Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Semikvantitativ analys av peptidoglykan genom vätskekromatografi, masspektrometri och bioinformatik

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

Detta protokoll täcker en detaljerad analys av peptidoglykankomposition med vätskekromatografi, masspektrometri i kombination med avancerad funktionsextraktion och bioinformatisk analysprogramvara.

Abstract

Peptidoglykan är en viktig komponent i bakteriella cellväggar och ett vanligt cellulärt mål för antimikrobiella medel. Även om aspekter av peptidoglykanstrukturen är ganska bevarade över alla bakterier, finns det också stor variation mellan grampositiva / negativa och mellan arter. Dessutom finns det många kända variationer, modifieringar eller anpassningar av peptidoglykanen som kan uppstå inom en bakterieart som svar på tillväxtfas och / eller miljöstimuli. Dessa variationer ger en mycket dynamisk struktur som är känd för att delta i många cellulära funktioner, inklusive tillväxt / delning, antibiotikaresistens och undvikande av värdförsvar. För att förstå variationen inom peptidoglykan måste den övergripande strukturen brytas ner i dess konstitutiva delar (känd som muropeptider) och bedömas för övergripande cellulär sammansättning. Peptidoglycomics använder avancerad masspektrometri i kombination med kraftfull bioinformatisk dataanalys för att undersöka peptidoglykankompositionen i detalj. Följande protokoll beskriver rening av peptidoglykan från bakteriekulturer, förvärv av muropeptidintensitetsdata genom en vätskekromatograf-masspektrometer och differentialanalys av peptidoglykankomposition med användning av bioinformatik.

Introduction

Peptidoglykan (PG) är en definierande egenskap hos bakterier som tjänar till att upprätthålla cellmorfologi, samtidigt som det ger strukturellt stöd för proteiner och andra cellulära komponenter 1,2. Ryggraden i PG består av omväxlande β-1,4-bunden N-acetylmuraminsyra (MurNAc) och N-acetylglukosamin (GlcNAc)1,2. Varje MurNAc har en kort peptid bunden vid ᴅ-laktylresten som kan tvärbindas till intilliggande disackaridbundna peptider (figur 1A, B). Denna tvärbindning ger en nätliknande struktur som omfattar hela cellen och kallas ofta en sacculus (figur 1C). Under PG-syntesen genereras prekursorer i cytoplasman och transporteras över det cytoplasmatiska membranet genom flippaser. Prekursorer införlivas därefter i den mogna PG genom transglykosylas och transpeptidasenzymer, som producerar glykosid- respektive peptidbindningarna3. Men när de väl är monterade finns det många enzymer som produceras av bakterierna som modifierar och / eller bryter ner PG för att utföra ett antal cellulära processer, inklusive tillväxt och delning. Dessutom har olika modifieringar av PG visat sig ge anpassningar som är specifika för stammen, tillväxtförhållandena och miljöstressen, som har varit inblandade i cellsignalering, antimikrobiell resistens och värdimmunflykt4. Som exempel är en vanlig modifiering tillsatsen av en C6-acetylgrupp på MurNAc som ger resistens genom att begränsa tillgången till glykanen β-1,4-kopplingar till värdproducerade lysozymenzymer som bryter ned PG 4,5,6. I enterokocker ger substitution av peptidsidokedjans terminal ᴅ-Ala med ᴅ-Lac en större resistens mot det antimikrobiella vankomycinet 7,8.

Det allmänna förfarandet för PG-isolering och rening har varit relativt oförändrat sedan det beskrevs på 1960-talet9. Bakteriemembran löses upp genom värmebehandling med SDS, följt av enzymatiskt avlägsnande av bundna proteiner, glykolipider och kvarvarande DNA. Den renade intakta sacculus kan därefter smältas in i de enskilda komponenterna genom hydrolys av β-1,4-bindningen mellan GlcNAc och MurNAc. Denna matsmältning producerar GlcNAc-MurNAc-disackarider med eventuella strukturella modifieringar och / eller tvärbindningar intakta och kallas muropeptider (figur 1B).

Sammansättningsanalys av PG utfördes initialt genom högtrycksvätskekromatografisk separation (HPLC) för att rena varje muropeptid följt av manuell identifiering av muropeptider10,11. Detta har sedan ersatts av vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS), vilket ökar detektionskänsligheten och minskar den manuella arbetsbelastningen för att rena varje enskild muropeptid. Den tidskrävande och komplexa karaktären av manuell identifiering av muropeptider har dock förblivit en begränsande faktor, vilket minskar antalet genomförda studier. Under de senaste åren med framväxten av "omic" -teknik har automatiserad LC-MS-funktionsextraktion blivit ett kraftfullt verktyg, vilket möjliggör snabb upptäckt och identifiering av enskilda föreningar i komplexa prover från mycket stora dataset. När funktionerna har identifierats jämför bioinformatisk programvara statistiskt variationen mellan prover med hjälp av differentialanalys som isolerar även minimala skillnader mellan den komplexa datamängden och visar dem grafiskt för användaren. Tillämpningen av programvara för extrahering av egenskaper för analys av PG-sammansättning har bara börjat utforskas 12,13,14 och kopplas till bioinformatisk analys 12. Till skillnad från proteomisk analys som drar nytta av de lättillgängliga proteindatabaserna som förutsäger peptidfragmentering vilket möjliggör helautomatisk identifiering, finns det för närvarande inget fragmenteringsbibliotek för peptidoglykomiska. Extrahering av funktioner kan dock kombineras med kända och förutsagda strukturella databaser för att förutsäga identifiering av muropeptider12. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för användning av LC-MS-baserad egenskapsextraktion kombinerat med ett muropeptidbibliotek för automatiserad identifiering och bioinformatisk differentialanalys av PG-sammansättning (Figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av peptidoglykanprov

