Mus ble plassert på Plaisant Animal Facility, og arbeidet ble utført under det italienske helsedepartementets autorisasjonsnummer 1065/2015-PR. Protokollen fulgte retningslinjene for dyrepleie i henhold til nasjonale og internasjonale lover og retningslinjer (UE-direktiv 2010/63/UE; Italiensk lovgivende dekret 26/2014). 1. Fremstilling av middels og fargingsoppløsning Forbered komplett medium: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 50 μM beta-mercaptoethanol og 10% volum / volum (v / v) av foster bovint serum (FBS) Klargjør fargingsbuffer: Fosfatbufret saltvann uten Ca2+/Mg2+ (PBS) med 1% vekt/volum (m/v) bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM etylendiamintetraacetisk syredisodiumsalt (EDTA) 2. Musebehandling Prime 7-8-ukers, kvinnelige Balb / c mus ved intramuskulær (i.m.) injeksjon i quadriceps av humant immunsviktvirus (HIV)-1-gag-expressing-sjimpanse adenoviral vektor (ChAd3-gag) med en dose på 107 virale partikler. Ved 1-4 måneder etter grunning, øke når musene ved i.m. injeksjon av HIV-1-gag-uttrykke modifisert vaccinia Ankara virus (MVA-gag) med en dose på 106 plakk-forming enheter. På dag 3 etter boost, ofre de forsterkede musene ved cervical dislokasjon, og analyser dem parallelt med ubehandlede mus. Høst LN-ene som drenerer quadriceps (iliac, popliteal og inguinal) og miltene fra forsterkede og ubehandlede mus. Videre samler du BM fra de to bakbenene fra ubehandlede mus, og bruker denne BM for strømningscytometerinnstillinger og som positiv kontroll for cellesyklusanalyse (Figur 2).MERK: Generer ChAd3-gag- og MVA-gag-vektorer som beskrevet tidligere12,15,16,17. 3. Isolering av drenering av LN-, milt- og BM-celler Isolering av milt- og LN-celler Plasser 5 ml komplett medium i hvert av to 15 ml rør, og hold dem på is, klar for organer som skal samles. Ofre en voksen mus ved cervical dislokasjon. Plasser musen på ryggen, og steriliser hudoverflaten med 70% v / v etanol. For å samle inguinale LNer, lag et ~ 1 cm langsgående snitt på magen med saks, og strekk snittet med tangene. Visualiser inguinale LNer på den indre overflaten av huden, og høst dem med tang. Plasser de inguinale LN-ene i et av de to 15 ml rørene som er utarbeidet i trinn 3.1.1. For å samle milten, lag et peritonealt snitt med saks og fjern milten. Etter å ha kuttet det omkringliggende bindevevet, plasser milten i det andre 15 ml-røret som er fremstilt i trinn 3.1.1. For å samle iliac LNer, flytt tarmene til side og visualiser iliac LNer nær den dårligere vena cava, og samle dem deretter ved hjelp av tang. Plasser iliac-LN-ene i samme rør som inneholder inguinale LNer.MERK: For å få nok LN-celler til farging (se avsnitt 4), er det ofte nødvendig å samle popliteal, inguinal og iliac LNer fra en mus. Disse LN-ene drenerer alle quadriceps (stedet for i.m. vaksinasjon). Denne protokollen bruker bare ett 15 ml rør med samlede LNer. For å samle popliteale LNer, ta tak i huden på bakbenene og trekk den forsiktig nedover for å avdekke musklene. Sett deretter tang mellom musklene under kneleddet, og samle popliteal LNs. Plasser popliteale LNer i samme rør som inneholder inguinale og iliac LNer.MERK: Se merknad etter 3.1.7. Plasser milten i en 70 μm cellesil innenfor en 60 mm kulturrett fylt med 5 ml komplett medium. Bruk et 5 ml sprøytestempel til å mose orgelet forsiktig til