클로날 팽창은 항원 특이적 T 세포 반응의 주요 특징이다. 그러나, 항원 반응 T 세포의 세포 주기는 기술적인 한계 때문에 부분적으로, 제대로 조사되었습니다. 우리는 예방 접종 마우스의 비장 및 림프절에서 복제 확장 항원 특정 CD8 T 세포를 분석하는 유동 세포 측정 방법을 설명합니다.
생체 내항원 특이적 T 세포의 세포 주기는 몇 가지 방법을 사용하여 검사되었으며, 모두 몇 가지 한계를 가지고 있습니다. Bromodeoxyuridine (BrdU)는 S-phase에 있거나 최근에 완료된 세포를 표시하고, 카박스피플루오레세인 succinimidyl ester (CFSE)는 분할 후 딸 세포를 검출합니다. 그러나, 이러한 염료는 분석 시 세포 주기 단계의 식별을 허용하지 않는다. 대안적 접근법은 정지상G0을제외한 세포 주기의 모든 단계에서 세포에 의해 높게 발현되는 마커인 Ki67을 악용하는 것입니다. 불행하게도, Ki67은 이 단계에서 남아 있거나, 사이클링으로진행하거나, G0으로이동할 수 있는 G1의 세포로부터 미토시스에 전념하는 S-phase에서 세포를 분리하지 않기 때문에 추가 분화를 허용하지 않는다.
여기서는 마우스 이차 림프구 기관의 상이한 세포 주기 단계에서 T 세포의 “스냅샷”을 캡처하기 위한 유동 세포 측정 방법을 설명합니다. 이 방법은 Ki67 및 DNA 염색을 주요 조직 적합성 복합체(MHC)-펩타이드 멀티머 염색 및 혁신적인 게이팅 전략과 결합하고,G0,G1, S-G/M 상에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 성공적으로 분화할 수 있도록 하는 것은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1의 모델 항원 개그를 운반하는 바이러스 벡터를 이용한 백신 접종 후 마우스의 비장 및 배수 림프절의 S-G2/M상에서.1.
이 방법의 중요한 단계는 분석 민감도를 높이고 현재 분석 기준에 의해 누락되었을 고도로 활성화/증식하는 항원 특이적 T 세포를 포함하는 DNA 염료 및 게이팅 전략의 선택이었다. DNA 염료, Hoechst 33342는 막및 세포 내 염색을 보존하면서 G0/G1 및 G2/M DNA 피크의 고품질 차별을 얻을 수 있었습니다. 이 방법은 생체 내에서 T 세포 반응에 대한 지식을 증가시키고 면역 모니터링 분석을 개선할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
Naïve T 세포는 항원 프라이밍시 클로날 팽창 및 분화를 겪습니다. 분화 된 T 세포는 항원 클리어런스와 항원 특이적 기억유지에 필수적인 이펙터 기능을 표시하며, 이는 오래 지속되는 보호의 핵심입니다. 1차 반응의 첫 번째 단계 동안, 림프구내 의 전문 틈새 시장 내의 항원 제시 세포(APC)와의 순진한 T 세포 상호 작용은 클론 팽창 단계1,2,3을특징으로 하는 거대한 T 세포 증식을 유도하는 데 중요하다. T 세포-APC 상호작용은 T 세포 클론 자손4,5,6,7의양과 질에 영향을 미치는 항원, 공동 자극 신호 및 수용성 인자(사이토카인 및 케모키네)의 농도 및 지속성에 의해 미세하게 조절된다.
T 세포 클론 확장의 집중적인 연구에도 불구하고 항원 프라이밍 T 세포가 항원 인식 부위에서 전체 세포 주기를 완료했는지 또는 세포 주기 진행 중에 다른 장기로 마이그레이션하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 지식의 이 부족은 세포 주기 분석에 사용할 수 있는 공구의 속성 때문입니다. 여기에는 핵 마커, Ki67 및 세포 염료에 특이적 단일 클론 항체(mAbs)가 포함되며, 세포 주기의 S-phase를 겪은 세포를 식별하거나 딸 세포와 그 조상들 사이에서 차별(예: 카박스시플루오레신 succinimidyl(ESTERSE).