  1. Tillväxt av bakteriekulturer
    OBS: Tillväxten av bakteriekulturerna varierar beroende på bakteriearter och tillväxtförhållanden som undersöks. De experimentella parametrar som ska testas kommer att definiera tillväxtförhållandena.
    1. Odla bakteriekulturer under tillväxtförhållanden som krävs för bakteriestammen och experimentell design. Odla bakterier som tredubbla kulturer (biologiska replikat), dvs tre separata kolonier per stam eller tillväxttillstånd.
      OBS: Tillväxtförhållanden och tillväxtfas är kända för att ha betydande effekter på PG-sammansättning 1,2,10. Stor försiktighet måste iakttas för att upprätthålla överensstämmelse mellan kulturer och replikat för att säkerställa att sammansättningsförändringar beror på experimentella parametrar och inte experimentella fel.
    2. Kyl snabbt kulturen till 4 °C, samla upp genom centrifugering (11 000 x g, 10 min, 4 °C) och frys cellpelleten vid -20 °C. Tvätta cellpelleten med förkyld 4 °C, 20 mM natriumfosfat pH 6,5 före frysning. Produktionen av pelleten med frysta celler bör ske så snabbt och konsekvent mellan proverna som möjligt för att begränsa aktiviteten hos enzymer som kan modifiera och/eller bryta ned PG under insamlingsprocessen. Proverna kan bearbetas direkt genom extraktionsprocessen (avsnitt 1.2) utan frysning. Se dock till att alla prover behandlas på ett liknande sätt.
      OBS: För att säkerställa tillräcklig produkt för senare steg används en betydande våtcellspellets. Detta ger en tillräckligt stor sacculi-pellet, som lätt visualiseras och underhålls under de upprepade tvättstegen (avsnitt 1.2.5 och 1.2.14) utan betydande produktförlust. Beroende på bakterie och tillväxtförhållanden kommer detta utbyte sannolikt att variera. För den gramnegativa bakterien Pseudomonas aeruginosa, PAO1, gav 4 l av en 0,5 OD 600-kultur en 3–4 g cellpellet och var tillräcklig för att producera ~10 mg renade sacculi (avsnitt 1.2.17)12. Detta är ett stort överskott av sacculi än vad som krävs för LC-MS (avsnitt 2); Det kommer dock att underlätta mätnoggrannheten (avsnitt 1.2.17) och normalisering (avsnitt 1.3).
  2. Extraktion av peptidoglykan sacculi
    OBS: Protokollet för extraktion av PG är anpassat från ref.9,11,15. Detta protokoll kommer att extrahera PG från enskilda bakterieceller som en hel sacculi, fri från andra cellulära komponenter. Protokollet kan användas med antingen gramnegativa eller grampositiva bakterier. För grampositiva celler kan dock justeringar vara nödvändiga för att isolera den tjockare PG-strukturen och för att avlägsna cellväggsassocierade polymerer. såsom teikoinsyror.
    1. Återsuspendera frysta cellpellets vid ca 1:10 av den ursprungliga odlingsvolymen på 20 mM natriumfosfat pH 6,5. Utför detta steg vid 4 °C (kan vara 1–8 mg våtcellspelletsvikt per ml buffert11,12).
      OBS: För att upprätthålla PG: s acetyleringstillstånd krävs ett pH på 6,5 eller lägre15,16.
    2. Tillsätt cellsuspensionen droppvis till kokande 8% natriumdodecylsulfat (SDS) 20 mM natriumfosfat pH 6,5 för en slutlig 1: 1-volym (dvs slutkoncentrationen är 4% SDS), rör försiktigt i en rund bottenkolv utrustad med en vattenkyld kondensor. (Figur 2, steg 2)
    3. Håll en mild koka i 30 minuter till 3 timmar under omrörning för att säkerställa fullständig membrandissociation. Se till att den resulterande blandningen är helt klar utan kvarvarande cellklumpar eller viskositet. Längre kokning föredras för att garantera fullständig dissociation.
    4. Låt det svalna till rumstemperatur. Provet kan lämnas i rumstemperatur över natten.
      OBS: När SDS är närvarande, behåll prover vid rumstemperatur för att hålla SDS i lösningen.
    5. Samla upp sacculi som en pellet genom ultracentrifugering vid 70 000 x g i 40 minuter (eller den tid som krävs för att sedimentera sacculi fullständigt) vid 25 °C.
    6. Tvätta sackuli upprepade gånger genom successiv ultracentrifugering (avsnitt 1.2.5) och suspension i ~ 50 ml rumstemperatur 20 mM natriumfosfat pH 6,5 tills tvättbufferten har en SDS-koncentration ~ 0,001%. Vanligtvis är 5 till 7 tvättar tillräckliga.
      OBS: För att testa koncentrationen av återstående SDS i tvättbufferten, använd det kolorimetriska färgämnet, Stains-all17.
    7. Resuspendera sacculi i 5-10 ml rumstemperatur 20 mM natriumfosfat pH 6,5.
    8. Sonicate provet kort (~ 40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) vid rumstemperatur för att sprida klumpar.
      OBS: Utökad ultraljudsbehandling kommer mekaniskt att orsaka skjuvning av PG-strukturen18.
    9. Komplettera provet med 50 μg/ml vardera amylas, DNas och RNas, 10 mM magnesiumsulfat och uppsluta vid 37 °C i 1 timme under omrörning eller nutation.
      OBS: Amylassmältning tar bort eventuellt kvarvarande glykogen som fångas i sacculi11.
    10. Tillsätt 100 μg/ml pronas och uppslutning vid 37 °C över natten under omrörning eller nutation och ~0,02 % natriumazid.
      OBS: Pronassmältning avlägsnar de tillsatta enzymerna (från avsnitt 1.2.9) och avlägsnar lipoproteiner som är kovalent bundna till PG.
      VARNING: Natriumazid är mycket giftigt och kräver korrekt användning / bortskaffningsmetoder.
    11. Ultracentrifug vid 70 000 x g i 40 minuter (eller den tid som krävs för att fullständigt sedimentera sacculi) vid 25 °C för att avlägsna natriumazid.
    12. Återsuspendera pelleten i 25 ml 2% SDS 20 mM natriumfosfat pH 6,5.
    13. Koka i 1 timme i ångkokare eller rundkolv med vattenkyld kylare (punkt 1.2.2).
      OBS: Det andra SDS-koksteget tar bort alla återstående proteiner och föroreningar från sacculi.
    14. Upprepa sacculi-tvätten (avsnitt 1.2.6) med ~ 50 ml rumstemperatur dubbeldestillerat vatten (ddH2O) tills SDS-koncentrationen är ~ 0,001%.
    15. Återsuspendera pelleten i en tillräcklig mängdddH2Oför att suspendera sacculi samt tvätta behållaren (t.ex. 25 ml) och frys över natten vid -80 °C. Volymen kan variera eftersom provet kommer att frystorkas i nästa steg, även om mindre volymer kräver mindre tid att frystorka.
    16. Nästa dag, lyofilisera suspensionen och förvara vid rumstemperatur.
    17. Mät mängden frystorkade sacculi erhållna på en analytisk våg.
    18. Späd sacculi i ddH2O till 10 mg / ml och kort sonikat för att bryta upp klumpar före ytterligare analys.
  3. Kvantifiering av renad peptidoglykan
    1. Kvantifiera mängden renade sacculi från avsnitt 1.2.18 för att säkerställa att massspecifikationsdata utjämnas under differentialanalysen (avsnitt 3.2). Följ den detaljerade metoden som beskrivs i referens15.
      OBS: Renade sacculi (avsnitt 1.2.18) bryts ned i enskilda socker- och aminosyrakomponenter genom syrahydrolys. Enskilda komponenter separeras och kvantifieras genom anjonbyteskromatografi med användning av puls-amperometrisk detektion. Med tanke på strukturen hos PG (figur 1) består enskilda muropeptider av en enda MurNAc och en enda GlcNAc-rest. Kvantifiering av koncentrationen av endera återstoden representerar därför mängden muropeptider 1:1 i provet. MurNAc föredras på grund av den rena toppseparationen från andra PG-komponenter under kromatografi16.