det er fullstendig oppsamlert. Fjern silen, og overfør cellefjæringen til et rent 15 ml rør. Tilsett 5 ml komplett medium til kulturretten, og vask forsiktig parabolen og silen for å sikre at alle celler er gjenopprettet. Basseng med resten av miltcellefjæringen inn i 15 ml-røret. For de samlede inguinale, iliac og popliteale LN-ene, klargjør du en enkeltcellet suspensjon etter en lignende prosedyre som den som brukes i trinn 3.1.9 til 3.1.11 for milten. Sentrifuger celler ved 400 × g i 10 min ved 4 °C. Kast supernatanten, og resuspender cellepellets i PBS. Tell cellene med et Neubauer-kammer ved hjelp av rød blodcelle lysisbuffer og 0,04% v / v trypan blå i PBS. Isolering av BM-celler Plasser 5 ml komplett medium i et 15 ml rør, og hold det på is, klar for innsamling av bakben. Ofre en voksen mus ved cervical dislokasjon. Steriliser hudoverflaten med 70 % v/v etanol. Lag et tverrsnitt på den ventrale huden med saks, ta godt tak i huden på begge sider av kuttet, og trekk forsiktig nedover for å avdekke musklene i bakbenene. For å eliminere huden fra baksiden av bakbenene, hold musen i en liggende stilling, plasser klemmen under kneet, og trekk oppover for å eksponere musklene. Klipp beinene i de to ekstremitetene på ett bakben: bekkenet / hofteleddet og ankelen. Overfør begge bakbenene til 15 ml-røret som er klargjort i trinn 3.2.1. Hold røret på is. Ta bakbenene fra 15 ml-røret og overfør dem til silkepapir. Klipp bakbenene like under kneleddet for å fjerne tibia. Disseker lårbenet og tibia fra de omkringliggende musklene, fjern overflødig vev ved hjelp av saks og vått vevspapiret. Klipp beinendene med saks for å eksponere den indre margskaftet. Sett tibia og lårben inn i BM ekstraksjonsrøret (se tilberedning i 3.2.9.1-3.2.9.218), med den bredeste enden nederst. Klipp en 200 μL pipettespiss på linjen like over enden av spissen og ved 100 μL-linjen. Plasser den midterste delen i den øvre, større delen av spissen, og legg denne i et 1,5 ml mikrofugerør. Spinn BM ekstraksjonsrøret på 800 × g i 1 min. Kast benet, og resuspender pelletsen kraftig i 1 ml komplett medium for å fjerne klynger. Filtrer celleopphenget gjennom et 70 μm filter plassert på toppen av et 15 ml rør. Vask BM ekstraksjonsrøret to ganger med 1 ml komplett medium hver gang. Filtrer gjennom et 70 μm-filter, og slå sammen volumet med resten av celleopphenget oppnådd i trinn 3.2.11.MERK: Et enkelt 15 ml rør vil inneholde celler fra begge bakbenene på en mus. Sentrifuger celler ved 400 × g i 10 min ved 4 °C. Kast supernatanten, og bruk cellepelleten på nytt i PBS. Tell cellene med et Neubauer-kammer ved hjelp av rød blodcelle lysisbuffer og 0,04% v / v trypan blå i PBS. 4. Farging av milt-, LN- og BM-celler Del celleprøver som skal farges i 3 undergrupper: celleprøver for kompensasjon, inkludert BM-celler fra ubehandlede mus som bare skal farges med Hoechst 33342 (heretter referert til som Hoechst) og miltceller fra ubehandlede mus som skal brukes til å forberede en død / levende celleblanding for dødcellefargekompensasjon; positiv kontroll for cellesyklusanalyse, bestående av en BM-prøve fra ubehandlede mus; eksperimentelle prøver som inneholder milt- og LN-prøver fra ubehandlede og vaksinerte mus.MERK: Kontroller at det er nok milt- og LN-celler til analyse av tilstrekkelig antall gag-spesifikke CD8 T-celler. Det