그러나, CFSE 및 BrdU와 같은 세포 라벨링 염료는, 특정 기관에서 발견된 세포가 로컬로 증식되었는지 또는 오히려 분할후이 사이트로 마이그레이션되었는지 여부에 대한 결정을 허용하지 않는다8,9. 더욱이, 핵 내 단백질인 Ki67은 G 0(Ki67-음성 세포)의 세포와 다른 세포 주기 단계(Ki67 양성 세포)의 세포만 구별할 수 있다. 따라서, Ki67 분석은 활성 증식(즉, S, G2또는 M)에서 세포를G1의세포와 구별하지 않으며, 이는 G1에서 장기간 분할 또는 체류또는10,11로되돌아갈 수 있다.
여기서, 예방접종된 마우스의 비장 및 림프절(LNs)으로부터 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을 위한 새로운 유동 세포측정 방법을 설명한다(도1). 상기 방법은 이전에 마우스골수(BM) 조혈세포의 세포주기를 분석하기 위해 사용하였던 Ki67 및 DNA 염색의 조합을이도(13,14)이다. 여기서는 최근 발표된 혁신적인 게이팅전략(12)과함께 KI67 플러스 DNA 염색을 CD8 T 세포 클론 확장 의 분석에 성공적으로 적용했습니다. G0,G1,S-G2/M상에서 백신 접종 된 마우스의 비장 및 배수 LN에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 명확하게 구별 할 수 있었습니다.
T 세포 복제 확장집중적으로 연구되었지만, 일부 측면은 알 수없는 상태로 남아 있습니다. 이러한 관점에서, 우리는 마우스 모형에 있는 백신 주사 후에 초기에 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기를 분석하기 위하여 고과민성 유동 세포 측정 방법을 설치했습니다. 상기 프로토콜은 이전에 마우스13,14에서BM 조혈 세포의 세포 주기를 분석하기 위해 사용된 Ki67 및 DNA 염색의 조합을 기반으로 한다. 항원 특이적 CD8 T 세포에 프로토콜을 적용하기 위해 DNA 염료 의 선택, 다른 샘플에 걸쳐 유사한 DNA 염색을 얻기 위한 적절한 조건, 데이터 분석을 위한 게이팅 전략을 포함하여 몇 가지 중요한 문제를 고려해야 했습니다.
많은 염료는 프로피듐 이오디드와 7-아미노락티노마이신 D를 포함하여 DNA 염색에 사용할 수 있습니다. 우리는 Ki67 염색에 필요한 멤브레인 염색 및 가벼운 고정 / 투과화 프로토콜과 호환되었기 때문에 Hoechst를 선택했습니다. 동시에, Hoechst를 염색하면 우수한 품질의 DNA 히스토그램을 얻을 수 있었으며, 즉 G0/G1 및 G2/MDNA 피크는 일반적으로 다른 DNA 염료로 얻은 DNA 피크보다 훨씬 낮은 계수(CV)를 가졌다( DRAQ519). 실제로, Hoechst는 살아있는 세포20에서도DNA를 얼룩지게 할 수 있습니다.
일부 전략은 동일한 실험의 다른 샘플에서 Hoechst 강도의 변동을 피하기 위해 사용되었다. Hoechst 염색은 시간 동안 염료 강도의 감소를 최소화하기 위해 유동 세포계에서 시료 수집 직전에 수행되었다. 수많은 샘플과 큰 실험에서 프로토콜을 재현하는 데 관심이있는 사람들을 위해 한 번에 몇 가지 샘플에 Hoechst 염색을 수행하는 것이 좋습니다. 또 다른 단점은 Hoechst 강도가 염료를 가진 잠복기 도중 세포 수에 의해 무겁게 영향을 받을 수 있다는 것입니다. 이러한 이유로, 우리는 강력하게 DNA 염색을위한 샘플 당 세포의 동일한 수와 동일한 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 유동 세포계에서 획득하기 위해 많은 수의 세포가 필요한 경우, 두 개 이상의 동일한 샘플을 준비하고 Hoechst 염색 단계 직전에 병합하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 핵심은 데이터 분석을 위한 게이팅 전략입니다. 최근에는 면역 반응 초기에 T 세포 분석을 위한 새로운 전략을 발표하여 항원 특이적 T세포(12)의검출 민감도를 높일 수 있게 되었다. 이 전략을 다음과 같이 여기에 표시된 데이터에 적용했습니다. 첫째, 우리는 DNA-A/W 플롯에서 세포 응집체를 제외했습니다. 둘째, 죽은 세포를 게이팅 한 후, 우리는 FSC / SSC 플롯 (“편안한 게이트”)에서 상당히 큰 림프구 게이트를 사용했습니다. 이 전략에 의해, 우리는 이러한 세포가 높은 FSC-A 및 SSC-A를 가지고 있기 때문에, 일반적으로 현재 게이팅 전략에 의해 놓친 S-G2/M에 고도로 활성화 된 항원 특이CD8 T 세포를 포함 할 수 있었다. 요약하자면, 데이터 분석은 항원 특이적 T 세포의 활성/증식의 민감한 검출을 얻는 데 필수적인 방법의 중요한 부분을 나타낸다.
