras de tejido.
NOTA: Para muestras menos complejas, el gradiente corto puede separar eficientemente la mayoría de los péptidos. Sin embargo, si la muestra es muy compleja, use un gradiente más largo para una mejor separación de los péptidos.
- Configuración de MS para la técnica iTRAQ
- Configure todos los parámetros de MS para la cuantificación basada en etiquetas de la misma manera que se usa para la cuantificación sin etiquetas, excepto para la energía de colisión, que se estableció en un 35% para la fragmentación de MS / MS en la cuantificación basada en etiquetas.
8. Análisis de datos
- Analizar los archivos en bruto (espectro MS/MS) obtenidos del espectrómetro de masas LC utilizando un software de análisis disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).
NOTA: La base de datos Human Reference Proteome de Uniprot (UP000005640) que comprende 71.785 secuencias de proteínas se utilizó para obtener identidades de proteínas utilizando los motores de búsqueda Sequest HT y Mascot (v2.6.0). Los parámetros para la cuantificación sin etiquetas y la cuantificación basada en etiquetas se describen en el archivo complementario 4.
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Representative Results
Hemos utilizado dos enfoques diferentes para la proteómica de descubrimiento: enfoques proteómicos sin etiquetas y basados en etiquetas. El perfil proteico de muestras de tejido en SDS-PAGE mostró las proteínas intactas y pudo ser considerado para el análisis proteómico(Figura 2A). La verificación de control de calidad del instrumento se monitoreó a través del software de idoneidad del sistema y mostró la variación diaria en el rendimiento del instrumento(Figura 2B). Observamos una cobertura de secuencia del 91% de la muestra de BSA en 30 min de gradiente LC (Figura 2C). El gradiente LC se optimizó utilizando 500 ng de digestión de células HeLa comerciales y observamos 2425 proteínas en un gradiente de 2 h en comparación con 1488 proteínas en un gradiente de 1 h(Figura 2D). Pudimos identificar, en promedio, 2428 proteínas en las tres réplicas técnicas de una muestra de tejido de piscina(Figura 2E).
Los parámetros optimizados de LC y EM se aplicaron a tres muestras de tejido biológico diferentes(Figura 3 y Archivo Complementario 2). El cromatograma mostró una buena reproducibilidad entre tres muestras diferentes de tejido biológico. Se identificaron 2725, 2748 y 2718 proteínas cuantificables a partir de muestras de tejido 1, 2 y 3, respectivamente, mediante un enfoque basado en etiquetas. Observamos que 151 proteínas eran comunes en el primer y segundo experimento LFQ, 163 proteínas se compartieron entre el segundo y tercer experimento LFQ, y 187 proteínas se compartieron entre el primer y tercer experimento, mientras que 2190 proteínas fueron comunes en las tres muestras de tejido(Figura 4A).
Inspeccionamos el cromatograma y verificamos las etiquetas iTRAQ y encontramos que estaba presente en casi todos los espectros de EM / EM. Los tres conjuntos se han ejecutado para el experimento iTRAQ. El número de proteínas obtenidas de cada conjunto fue 2455, 2285 y 2307, respectivamente. Se encontró que 287 proteínas eran comunes en la muestra 1 y la muestra 2, 183 proteínas eran comunes en la muestra 2 y la muestra 3, y 195 proteínas eran comunes en la muestra 1 y la muestra 3. El número total de proteínas comunes en las tres muestras fue de 1557(Figura 4B).
Comparamos las coincidencias espectrales de péptidos totales (PSM), los grupos de péptidos, las proteínas totales, los grupos de proteínas y el número de proteínas obtenidas después del 1% de FDR del experimento LFQ e iTRAQ(Figura 4C).