2. Datainsamling för masspektrometri

  1. Beredning av muropeptider för masspektrometri
    1. Komplettera 800 μg renade sacculi med 100 μg/ml mutanolysin, 100 mM ammoniumacetat pH 5,5 och 50 mM magnesiumklorid i en 100 μL reaktion.
    2. Smält vid 37 °C över natten.
    3. Tillsätt 1:1 volym 0,5 M boratbuffert pH 9,0 och komplettera med ~10 mg/ml natriumborhydrid (NaBH4).
      OBS: Mutarotation av cykliska sockerarter mellan α och β anomera former kommer att orsaka flera toppformationer under vätskekromatografiseparationen av muropeptiderna. Behandlingen med NaBH4 eliminerar interkonversion mellan de två formerna genom att reducera MurNAc till muramitol11. Behandlingen minskar inte 1,6-anhydro MurNAc eller 1,4-bundna sockerrester.
      VARNING: Reaktionen av NaBH4 producerar små mängder vätgas. NaBH4-reaktionen kommer att skapa bubblor och mikrofugerör bör hållas öppna för att tillåta gas att fly.
    4. Inkubera provet vid rumstemperatur i ~20–30 minuter.
    5. Centrifugera kort för att sedimentera provet i mikrofugeröret och avlägsna bubblor.
    6. Justera pH till <4,0 med 1:5 fosforsyra, tillsatt i steg om 5 μl. Testa pH med lakmus pH-testremsor.
    7. Centrifugera vid ~17 000 x g i 1 minut för att sedimentera eventuellt kvarvarande olösligt material.
    8. Filtrera med 0,2 μm mikrocentrifugfilter.
    9. Proverna centrifugeras i 10 minuter vid 30 000 x g före injektion i LC-MS för att säkerställa att partiklar inte injiceras i MS.
  2. Inställning av LC-MS
    1. Fäst en C18 ytligt porös partikelkolonn (100 mm x 2,1 mm, porstorlek <3 μm) till en QTOF-masspektrometer (Quadrupole-Time of Flight) med en minimal detekteringsnoggrannhet på fyra decimaler m / z .
    2. Utföra vätskekromatografiseparation av muropeptider
      Anmärkning: Varje biologisk trippel (avsnitt 1.1.1) ska köras genom LC-MS (avsnitt 2.2.2 till 2.2.3) tre gånger (teknisk trippel). Därför kommer varje testat tillstånd att ha totalt nio LC-MS-datafiler. Datainsamlingen utfördes med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara (se Materialförteckning). Anskaffningsprogramvara bör dock väljas baserat på MS-maskineriet. Följande representerar en guide för att konfigurera MS med parametrar som är specifika för att köra detta protokoll. För en detaljerad beskrivning, se tillverkarens handbok.
      1. För kromatografisk separation, bereda följande lösningsmedel 0,1% myrsyra (A) och acetonitril med 0,1% myrsyra (B).
      2. Ställ in en metod för kromatografisk separation med hjälp av följande parametrar.
      3. Ställ in flödeshastigheten på 0,4 ml/min.
      4. Konditionera kolumnen i 10 minuter vid 2 % B (~24 kolumnvolymer).
      5. Injicera med hjälp av en autosampler 10 μl prov från punkt 2.1.9.
        Kör ett första prov genom LC-MS-protokollet innan datainsamlingen påbörjas. Den här körningen används inte för data utan för att öka reproducerbarheten för kvarhållningstiden för alla efterföljande körningar. Reproducerbarheten av retentionstiden krävs under spektralbearbetning (avsnitt 3.1) för noggrann identifiering och gruppering av toppar i mass-laddningsförhållandet (m/z).
      6. Separera muropeptider med 2% B i 5 min (~ 12 kolumnvolymer), öka den sedan till 15% B över 13 min (~ 30 kolumnvolymer), öka den ytterligare till 50% B över 10 min (~ 24 kolumnvolymer) och slutligen öka den till 98% B över 2 min (~ 5 kolumnvolymer).
        OBS: Kassera (skicka till avfall) de första 2 minuterna och de sista 5 minuterna av lutningen.
      7. Avsluta med en kolonntvätt vid 98 % B i 6 min (~14 kolumnvolymer) och 20 min (~47 kolumnvolymer) i jämvikt.
    3. Utföra masspektrometridetektion av muropeptider
      1. Kalibrera massaxeln i positivt läge med hjälp av en trimblandning i acetonitril som innehåller LC-MS-referensmassstandarder enligt MS-tillverkarens anvisningar.
        Anmärkning: MS ställs in innan kromatografiska körningar påbörjas (punkt 2.2.2.1).
      2. Ställ in en metod för MS-datainsamling med hjälp av följande parametrar.
        Anmärkning: MS- och MS/MS-data samlas in (punkterna 2.2.3.2-2.2.3.6) samtidigt med den kromatografiska separationen av muropeptiderna (punkterna 2.2.2.4 och 2.2.2.5). Både kromatografiska parametrar och MS-parametrar (punkterna 2.2.2.2 och 2.2.3.2) är en enda metod som läggs till under installationen av en arbetslista för att köra flera prover i följd.
      3. Ställ in elektrospraykapillärspänningen på 4,0 kV och torkgastemperaturen på 350 °C med en flödeshastighet på 13 l/min.
        OBS: Kväve (renhet >99%) bör användas som nebuliserande, torkande och kollisionsgas under all masspektrometridatainsamling.
      4. Ställ in nebulisatortrycket på 40 psi och ställ in fragmentorn på 150 V.
      5. Ställ in RF-spänningarna munstycke, skimmer och oktapol på 1000 V, 65 V respektive 750 V.
      6. Ställ in skanningsområdet på 300–2 000 m/z i 4 GHz (utökat dynamiskt omfång) positivt jonläge.
      7. Ställ in datainsamling med databeroende MS/MS-insamling med en MS- och MS/MS-skanningshastighet på 1 spektra/sekund. Välj fem prekursormassa per cykel, i ordningen enskilt, dubbelt och trippelladdat.
      8. Ställ in MS/MS-splitterkollisionsenergierna på 15, 20 och 30 eV.