er ofte nødvendig å bruke samlede miltceller og samlede LN-celler fra 3 vaksinerte mus og flekke to eller flere identiske prøver av samlede celler, som hver inneholder 3 × 106 celler. Slå sammen identiske prøver på trinnet av Hoechst farging. På samme måte, flekk samlet miltceller og LN celler fra 3 ubehandlede mus, og slå sammen identiske prøver på slutten. Sett til side en uoppdaget prøve av miltceller fra en ubehandlet mus som skal brukes til instrument- og kompensasjonsoppsett. Forbered død / levende celleblanding for dødcellefargekompensasjon (denne blandingen av celler vil bare bli farget med dødcellefargen). Varm opp et vannbad ved 65 °C. Ta en aliquot av miltceller (~3 × 106). Overfør cellefjæringen til et mikrofugerør, plasser den i vannbadet ved 65 °C i 5 minutter, og plasser den deretter umiddelbart på is i 10 minutter. Bland de varme-drepte cellene med levende miltceller (~ 3 × 106) i et forhold på 1:1, og overfør halvparten av blandingen til en 96 godt rund bunnplate (~ 3 × 106 celler / brønn for dødcelleknusingskontrollen). Dødcellefarging av eksperimentelle prøver, positiv kontroll for cellesyklusanalyse og død/levende celleblanding Overfør milt, LN, BM-celler (3 × 106 celler/brønn), og død/levende celleblanding (avsnitt 4.2) i 96-brønns rundbunnsplate, i henhold til fargingsskjemaet (trinn 4.1), og sentrifuge ved 400 × g i 3 min ved 4 °C. Resuspend hver cellepellet i 50 μL død cellefarge fortynnet i PBS, og resuspend ved pipettering opp og ned 3 ganger umiddelbart. Inkuber i 30 min ved 4 °C, beskyttet mot lys. Vask celler 2 ganger med fargebuffer; første gang med 200 μL og andre gang med 250 μL. For hver vask sentrifuger platen ved 400 × g i 3 min ved 4 °C. Kast supernatanten, og bruk cellepelleten på nytt i 20 μL PBS. Membrancellefarging med større histokompatibilitetskompleks (MHC)-peptid multimers og mAbs. Ta hensyn til de nødvendige volumene i henhold til fargingsskjemaet (Flow cytometer-innstillinger, tabell 1), klargjør følgende reagenser: Fortynn mAb 2,4 G2 i fargingsbufferen i henhold til riktig fortynning (se Materialtabell); For hver prøve som skal farges, bruk 10 μL av denne fortynning.MERK: 2,4 G2 mAb blokkerer ikke-antigenspesifikk binding av immunglobuliner til FcγIII- og FcγII-reseptorene. Fortynn H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-merket tetramer (Tetr-gag) i fargingsbufferen for å oppnå riktig fortynning (se Materialfortegnelse); For hver prøve som skal farges, bruk 20 μL av denne fortynning. Forbered antistoffblandingen ved å fortynne mAbs i fargingsbufferen i henhold til riktig fortynning (se Materialfortegnelse) som tidligere er bestemt i titreringseksperimenter; For hver prøve som skal farges, bruk 20 μL av denne antistoffblandingen.MERK: Her, anti-CD3e peridinin klorofyllprotein (PerCP-Cy5.5) (klone 145-2C11), anti-CD8a strålende ultrafiolett (BUV805) (klone 53-6.7), og anti-CD62L fycoerythrin cyanine7 (PECy7) (klone MEL-14) ble brukt. Tilsett 10 μL av den tidligere fortynnede 2,4 G2 mAb (trinn 4.4.1.1), og inkuber i 10 min ved 4 °C, beskyttet mot lys. Tilsett 20 μL av den tidligere fortynnede Tetr-gag APC (trinn 4.4.1.2) og 10 μL H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) pentamer (pent-gag). Inkuber i 15 min ved 4 °C, beskyttet mot lys. Tilsett 20 μL av den tidligere tilberedte antistoffblandingen (trinn 4.4.1.3), og inkuber 15 min ved 4 °C, beskyttet mot lys.MERK: Derfor er sluttvolumet 80 μL per brønn (trinn 4.3.5, trinn 4.4.2 til 4.4.4). Vask celler med 200 μL fargebuffer. Sentrifuge ved 400 × g i 5 min ved 4 °C. Resuspend cellepellet i 250 μL farging buffer, og overføre celle suspensjon til 5 ml rør. Tilsett 1 ml fargingsbuffer til røret, og sentrifuger ved 400 × g i 5 min ved 4 °C. Ta aliquot av BM-celler (3 × 106 celler) (se liste over celleprøver, avsnitt 4.1) som skal brukes til å kompensere Hoechst-kanalen (Hoechst 33342 er begeistret av en ultrafiolett laser (flow cytometer innstillinger (Tabell 2)), og overfør cellefjæringen til et 5 ml rør. Tilsett 1 ml fargingsbuffer til røret, og sentrifuger 400 × g i 5 min ved 4 °C. 5. Fiksering / permeabilisering Forbered fersk fikserings-/permeabiliseringsbuffer ved å fortynne 1 del fikserings-/permeabiliseringskonsentrat med 3 deler fikserings-/permeabiliseringsfortynning, i henhold til produsentens instruksjoner. Kast supernatanten og pulsvirvel prøvene for å fullstendig disaggregate pelletsen. Tilsett 1 ml av den nylagde fikserings-/permeabiliseringsbufferen i hvert rør, inkludert et rør med unstained miltceller (3 x 106, se liste over celleprøver, avsnitt 4.1) og virvel. Inkuber i 16 timer ved 4 °C.MERK: Protokollen kan settes på pause her. 6. Intracellulær farging Ki67 flekker Forbered fersk permeabiliseringsbuffer 1x ved å fortynne permeabiliseringsbuffer 10x med destillert vann, i henhold til produsentens instruksjoner. Før bruk må permeabiliseringsbufferen 1x filtreres gjennom et 0,45 μm filter for å eliminere aggregater. Fortynn mAb Ki67 fluorescein isothiocyanate (FITC) (klone SolA15) i permeabiliseringsbuffer 1x (se Materialtabell), som tidligere bestemt i titreringseksperimenter (sluttvolum på 100 μL per prøve). Tilsett 3 ml permeabiliseringsbuffer 1x til hvert rør, og sentrifuger ved 400 × g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten og gjenta trinn 6.1.3. Kast supernatanten, og resuspend cellepellet i 100 μL tidligere fortynnet mAb Ki67 FITC (trinn 6.1.2). Inkuber i 30 min på RT, beskyttet mot lys. Vask celler 2 ganger med 4 ml permeabiliseringsbuffer 1x. For hver vask sentrifuge ved 400 × g i 5 min ved RT. Resuspend cellepellet i PBS vurderer følgende volumer: 350 μL PBS for prøvene som skal anskaffes direkte ved strømningscytometeret; 250 μL PBS for at prøvene skal inkuberes med Hoechst kort tid før strømningscytometri (pkt. 6.2). DNA-farging Tilsett 250 μL 4 μg/ml Hoechst i PBS i hver prøve (den endelige konsentrasjonen av Hoechst er 2 μg/ml).MERK: I tilfelle to eller flere identiske prøver på 250 μL i PBS ble utarbeidet, slå dem sammen på dette trinnet, og legg til like store mengder 4 μg/ml Hoechst-oppløsning i PBS (den endelige konsentrasjonen av Hoechst er 2 μg/ml). Antall celler påvirker DNA-fargingstrinnet sterkt. Bruk samme cellenummer i hvert utvalg. Vær oppmerksom på at selv et litt redusert cellenummer (f.eks. på grunn av celletap i tidligere vasketrinn) resulterer i høyere Hoechst-binding til DNA og høyere Hoechst-intensitet. Inkuber i 15 min på RT, beskyttet mot lys. Sentrifuger prøvene ved 400 × g i 5 min ved RT. Resuspend cellepellet i 350 μL PBS. 7. Utarbeidelse av kompensasjonsperleprøver Forbered 5 μL av antistoffet ved å fortynne mAb i fargingsbufferen på riktig