Figura 1: Flujo de trabajo para la proteómica tisular. (A) Los pasos de procesamiento de muestras para preparar muestras de lisato de tejido para el análisis de EM. (B) Pasos para la cuantificación sin etiquetas. (C) Pasos para la cuantificación basada en etiquetas. (D) Pasos para el análisis de datos utilizando un descubridor de proteomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Control de calidad de muestras de tejido y reproducibilidad del instrumento. (A) Control de calidad de lisados tisulares en 12% SDS-PAGE (B) Monitoreo de algunos péptidos de BSA utilizando Panorama para verificar la variabilidad del instrumento a través de los diferentes días. (C) La cobertura de secuencia de BSA en tres réplicas técnicas. (D) Optimización de los parámetros de LC para muestras de tejido. (E) El número de coincidencias espectrales de péptidos, péptidos y proteínas en tres muestras biológicas diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Parámetros LC y MS para el análisis proteómico de la muestra de tejido. (A,B) El gradiente de cromatografía líquida utilizado para separar los péptidos para la cuantificación sin etiqueta (A) y la cuantificación basada en etiqueta (B) de la muestra de tejido. (C) Los parámetros del Estado de Administración para la cuantificación sin etiquetas y la cuantificación basada en etiquetas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de la muestra de tejido sin etiquetas y basada en etiquetas. (A) El diagrama de Venn representa las proteínas comunes y exclusivas en las muestras de tejido 1, 2 y 3 del experimento sin etiquetas. (B) El diagrama de Venn representa las proteínas comunes y exclusivas en las muestras de tejido 1, 2 y 3 del experimento basado en etiquetas. (C) El análisis comparativo del número de coincidencias espectrales de péptidos (PSM), grupos de péptidos, proteínas totales, grupos de proteínas y número de proteínas después de 1% de FDR en cuantificación sin etiqueta (LFQ) y experimento basado en etiquetas (iTRAQ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expedientes complementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La proteómica tisular de muestras biológicas nos permite explorar nuevos biomarcadores potenciales asociados con diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. También explica el mecanismo de señalización y las vías asociadas con la progresión de la enfermedad. El protocolo descrito para el análisis proteómico cuantitativo de tejidos proporciona buenos datos de cobertura reproducibles. La mayoría de los pasos se han adaptado de las instrucciones del fabricante. Para obtener datos de alta calidad, los siguientes pasos son los más cruciales. Por lo tanto, se debe tener especial cuidado al realizar estos pasos.
La digestión incompleta de las proteínas y la contaminación de la queratina pueden proporcionar una menor cobertura de proteínas (n < 1000), lo que afecta al experimento general. El pH de las muestras (pH 8) y la concentración de urea en las muestras (menos de 1 M) asegurarán la digestión eficiente de las proteínas. El uso de tampón fresco y el manejo de muestras con cuidado reducirán las posibilidades de contaminación por queratina. Los reactivos iTRAQ son extremadamente costosos y requieren una sofisticada plataforma MS para realizar el MS / MS y un software para analizar los datos. Los experimentos de proteómica son sensibles a la contaminación por sales, la cuantificación de péptidos y la eficiencia de etiquetado de los reactivos iTRAQ / TMT. Antes del análisis de EM / EM, asegúrese de que los péptidos digeridos se desalen adecuadamente para reducir el ruido de fondo en los datos. En el caso de la técnica iTRAQ, la fragmentación de la etiqueta adjunta genera un ion reportero de baja masa molecular que puede utilizarse para cuantificar relativamente los péptidos y las proteínas de las que se han originado, mientras que para el enfoque sin etiqueta, el área bajo la curva se considera para la cuantificación. Para aumentar la confianza en la cuantificación de proteínas, se deben realizar experimentos de validación independientes especialmente, MRM / PRM.
Se ha descrito el análisis de muestras de tejido utilizando dos métodos de cuantificación (proteómica sin etiquetas y basada en etiquetas) para obtener una buena cobertura de proteínas. El enfoque proteómico cuantitativo sin etiquetas ofrece varias ventajas para su uso en estudios clínicos. Las muestras se ejecutan de forma independiente, y esto es particularmente importante para los estudios que se realizan para una cohorte de pacientes, ya que hay un gran número de muestras que se analizarán a través del espectrómetro de masas. Usando una réplica técnica, como un grupo de péptidos optimizados, se puede garantizar una buena reproducibilidad incluso si las muestras se ejecutan en diferentes puntos de tiempo. Este enfoque se ha utilizado en grandes estudios de cohortes como el CPTAC, que es un esfuerzo de muchas comunidades internacionales14.
Los objetivos potenciales que surjan del estudio podrían considerarse para su validación utilizando enfoques de proteómica dirigida. Concluimos que los proyectos basados en el análisis de muestras de tejido podrían beneficiarse en gran medida de los flujos de trabajo detallados de proteómica cuantitativa proporcionados en este estudio. Los pasos mencionados ayudarán a optimizar el método y mapear el proteoma de las muestras de tejido. La selección de técnicas proteómicas cuantitativas puede depender del número de muestras, la disponibilidad de plataformas de EM y la cuestión biológica que se aborde.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos el Proyecto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), proyecto #34_IITB a las instalaciones de SS y MASSFIITB en IIT Bombay con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para llevar a cabo todos los experimentos relacionados con la EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
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