3. Differentiell analys av muropeptidöverflöd

  1. LC-MS kromatogram spektral bearbetning
    OBS: Extrahering av rekursiva funktioner utfördes med kommersiellt tillgänglig programvara (se materialförteckning). Annan programvara för extrahering av funktioner kan användas. Annan programvara kan dock kräva ytterligare manuell databehandling för att uppnå den mycket robusta rekursiva extraktionen. Olika program använder terminologifunktionen, enheten och föreningen nästan omväxlande. För PG-analys hänvisar alla till identifieringen av LC-MS-jonkromatogrammet som är representativt för en enskild muropeptid (t.ex. figur 3). Under spektralbearbetning (avsnitt 3.1) representerar en egenskap de flera m / z-toppar som omfattar de flera möjliga jonarterna av en enda muropeptid som grupperas tillsammans under en enda sammansatt etikett.
    1. Starta ett nytt projekt under Arkiv.
    2. Lägg till LC-MS QTOF-datafilerna och tilldela enskilda datafiler till ett experimentellt tillstånd / grupp, t.ex. två olika tillväxtförhållanden.
    3. Kör databehandlingsguiden Batch rekursiv egenskapsextraktion (små molekyler/peptider) och ställ in databehandlingsfiltren så att de matchar parametrarna för LC-MS-förhållandena och instrumenteringen för att exakt identifiera, gruppera och verifiera m/z-toppar som representerar enskilda muropeptider. Från kromatogrammet undersök retentionstiden, driften och variationen av m / z för kända liknande toppar för att ställa in initiala filterparametrar.
      OBS: Rekursiv funktionsextraktion använder en initial oriktad algoritm för molekylär extraktion för egenskaper för att identifiera och justera kromatogramfunktioner (m / z-toppar ) över alla datafiler. När de har skapats används dessa funktioner för att omvärdera de ursprungliga datafilerna (rekursiva) med en riktad algoritm för extrahering av molekylära egenskaper för att förbättra tillförlitligheten och noggrannheten hos de identifierade funktionerna. Det är bäst att ange den första oriktade extraheringen med ett smalt identifieringsfönster och använda bredare identifieringsparametrar för den rekursiva extraheringen för att identifiera toppar i alla datafiler som kan saknas i den första extraheringen. Det kan ta timmar att köra extraheringen av rekursiva funktioner beroende på antalet exempel, komplexiteten hos data och den datormaskinvara som finns
    4. Granska resultaten av extrahering av funktioner. Om ett stort antal funktioner inte kunde justeras i en grupp justerar du de rekursiva filtreringsparametrarna för att bredda/begränsa identifieringsfönstret efter behov. För att åstadkomma detta bör du inspektera kromatogrammet och isotopprofilen för varje extraherad funktion för att säkerställa att funktionsdetektering utfördes på samma sätt i alla datafiler. För varje identifierad funktion i en datafil bör du också granska poängen, eventuella varningar och om funktionen klarade de valda filterparametrarna.
      OBS: Försiktighet måste vidtas för att hålla detekteringsfönster tillräckligt smala så att distinkta funktioner inte felaktigt grupperas tillsammans. Detta noteras ofta av olika isotopprofiler mellan datafiler eller signifikanta m / z / retentionstidsvariationer. Omvänt, om det finns flera funktioner med liknande m/z och retentionstider, är det möjligt att filterparametrarna var för stränga vilket resulterade i att en MS-topp delades upp i två funktioner. Kör därför extrahering av funktioner (avsnitt 3.1.3) igen med justerade filterparametrar för kvarhållningstid för att möjliggöra bättre gruppering av dessa funktioner. Visualisering av de lägsta förekomsttopparna kommer att indikera om de filter som används (avsnitt 3.1.3) korrekt identifierade toppar över bakgrundsbruset. Om de lägsta överflödstopparna ser ut ungefär som bakgrunden kör du extraheringen av funktionen igen med nya bakgrundsfilterparametrar.
    5. Exportera data som en sammansatt utbytesfil (.cef) (ett format som är kompatibelt med det statistiska programmet) eller en kolumnseparerad fil (.csv) som innehåller massa, retentionstid och överflöd för varje funktion för varje prov.
  2. Differentialanalys av spektrala egenskaper
    OBS: Differentialanalys utfördes med kommersiellt tillgänglig programvara (se materialförteckning). Annan bioinformatisk programvara kan användas.
    1. Öppna programmet och starta ett nytt projekt när du instrueras.
    2. Följ anvisningarna för dataimport och dataanalys. Under dataimporten laddar du upp de funktionsextraherade filerna (avsnitt 3.1). Under dataanalys väljer du signifikans och vikningsändring för differentialanalys och väljer att baslinjedata till medianintensiteten för alla datafiler. Ställ inte in några datafilter (om detta gjordes i föregående spektrabearbetningssteg (avsnitt 3.1)) eftersom tillämpning av filter igen skulle negera den robusta extraheringen av rekursiva egenskaper. I likhet med egenskapsextraktion måste differentialanalysen justeras baserat på massa (m / z) och retentionstid på grund av drift i LC-MS-datainsamlingen. Använd de parametrar som bestämts i extrahering av egenskaper (avsnitt 3.1).
      OBS: Normalisera mellan datafiler med hjälp av muropeptidkvantifieringen (avsnitt 1.3) för att säkerställa att variationer beror på experimentella parametrar och inte på variationer i sacculi-rening (avsnitt 1.2). Använd alternativet extern skalare för att justera varje datafil för skillnader i MurNAc-provkoncentration.
    3. När analysen är klar, undersök de resulterande grafiska och statistiska analyserna för att identifiera muropeptider som visar en signifikant överflödsförändring mellan de testade experimentella förhållandena.
    4. Högerklicka på de olika analyserna under projektnavigatorn och välj ett exportalternativ för att spara funktionsinformation som en kolumnseparerad (.csv) datafil som innehåller m/z, kvarhållningstid, råa och normaliserade intensitetsvärden, p-värde, FDR och vikningsändringar för varje geoobjekt. Flera analyser måste sparas för att få alla relevanta data.
    5. Exportera en andra .csv fil som endast innehåller de muropeptider som har överträffat de statistiska analyserna inklusive p-värde <0,05 och vikförändring >2.
  3. Kommentera muropeptididentitet till spektrala funktioner