이 방법은 면역 반응의 초기 단계에서 중요한 T 세포 데이터를 누락할 가능성을 방지하고 T 세포 면역 모니터링을 위한 새로운 관점을 엽니다. 향후 개선은 G2와 M21사이의 분화를 허용하는 인히스톤 3에 대한 염색을 포함할 수 있다. 현재 한계는 세포가 핵 마커, Ki67에 대한 얼룩을 위해 고정되고 투과화되어야 한다는 것입니다. 따라서 셀은 정렬 및 후속 기능 분석과 같은 다른 유형의 분석에 사용할 수 없습니다. 더욱이, Hoechst를 포함하여 DNA 염료는 일반적으로 게놈 DNA 분석을 방해하고 평가의 이 모형을 위해 적합하지 않습니다. 다른 세포 주기 단계와 상관 관계가 있고 살아있는 세포에 얼룩질 수 있는 막 마커의 확인은 이 한계를 극복할 수 있었습니다. 결론적으로, 이 방법은 예방 접종, 감염, 면역 매개 질환 및 면역 요법과 같은 여러 맥락에서 T 세포를 활성화/증식하는 평가를 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 MiUR 프로젝트 2017K55HLC_006 의해, 로미아에 의해 지원되었다, 5 × 에 의해 1000 아소시아지오네 이탈리아어 리스크카 술 칸크로에서 보조금 (AIRC). 다음 테트라머는 NIH 테트라머 시설을 통해 획득되었다: APC-컨쥬게이드 H-2K (d) HIV 개그 197-205 AMQMLKETI.
1-200 μL universal fit bulk packed pipet tips | Corning | CLS4866-1000EA | |
2.4G2 anti-FcγR mAb | BD | 553141 | 10 μg/ml final concentration |
5 ml syringe plunger | BD Emerald | 307733 | |
15 ml conical tubes | MercK Millipore | SBHA025SB | |
60 mm TC-treated Cell Culture Dish | Falcon | 353002 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352097 | |
96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate | Falcon | 353077 | |
Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles | BD- Bioscience | 552845 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A07030 | |
BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a | BD- Bioscience | 564920 | 4 μg/ml final concentration |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120159 | |
Ethanol | Sigma | 34852-1L-M | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-079-CV | |
Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 μm | Falcon | 352350 | |
Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | 1:1000 final concentration |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x |
H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer | provided by NIH Tetramer Core Facility | 6 μg/ml final concentration | |
H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer | Proimmune | F176-2A-E – 176 | 10 μL / sample |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC | eBioscience | 11-5698-82 | 5 μg/ml final concentration |
L-Glutamine 100X (200 mM) | Euroclone | ECB3000D | |
Millex-HA Filters 0,45 µm | BD | 340606 | |
Penicillin/Streptomycin 100X | Euroclone | ECB3001D | |
PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104418 | 0.2 μg/ml final concentration |
PerCP-Cy™5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e | BD- Bioscience | 551163 | 4.4 μg/ml final concentration |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352058 | |
RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red | Euroclone | ECB9006L | |
Software package for analyzing flow cytometry data | FlowJo | v.10 | |
Software for acquisition of samples at flowcytometer | BD FACSDiva | v 6.2 | |
Trypan Blue Solution | Euroclone | ECM0990D |