måte.MERK: For hver fluorokromkonjugert mAb som brukes i forsøket, klargjør den tilsvarende kompensasjonsperleprøven. Vortex Negativ kontroll og Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp Perler før bruk. For hver prøve, introdusere en dråpe (~ 20 μL) av Negative Control CompBeads og en dråpe Anti-Rat / Hamster Ig, k CompBeads. Tilsett 5 μL av det forvannede antistoffet (trinn 7.1) på røret, og pipet opp og ned. Inkuber i 15 min ved 4 °C, beskyttet mot lys. Vask prøver med 2 ml fargebuffer. Sentrifuge ved 400 × g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten, og bruk pelletsen på nytt ved å tilsette 500 μL PBS til hvert rør og virvel. 8. Instrument- og kompensasjonsoppsett og eksperimentelt prøveanskaffelse ved strømningscytometeret MERK: Se innstillingene for strømningscytometer (tabell 2) for cytometerkonfigurasjonen. Generelt instrument- og kompensasjonsoppsett Åpne programvaren for eksempelanskaffelse (se Tabell over materialer), og opprett et nytt eksperiment ved å klikke Nytt eksperiment i arbeidsområdebånddelen og velge Nytt tomt eksperiment. Dobbeltklikk på det opprettede eksperimentet for å åpne det. I vinduet Cytometer Settings klikker du på Parametere og velger alle kanalene (f.eks. PE, APC, etc.) som brukes i fargepanelet, inkludert Parameterne Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC). Velg lineær skala som en Hoechst-parameter ved å fjerne merket for loggskalaen, og kontroller bredden (W) på spenningspulsen for FCS, SSC og Hoechst.MERK: Alle parametrene vises som standard i logaritmisk skala (loggskala), bortsett fra FSC og SSC som er i lineær skala. Alle parametrene analyseres av spenningspulsens område (A) og høyde (H). I det globale regnearketoppretter du en prikktegning med FSC-A på x-aksen og SSC-A på y-aksen. Kjør det ubelagte milten ved å klikke Hent data på instrumentbordet for anskaffelse. Angi de riktige FSC- og SSC-innstillingene for å visualisere cellene ved å endre spenningsverdiene i Parametere -delen, og opprett en port for å merke alle cellene som vises i prikkplottet FSC-A/SSC-A ved å klikke Polygon Gate på verktøylinjen for arbeidsområdet i det globale regnearket. Vis de inngjerdede cellene i histogrammer med hver fluorescensparameter på x-aksen. Kjør uoppdagede og fullt fargede miltprøver for å justere fluorescensdetektoren (PMT) for å ha en klar separasjon mellom negative og positive signaler fra de fargede cellene for hver fluorescensparameter. Hvis du vil utføre kompensasjonsoppsett, klikker du Eksperimenter på båndet i arbeidsområdet, og under Kompensasjonsoppsett velger du Opprett kompensasjonskontroller. Fjern merket for Inkluder unstained Control Tube/Well , og klikk OK.MERK: Denne operasjonen vil resultere i opprettelsen av et eksemplar kalt Kompensasjonskontroller og et normalt regneark som inneholder flere ark som tilsvarer hver valgte parameter. Kjør et utvalg av kompensasjonsperler (se avsnitt 7); angi de riktige FSC- og SSC-innstillingene for å visualisere perlene ved å endre spenningsverdiene og anskaffelsesterskelen på 5000 på FSC-parametere i Cytometer-vinduet. Juster P1-porten på perlepopulasjonen, og kontroller at de positive og negative toppene begge er synlige på x-aksen. Gjenta denne operasjonen for hvert eksempel på kompensasjonsperler, og registrer til slutt hver eksempelfil ved å klikke Registrer data på anskaffelsesinstrumentbordet (registrer minst 5 000 hendelser for hvert eksempel). For hver registrerte perleprøve setter du P2- og P3-portene på henholdsvis de positive og negative toppene. Kjør celleprøvene for kompensasjon (se trinn 4.2 og 4.4.7, og avsnitt 5 og 6). Endre FSC- og SSC-spenningene og terskelverdien for å visualisere cellene, justere P1-porten og til slutt registrere hver prøvefil (registrere minst 10 000 hendelser). Sett P2- og P3-portene på henholdsvis de positive og negative toppene.MERK: For kompensasjon av Hoechst-kanalen, bruk G0/G1 som negativ topp (P3) og G2/M som den positive (P2). Klikk Eksperiment i delen på båndet i arbeidsområdet, og velg Beregn kompensasjonunder Kompensasjonsoppsett . Gi den opprettede kompensasjonsinnstillingen et navn, koble til og lagre den i gjeldende eksperiment. Eksperimentell prøveanskaffelse Åpne et eksemplar ved å klikke Nytt eksemplar på verktøylinjen i webleseren, og opprett gatingstrategien i det globale regnearket.MERK: Gatingstrategien for prøveanskaffelse ligner på utvalgsanalysen, beskrevet i figur 3 og avsnitt 9. Vis all hendelsespopulasjon i et histogram med CD3-A på x-aksen. Opprett en intervallport for å merke bare CD3+-cellene. På instrumentbordetfor anskaffelse velger du lagringsport som Alle hendelser for LN-prøver, og enten Alle hendelser eller CD3+ celler for miltprøver. Kjør de eksperimentelle prøvene med lav hastighet, og ta til slutt opp alle filene som sørger for å samle minst 100-200 antigenspesifikke CD8 T-celler for hver prøve fra de vaksinerte musene.MERK: Filstørrelsen på eksperimentelle prøver er vanligvis stor (30-120 MB), spesielt når frekvensen av antigenspesifikke CD8 T-celler er lav. Derfor må et høyt antall hendelser (> 1 ×10 6) samles inn for å registrere minst 100-200 antigenspesifikke CD8 T-celler. Store filer kan redusere den påfølgende dataanalyseprosessen. Oppkjøpet av bare CD3+ celler i miltprøver (se trinn 8.2.2 ovenfor) er nyttig for å holde filstørrelsen mindre. Kjør og registrer den positive kontrollen for cellesyklusanalyse, det vil si BM-prøve fra ubehandlede mus. 9. Dataanalyse Åpne programvaren (se Tabell over materialer), og opprett forskjellige grupper som tilsvarer de forskjellige organene som skal analyseres, ved å klikke Opprett gruppe i arbeidsområdebånddelen (dvs. opprette gruppe “a-LNer”; “b-milt”; “c-BM”).MERK: Nyopprettede grupper vises i gruppelisten, mens kompensasjonsgruppen genereres automatisk av programvaren. Åpne Vinduet Endre gruppe ved å dobbeltklikke gruppenavnet og kontrollere at de nyopprettede gruppene er synkronisert. Hvis ikke, setter du en hake i funksjonen Synkronisert. Dra hver FCS-fil i den tilsvarende gruppen. Opprett gatingstrategien som begynner med “a-LNs”-gruppen. Dobbeltklikk på den fullt fargede prøven i gruppen for å åpne grafvinduet; x- og y-aksen er merket som i fcs-filene (se innstillinger for flytcytometer, tabell 2). Vis de totale hendelsene som er oppnådd for denne prøven i et punktplott med DNA-A på x-aksen og DNA-W på y-aksen. Velg bare enkeltcellepopulasjonen ved å klikke Rektangel i delen for trykkingsverktøyet i diagramvinduet.MERK: Enkeltceller har DNA-A-verdier som følger: 2N (lav): mellom 2N og 4N (middels), eller lik 4N (høy), mens DNA-W-verdier er identiske for dem alle (trinn 1 i figur 3). Dobbeltklikk midt i den rektangulære porten for å vise enkeltceller i en prikkplott med FSC-A-parameteren på x-aksen og død cellefargen på y-aksen. Velg bare den aktive cellepopulasjonen ved å klikke på Polygon i delen for trykkingsverktøyet i diagramvinduet. Levende celler er negative for dødcellefargen (trinn 2 i figur 3). Dobbeltklikk midt i den mangekantede porten for å vise cellene i en prikktegning med FSC-A-parameteren på x-aksen og SSC-A-parameteren på y-aksen. Klikk Rektangel, og opprett en “avslappet” port for å inkludere alle de enkle levende cellene i diagrammet12 (trinn 3 i figur 3). Dobbeltklikk midt i den “avslappede” porten for å vise cellene i en prikkplott med CD3 på x-aksen og CD8 på y-aksen. Velg CELLENE CD3+CD8+ ved å klikke på Polygon (trinn 4 i figur 3). Dobbeltklikk midt på CD3+CD8+ porten for å vise cellene i en prikkplott med Tetr-gag på x-aksen og Pent-gag på y-aksen. Merk de antigenspesifikke CD8 T-cellene (positivt for både Tetr-gag og Pent-gag) ved å klikke på Polygon (trinn 5 i figur 3). Dobbeltklikk midt i den gag-spesifikke porten for å vise cellene i et punktplott med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen (figur 4). Merk cellene i de forskjellige cellesyklusfasene ved å klikke på Quad i gatingverktøydelen av grafvinduet.MERK: Celle i G0 fase er Ki67neg-DNA lave celler (nederst til venstre kvadrant); celler i G1 er Ki67pos-DNA lav (øvre venstre kvadrant); celler i S-G2/M er Ki67pos-DNA mellomliggende/høy (kvadrant øverst til høyre) (Figur 4). Kopier gatingstrategien som er opprettet i ett utvalg, til den tilsvarende gruppen for å bruke portene på alle eksemplene i gruppen. Gjenta trinn 9,5 til 9,18 for A-LN-gruppen. Kontroller at alle portene passer for hver prøve av “b-milten”-gruppen. For å analysere cellesyklusen blant BM-cellene (positiv kontroll), klikk i midten av den “avslappede” porten for å vise cellene i en prikkplott med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Kontroller at alle portene passer for hvert utvalg av de 3 gruppene (dvs. for celler fra milt, LN og BM).MERK: Encellet populasjonsport (trinn 9.7) og Quad gate for cellesyklus (trinn 9.17) kan ha forskjellige portkoordinater i forskjellige prøver, hovedsakelig på grunn av de mulige små forskjellene i Hoechst-fargeintensiteten mellom prøver (avsnitt 6.2). Derfor kan det være nødvendig å endre populasjonsporten enkeltcellet og fire portene for cellesyklus i hvert utvalg. Dette gjøres på følgende måte: Dobbeltklikk på gruppenavnet, og fjern synkroniseringen fra gruppeegenskapene. Denne operasjonen tillater endring av portene i ett utvalg uten å endre de samme portene i alle de andre eksemplene i gruppen. Når synkroniseringen er fjernet, endrer du portene der det er nødvendig. Hvis du vil visualisere resultatene fra denne analysen, klikker du Oppsettredigering i delen for arbeidsområdebånd for å åpne den. Dra hver port for gatingstrategien i eksempelruten til oppsettredigeringsprogrammet, og plasser plottene i henhold til sekvensen av gating-strategien. Hvis det er nødvendig, endrer du diagramtypen ved å dobbeltklikke på det tilsvarende plottet i oppsettet og velge riktig type i Graph Definition-vinduet. Klikk på gruppen og gjenta etter funksjoner på layoutbåndet for å visualisere resultatene oppnådd i hvert organ, og sammenlign forskjellige prøver.