    OBS: Varje identifierat objekt måste tilldelas en förutsagd muropeptidstruktur baserad på m/z och denna annotering bekräftas genom undersökning av MS/MS-fragmenteringen. Efter bekräftelse av anteckningarna kan det vara nödvändigt att utföra och förfina differentialanalysen (avsnitt 3.2).
    1. I programvaran för differentiell analys, under resultattolkning, väljer du ID-webbläsare. Lägg till ett bibliotek med förväntade muropeptidstrukturer och välj liknande parametrar som tidigare använts (avsnitt 3.1.3). Detta kommer att ge en förutsagd muropeptidanteckning för varje identifierad egenskap. Ett bibliotek med muropeptidstrukturer kan produceras med hjälp av m/z för förutsagda muropeptidstrukturer och MS-databasprogramvara (se Materialförteckning). Ett bibliotek med m / z av >6,000 möjliga muropeptider finns dock i referens12.
    2. Välj den förutsagda muropeptidanteckningen baserat på matchningspoängen och den biologiska relevansen av den förutsagda muropeptiden, dvs välj den mest sannolika muropeptiden som finns i det biologiska provet.
    3. Bekräfta manuellt den förutsagda muropeptidannoteringen genom att jämföra m/ z-topparna i MS/MS-kromatogrammet med den förutsagda m/z för alla möjliga fragmenteringar av en känd muropeptidstruktur (t.ex. figur 4).
      1. Visa MS- och MS/MS-data med hjälp av ett program för visning av kromatogram (se materialförteckningen, figur 4).
      2. Rita den förutsagda muropeptidstrukturen med hjälp av en molekylär editor (kemiskt strukturritningsprogram) (se Materialtabell, figur 4, grå insats). Använd massfragmenteringsverktyget för att visa m / z för MS-fragment när varje bindning bryts antingen individuellt eller i kombination.
        OBS: Beroende på fragmenteringsenergin som används för MS / MS kan fragmentering ske vid vilken bindning som helst i muropeptidstrukturen. Vissa bindningar är dock lättare/ofta fragmenterade vid lägre energinivåer. Exempelvis förekommer fragmentering i peptidsidokedjan oftast vid amidbindningen mellan aminosyror. Vid bedömningen av fragmenteringen är det viktigt att notera att GlcNAc-rester mycket lätt fragmenteras från muropeptiden. Därför bör fragmentering av den kända muropeptidstrukturen bedömas med och utan GlcNAc. På grund av fragmenteringen av GlcNAc i källan kan flera funktioner extraherade vid spektralbearbetning (avsnitt 3.1) representera en enda muropeptidstruktur. Om dessa egenskaper hittas bör de slås samman och differentialanalysen omprövas.
      3. Jämför alla möjliga fragmenteringar av muropeptidstrukturen som bestämdes (avsnitt 3.3.3.2) med MS/MS-kromatogrammet (avsnitt 3.3.3.1). För att bekräfta muropeptidanteckningen bör m/z-topparna för flera fragment hittas i MS/MS-kromatogrammet med ett mycket minimalt m/z-justeringsfönster (figur 4).
      4. För att klarlägga muropeptididentiteten vid tvetydig MS/MS-fragmentering, upprepa avsnitten 2.2.2–2.2.3 med prover (avsnitt 2.1.9) för ytterligare MS/MS-datainsamling med en föredragen prekursorlista över m/z och retentionstid med ytterligare MS/MS-fragmenteringskollisionsenergier.
    4. För enheter som är sameluerande och som kommenterats som samma muropeptid, kör differentialanalysen (avsnitt 3.2.2) igen och slå samman de extraherade egenskaperna.
  4. Bedömning av globala förändringar i muropeptidmodifieringar
    1. Redigera den .csv filen (avsnitt 3.2.4) för de statistiskt signifikanta högviktsförändringsmuropeptiderna så att den innehåller en enda kolumn för varje muropeptidmodifiering. Fyll denna kolumn med en beteckning för varje anmärkt muropeptid (avsnitt 3.3) (t.ex. acetylerad kontra de-N-acetylerad GlcNAc eller MurNAc).
    2. Ladda upp den ändrade .csv filen till Perseus22,23. Importera de normaliserade intensitetsvärdena till rutan Huvudimport och importera ändringsbeteckningen till rutan Kategorisk import.
    3. Under Anteckna rader klickar du på Kategoriskt kommentera rader och lägger till datafiler till varje experimentell parameter.
    4. Under test klickar du på två provtester för att utföra en elevs t-test (p-värde < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Klicka på 1D för att utföra 1D-annotering22,23. En 1D-annotering FDR < 0,05 indikerar en signifikant överflödsförändring för muropeptidmodifieringen mellan de testade experimentella parametrarna. Om du ställer in tröskelvärdet (s0) = 1 visas FDR-poängen för 1D-anteckningar för alla muropeptider.
    6. I ett grafprogram (se Materialförteckning), producera en värmekarta över förändringen av överflödsvecket för varje muropeptidmodifiering och visa 1D-annoteringspoängen för att visa signifikans (figur 5B). Vikförändringen för varje muropeptidmodifiering kan produceras i Microsoft Excel med hjälp av råintensiteterna för alla enskilda muropeptider som innehåller modifieringen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ökad detekteringskänslighet hos MS-maskiner i kombination med kraftfull programvara för toppigenkänning har förbättrat förmågan att isolera, övervaka och analysera substanssammansättningar av komplexa prover i mycket liten detalj. Med hjälp av dessa tekniska framsteg har nyligen genomförda studier om peptidoglykankomposition börjat använda automatiserade LC-MS-funktionsextraktionstekniker 12,13,14,24 jämfört med äldre HPLC-baserad metodik 11,25,26,27,28,29,30,31 . Även om det finns många generiska programvarupaket för extrahering av funktioner tillgängliga, är kommersiell programvara som använder rekursiv extrahering av funktioner snabb och mycket robust genom att automatiskt identifiera och kombinera alla laddningar, isotoper och adduktversioner av varje muropeptid som finns i LC-MS-datasetet (figur 3). Dessutom används initiala kvarhållningstider, m/z och isotopmönster för extraherade funktioner för att omvärdera (rekursiva) datauppsättningen för att säkerställa korrekt identifiering av varje funktion i alla datafiler. Därför hjälper den rekursiva algoritmen till att validera och öka förtroendet för toppidentifiering. De flesta generiska extraheringsprogram grupperar inte laddningar / isotoper etc. och kommer att kräva detta som ett ytterligare manuellt steg. Dessutom kommer generiska program att vara mindre robusta eftersom funktioner extraheras separat inom varje datafil och inte som en hel dataset, som ingår i den rekursiva algoritmen.

Det peptidoglykomiska protokollet som presenteras här användes nyligen för att undersöka kompositionsförändringarna av PG mellan två fysiologiska tillväxtförhållanden, nämligen frisimmande planktonisk och stationär gemensam biofilm12. Med hjälp av en mycket känslig QTOF MS i kombination med den rekursiva egenskapsextraktionen identifierades och spårades 160 distinkta muropeptider. Detta representerade åtta gånger antalet muropeptider som identifierats i denna organism tidigare 29,32 och mer än dubbelt så många muropeptider som identifierats med andra metoder i andra organismer10,14,24.

Att associera varje m/z-topp extraherad från MS-data med en viss muropeptid underlättas genom korsreferenser med en databas med kända och förutsagda muropeptidstrukturer. MS/MS-kromatogrammet för fragmentering (figur 4) för varje extraherat objekt jämförs med fragmenteringsprofilen (figur 4, grå infällning) för den muropeptid som föreslås använda databasen.

Peptidoglykomiska data kan ses på ett antal olika sätt beroende på experimentell inställning och de frågor som ställs. Sådan grafisk analys kan innefatta principalkomponentanalys (PCA), scatterplots, vulkandiagram, värmekartor och hierarkisk klusteranalys. Till exempel markerar vulkandiagram muropeptider som visar en statistiskt signifikant hög storlek av överflödsförändring mellan de testade förhållandena (figur 5A). Dessa utvalda muropeptider som representerar signifikanta överflödsförändringar mellan de testade förhållandena kan undersökas ytterligare för muropeptidmodifieringar. Dessa modifieringar kan innefatta närvaron av aminosyrasubstitutioner, acetyleringsförändringar eller närvaron av amidasaktivitet. När de undersöks tillsammans kan flera muropeptider med samma modifiering undersökas för en trend mot ett experimentellt tillstånd (figur 5A - markerade punkter gröna) och hela gruppen bedöms för signifikans (figur 5B). Att spåra en muropeptidmodifiering på detta sätt kan indikera en viss enzymatisk aktivitet som påverkas av den experimentella parametern. Dessutom kan extremvärden från denna trend indikera enzymatisk aktivitet med en viss specificitet eller biologisk funktion (figur 5A – markerade punkter orange).

Figure 1
Figur 1: Exempel på en typisk gramnegativ peptidoglykanstruktur. (A) I gramnegativa bakterier finns peptidoglykan i periplasman mellan de inre och yttre membranen. (B) En enda muropeptid består av en β-1,4-bunden N-acetylglukosamin (GlcNAc) (blå) och en N-acetyl muraminsyra (MurNAc) (lila) med en bifogad peptidsidokedja (orange). Peptidsidokedjan kan tvärbindas till sidokedjan av intilliggande muropeptid som producerar den mogna nätliknande peptidoglykanen (A). Rening innebär isolering av peptidoglykanen från hela cellen som en sacculus där allt annat cellulärt material har skalats bort. (C) Transmissionselektronmikrografi av en peptidoglycan sacculi. I jämförelse kan grampositiv PG bestå av ett större antal variationer i struktur och ingår i grampositiv taxonomisk klassificering33. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Arbetsflöde för peptidglykomik. Provberedning. Steg 1, odla och pelletera bakterieceller (avsnitt 1.1). Steg 2, rena peptidoglykansacculi med 4% SDS-kok (avsnitt 1.2). Datainsamling. Steg 3, enzymatisk nedbrytning av sacculi för att producera muropeptider genom brott av β-1,4-bindningen mellan N-acetylglukosamin (GlcNAc) och N-acetylmuraminsyra (MurNAc) i peptidoglykanryggraden (avsnitt 2.1). Steg 4, analys av muropeptidintensitet genom LC-MS/MS (avsnitt 2.2). Dataanalys. Steg 5, rekursiv egenskapsextraktion identifierar och samlar in alla laddningar, addukter och isotoper associerade med en enda muropeptid (avsnitt 3.1). Steg 6, identifiering av muropeptider genom jämförelse av förväntad fragmentering med MS/MS-kromatogram (avsnitt 3.3). Steg 7, bioinformatisk differentialanalys (avsnitt 3.2) som jämför förändringar i peptidoglykansammansättningen mellan olika experimentella parametrar. Steg 8, undersök den globala förändringen i muropeptidmodifieringar inom de olika experimentella parametrarna med hjälp av 1D-annotering (avsnitt 3.4). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Exempel på extrahering av rekursiva funktioner. För en muropeptid som representerar en peptidsidokedja av alanin (A), iso-ᴅ-glutamat (E), meso-diaminopimelinsyra (m), alanin (A) tvärbunden till AE m A i den intilliggande muropeptidsidokedjan (1864,8 m/z). Inkluderat i den extraherade funktionen för 1864,8 m / z är laddningar (+1, +2 och +3), addukter (t.ex. natrium och kalium), förlust av GlcNAc (1 eller 2 GlcNAc) och flera isotoptoppar för varje variation (t.ex. zoomad insats). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Muropeptidfragmentering och identifiering. För annotering ges varje m/z-topp (egenskap) extraherad från MS-kromatogrammet en föreslagen muropeptidstruktur baserad på likhet med ett muropeptidbibliotek. För att bekräfta denna föreslagna struktur genereras förutsagda MS / MS-fragment med hjälp av ett kemiskt ritprogram (grå insats). Denna förväntade fragmentering jämförs med MS/MS-kromatogrammet. När förutsagda fragment (grå infälld) matchar MS/MS-kromatogrammet bekräftas den föreslagna muropeptidstrukturen. Siffran ändrades från referens12. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Differentiell analys av peptidoglykankomposition. (A) Vulkandiagram över veckförändringen och statistisk signifikans av förändringar i muropeptidintensitet mellan peptidoglykan renad från P. aeruginosa odlad som antingen frisimmande planktonisk eller stationär biofilmkultur. Alla muropeptider som har en modifiering som representerade en förändring i det typiska aminosyraarrangemanget inom peptidsidokedjan markeras. Aminosyrasubstituerade muropeptider som visade en trend mot minskad förekomst av biofilmhärledd peptidoglykan är markerade i grönt. Aminosyrasubstituerade muropeptider som var avvikande för denna trend och visade ökad förekomst av biofilm-härledd peptidoglykan är markerade i orange. (B) Värmekarta över den globala veckförändringen i överflöd av alla aminosyrasubstituerade muropeptider med ökad förekomst (orange) och minskad överflöd (grön) i biofilmer. Dessa muropeptider omgrupperades och utvärderades för huruvida aminosyrasubstitution inträffade på monomerer, tvärbundna dimerer, eller om den fjärde (AE m +), femte (AE m A+) eller båda aminosyrorna (AEm ++) ersattes. Signifikansen för varje grupp av muropeptider bedömdes genom 1D-annotering med FDR < 0,05 för signifikans och tillhörande 1D-poäng visas. 1D-annotering kan endast utföras på mer än 2 muropeptider (t.ex. AEm ++ substitution hittades endast på två muropeptider). Därför måste i detta fall betydelsen undersökas för de enskilda muropeptiderna och inte för gruppen. Siffran ändrades från referens12. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en metod för att rena peptidoglykan från bakteriekulturer, process för LC-MS-detektion och analysera komposition med hjälp av bioinformatiska tekniker. Här fokuserar vi på gramnegativa bakterier och vissa små modifieringar kommer att krävas för att möjliggöra analys av grampositiva bakterier.

Beredningen av muropeptider har varit praktiskt taget densamma sedan den först producerades på 1960-talet 9,11,15. Efter rening spjälkas sacculi (avsnitt 1.2.18) till enskilda muropeptider med användning av muramidasenzymet mutanolysin från Streptomyces globisporus. Mutanolysin smälter PG-strukturen genom att bryta β-1,4-glykosidbindningen och frigör enskilda muropeptider bestående av en GlcNAc-MurNAc-disackarid med bifogad peptidsidokedja och inkluderar eventuella modifieringar eller tvärbindningar (figur 1).

En begränsning av tidigare metodik som använts för att studera PG-sammansättning har varit den tidskrävande manuella identifieringen av muropeptider. På grund av komplexiteten och svårigheten kan addukter, laddningar och / eller isotoper ha inkluderats eller inte inkluderats i analysen. Dessutom begränsade de flesta studier analysen till de vanligaste, därmed lättast att rena, muropeptider. På grund av metodens komplicerade natur har därför relativt få detaljerade PG-sammansättningsanalyser på hög nivå utförts. Analyserna av "omic"-typ har använt de senaste tekniska förbättringarna för produktion och statistisk analys av relativt stora och komplexa LC-MS-dataset för översikt på hög nivå över biologiska system. Tillämpningen av peptidoglykomik möjliggör analys av PG-kompositionen i mycket fin detalj.

Inom peptidoglykomik minskar rekursiv extrahering av funktioner manuell arbetsbelastning och ökar noggrannheten genom att undersöka alla datafiler samtidigt. En algoritm för extrahering av rekursiva egenskaper används för att identifiera, justera och gruppera unika spektrala egenskaper (m / z-toppar) över flera LC-MS-kromatografiska datafiler som gör identifiering av muropeptid m / z-toppar automatiserade. Denna algoritm använder isotopmönstermatchning som tar de många potentiella isotoperna, jonaddukterna och laddningstillstånden och kondenserar de flera m / z-topparna till dess representativa enda förening (eller funktion), som i detta fall skulle representera en enda muropeptid (figur 3). Verifiering av spektralfunktionsgruppen utförs genom att jämföra retentionstid, m / z och isotopmönstermatchning inom varje kromatografisk datafil för att säkerställa robust extraktion av funktionen i hela datasetet. Generiska funktionssökningsalgoritmer kanske inte inkluderar isotopmatchning eller justering, gruppering eller verifiering av m/z-toppar över flera prover och kräver ytterligare manuell databehandling för att uppnå denna extrahering av funktioner.

När funktioner har identifierats hanterar bioinformatiska differentialanalysalgoritmer den mycket stora datamängden som helhet, vilket möjliggör användbara jämförelser och tolkningar från komplexa data. Att använda dessa bioinformatiska grafiska analyser är ett kraftfullt sätt att visualisera och tolka stora dataset för att undersöka trender som kan indikera biologiska processer. Det var först nyligen som dessa kraftfulla grafiska analyser användes för att undersöka peptidoglykan i mycket detalj12. Differentialanalys (avsnitt 3.2) bedömer förändringar i förekomst av enskilda muropeptider mellan olika experimentella betingelser. Inom ramen för hela bakterieceller kan aktiviteten hos PG-modifierande enzymer emellertid resultera i flera distinkta muropeptidstrukturer beroende på specificiteten hos den katalytiska aktiviteten (dvs tillsatsen av en acetylgrupp på disackarid kan vara med eller utan modifiering av peptidsidokedjan). Därför kommer bedömning av de globala överflödsförändringarna av en viss modifiering över alla enskilda annoterade muropeptider att ge insikt om den enzymatiska aktiviteten som verkar på PG (figur 5) Därför används differentialanalys för att undersöka överflödsförändringarna hos enskilda muropeptider; medan 1D-anteckning undersöker överflödsförändringar av en viss PG-modifiering. Kopplingsdifferentialanalys med 1D-annotering gör att PG-kompositionen kan bedömas både på individuell muropeptidnivå och även som en indikator på övergripande PG-enzymatisk aktivitet.

Under differentialanalys är det viktigt att notera att PG består av några mycket rikliga muropeptider och många muropeptider med låg överflöd12. Därför är baslinjen mycket viktig för att avlägsna eventuella bias från muropeptiderna med hög förekomst under de senare stegen i analysen. På grund av de flera utförda t-testerna måste också en statistisk korrigering för att minska falska positiva resultat tillämpas. Standardvärdet är ofta Benjamini-Hochbergs felidentifieringsfrekvens (FDR)19. Andra korrigeringar, såsom den mer konservativa Bonferroni familywise error rate (FWER)20,21 är möjliga.

Inom den bioinformatiska programvaran tilldelas m/z-toppen som identifieras vid extrahering av funktioner också en förutsagd struktur. Andra analyser av "omic"-typ (t.ex. proteomik) drar nytta av tillgången till stora sammansatta databaser, vilket möjliggör identifiering av föreningar genom prediktiv fragmentering av spektramatchning. För närvarande finns inget muropeptid förutspått fragmenteringsbibliotek och bekräftelsen av muropeptididentifiering förblir ett manuellt steg. I takt med att databaser för peptidoglykomisk fragmentering utvecklas och blir allmänt tillgängliga kommer detta manuella identifieringssteg att bli mer automatiserat och tillgängligt genom att avsnitten 3.3.3 och 3.3.4 elimineras eller kraftigt reduceras.

I Escherichia coli består PG av ~ 3,5 x 106 muropeptider per cell34. Inom detektionsgränserna för QTOF MS kan även de lägsta rikliga muropeptiderna fortfarande representera hundratals kopior av en enda muropeptid i en cell12. Därför kan förståelse av förändringarna till även de lägsta rikliga muropeptiderna ge användbar insikt i den biologiska aktiviteten hos PG-riktade enzymer i cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr. Jennifer Geddes-McAlister och Dr. Anthony Clarke för deras bidrag till att förfina detta protokoll. Detta arbete stöddes av driftsbidrag från CIHR som tilldelades C.M.K (PJT 156111) och en NSERC Alexander Graham Bell CGS D som tilldelades E.M.A. Siffror skapades den BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Tags

Retraktion utgåva 164 peptidoglykan muropeptider masspektrometri egenskapsextraktion differentialanalys bioinformatik peptidglykomik
Semikvantitativ analys av peptidoglykan genom vätskekromatografi, masspektrometri och bioinformatik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter