Mus blev anbragt på Plaisant Animal Facility, og arbejdet blev udført under det italienske sundhedsministeriums autorisationsnummer 1065/2015-PR. Protokollen fulgte retningslinjerne for dyrepleje i henhold til nationale og internationale love og politikker (UE-direktiv 2010/63/UE; italiensk lovdekret 26/2014). 1. Fremstilling af medium og farvningsopløsning Forbered Komplet Medium: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin/streptomycin, 50 μM beta-mercaptoethanol og 10% volumen /volumen (v/v) af fosterkvæg serum (FBS) Forbered farvning Buffer: Fosfat-buffered saltvand uden Ca2 +/ Mg2 + (PBS) med 1% vægt / volumen (w / v) kvæg serum albumin (BSA) og 2 mM ethylendiamintetraacetic syre disodium salt (EDTA) 2. Musebehandling Prime 7-8-uger gamle, kvindelige Balb /c mus ved intramuskulær (i.m.) injektion i quadriceps af human immundefekt virus (HIV)-1-gag-udtrykke-chimpanse adenoviral vektor (ChAd3-gag) med en dosis på 107 viruspartikler. Ved 1-4 måneder efter priming, boost en gang musene ved i.m. injektion af HIV-1-gag-udtrykke modificeret vaccinia Ankara virus (MVA-gag) med en dosis på 106 plaque-dannende enheder. På dag 3 efter boost, ofre de boostede mus ved cervikal dislokation, og analysere dem parallelt med ubehandlede mus. Høst de LN’er dræne quadriceps (iliac, popliteal, og lyske) og milt fra boostet og ubehandlede mus. Desuden opsamle BM fra de to bagben fra ubehandlede mus, og bruge denne BM til flow cytometer indstillinger og som positiv kontrol for celle cyklus analyse (Figur 2).BEMÆRK: Generer vektorer for ChAd3-gag og MVA-gag som beskrevet tidligere12,15,16,17. 3. Isolering af dræning LN, milt, og BM celler Isolering af milt- og LN-celler Placer 5 mL komplet medium i hver af to 15 ML rør, og holde dem på is, klar til organer, der skal indsamles. Ofre en voksen mus ved cervikal dislokation. Placer musen på ryggen, og steriliser hudoverfladen med 70% v/v ethanol. For at indsamle inguinal LNs, lav en ~ 1 cm langsgående snit på maven med en saks, og strække snittet med kraften. Visualiser inguinal LNs på den indre overflade af huden, og høst dem med sammentakkerne. Lyske-L’erne placeres i et af de to 15 ML-rør, der er fremstillet i trin 3.1.1. For at samle milten skal du lave et peritoneal snit med en saks og fjerne milten. Efter skæring af det omgivende bindevæv placeres milten i det andet 15 mL rør, der er fremstillet i trin 3.1.1. At indsamle iliac LP’er, flytte tarmene til side og visualisere iliac LP’er tæt på ringere vena cava, og derefter indsamle dem ved hjælp af sammentværingerne. Læg iliaca-LU’erne i det samme rør, der indeholder de lyske LN’er.BEMÆRK: For at få nok LN-celler til farvning (se afsnit 4) er det ofte nødvendigt at samle popliteale, inguinale og iliac-L’er fra én mus. Disse LP’er dræner alle quadriceps (stedet for i.m. vaccination). Denne protokol bruger kun ét 15 ML-rør med puljede LN’er. For at indsamle popliteale LNs skal du gribe bagbenenes hud og forsigtigt trække den nedad for at afdække musklerne. Indsæt derefter sammentakkerne mellem musklerne under knæleddet, og saml de popliteale LNs. Placer de popliteale LN’er i samme rør, der indeholder lyske og iliac-LP’er.BEMÆRK: Se note efter 3.1.7. Læg milten i en 70 μm cellesn si i en 60 mm kulturskål fyldt med 5 mL komplet medium. Brug et 5 mL sprøjtestemning, forsigtigt mose organet, indtil dets fuldstændige opdeling. Fjern si, og overfør celleaffjedringen til et rent 15 ML rør. Tilsæt 5 mL komplet medium til kulturskålen, og vask forsigtigt fadet og sien for at sikre, at alle celler er blevet genoprettet. Pool med resten af milten celle suspension i 15 mL rør. For de samlede inguinal-, ilia- og popliteale LN’er forberedes en enkelt celleaffjedring efter en procedure, der svarer til den, der anvendes i trin 3.1.9 til 3.1.11 for milten. Centrifugeceller ved 400 × g i 10 min ved 4 °C. Kassér supernatanten, og genbrug cellepillerne i PBS. Tæl cellerne med et Neubauer kammer ved hjælp af røde blodlegemer lysis buffer og 0,04% v / v trypan blå i PBS. Isolering af BM-celler Placer 5 mL komplet medium i en 15 ML rør, og holde det på is, klar til indsamling af bagben. Ofre en voksen mus ved cervikal dislokation. Steriliser hudoverfladen med 70% v/v ethanol. Lav en ~ 1 cm tværgående snit på ventral hud med en saks, fast greb huden på begge sider af snittet, og træk forsigtigt nedad for at afdække musklerne i bagbenene. For at fjerne huden fra bagsiden af bagbenene, holde musen i en liggende position, placere klemmen under knæet og trække opad for at udsætte musklerne. Skær knoglerne i de to ekstremiteter i det ene bagben: bækken / hofteled og anklen. Begge bagben overføres til det 15 ML-rør, der er fremstillet i trin 3.2.1. Hold røret på is. Tag bagbenene fra 15 ML-røret og overfør dem til silkepapir. Skær bagbenene lige under knæleddet for at fjerne skinnebenet. Dissekere lårbenet og skinnebenet fra de omkringliggende muskler, fjerne overskydende væv ved hjælp af en saks, og våd silkepapir. Skær knogleenderne med en saks for at eksponere den indvendige marvaksel. Skinnebenet og lårbenet i BM-ekstraktionsrøret (se præparatet i 3.2.9.1-3.2.9.218), med den bredeste ende i bunden. Skær en 200 μL pipettespids ved linjen lige over enden af spidsen og ved 100 μL-linjen. Placer den midterste del i den øverste, større del af spidsen, og læg den i et 1,5 mL mikrofugerør. Drej BM ekstraktionsrøret ved 800 × g i 1 min. Kassér knoglen, og gentag forsigtigt pelleten i 1 mL komplet medium for at fjerne eventuelle klynger. Celleaffjedringen filtreres gennem et 70 μm filter, der er placeret på toppen af et 15 mL rør. Vask BM-ekstraktionsrøret to gange med 1 mL komplet medium hver gang. Filtrer gennem et 70 μm filter, og volumenpuljes med resten af celleaffjedringen, der blev opnået i trin 3.2.11.BEMÆRK: Et enkelt 15 ML rør vil indeholde celler fra begge bagben af en mus. Centrifugeceller ved 400 × g i 10 min ved 4 °C. Kassér supernatanten, og brug cellepillen i PBS igen. Tæl cellerne med et Neubauer kammer ved hjælp af røde blodlegemer lysis buffer og 0,04% v / v trypan blå i PBS. 4. Farvning af milt-, LN- og BM-celler Del celleprøver, der skal farves, i 3 undergrupper: celleprøvertil kompensation , herunder BM-celler fra ubehandlede mus, der kun skal farves sammen med Hoechst 33342 (fremover benævnt Hoechst) og miltceller fra ubehandlede mus, der skal anvendes til at forberede en død/levende celleblanding til erstatning for døde cellefarvestoffer positiv kontrol med cellecyklusanalyse, bestående af en BM-prøve fra ubehandlede mus forsøgsprøver, der indeholder milt- og LN-prøver fra ubehandlede og vaccinerede mus.BEMÆRK: Sørg for, at der er nok milt- og LN-celler til analyse af et tilstrækkeligt antal gag-specifikke CD8 T-celler. Det er ofte nødvendigt at bruge poolede miltceller og poolede LN-celler fra 3 vaccinerede mus og plette to eller flere identiske prøver af poolede celler, der hver indeholder 3 × 106 celler. Flet identiske prøver ved trinnet af Hoechst farvning. Tilsvarende plet pooled milt celler og LN celler fra 3 ubehandlede mus, og fusionere identiske prøver i slutningen. Sæt en uplettet prøve af miltceller fra en ubehandlet mus, der skal bruges til instrument- og kompensationsopsætning. Forbered døde / levende celle mix for døde celle farvestof kompensation (denne blanding af celler vil blive farves kun med den døde celle farvestof). Opvarm et vandbad ved 65 °C. Tag en aliquot af miltceller (~ 3 × 106). Celleaffjedringen overføres til et mikrofugerør, læg den i vandbadet ved 65 °C i 5 min, og læg den derefter straks på is i 10 min. Bland de varmedraflivede celler med levende miltceller (~ 3 × 106) i et forhold på 1:1, og overfør halvdelen af blandingen til en 96 godt rund bundplade (~ 3 × 106 celler / brønd til den døde celle farvningskontrol). Døde cellefarvning af eksperimentelle prøver, positiv kontrol til cellecyklusanalyse og død/levende celleblanding Overfør milt, LN, BM-celler (3 × 106 celler/brønd) og den døde/levende celleblanding (punkt 4.2) til 96-brønd rundbundsplade i henhold til farvningsordningen (trin 4.1) og centrifuge ved 400 × g i 3 min ved 4 °C. Resuspend hver celle pellet i 50 μL af døde celle farvestof fortyndet i PBS, og genbruges ved pipetter op og ned 3 gange straks. Inkuberes i 30 min ved 4 °C, beskyttet mod lys. Vask celler 2 gange med farvningsbuffer; første gang med 200 μL og anden gang med 250 μL. For hver vask centrifuge pladen ved 400 × g i 3 min ved 4 °C. Kassér supernatanten, og brug cellepillen i 20 μL PBS igen. Membrancelle farvning med større histokompatibilitet kompleks (MHC)-peptid multimers og mAbs. Under hensyntagen til de nødvendige mængder i henhold til farvningsordningen (Flow cytometerindstillinger, tabel 1), skal følgende reagenser forberedes: Fortynd mAb 2,4 G2 i farvningsbufferen i henhold til den relevante fortynding (se materialetabel); for hver prøve, der skal farves, skal der anvendes 10 μL af denne fortynding.BEMÆRK: 2,4 G2 mAb blokerer ikke-antigenspecifik binding af immunoglobuliner til FüIII- og FcγII-receptorerne. Fortynd den H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-mærket tetramer (Tetr-gag) i farvningsbufferen for at opnå den relevante fortynding (se materialetabel); for hver prøve, der skal farves, skal der anvendes 20 μL af denne fortynding. Antistofblandingen forberedes ved at fortynde mAb’er i farvningsbufferen i henhold til den relevante fortynding (se materialetabel),der tidligere er blevet bestemt i titreringsforsøg. for hver prøve, der skal farves, skal du bruge 20 μL af denne antistofblanding.BEMÆRK: Her blev anti-CD3e peridinin klorofylprotein (PerCP-Cy5.5) (klon 145-2C11), anti-CD8a strålende ultraviolet (BUV805) (klon 53-6.7) og anti-CD62L phycoerythrin cyanine7 (PECy7) (klon MEL-14) brugt. Der tilsættes 10 μL af de tidligere fortyndede 2,4 G2 mAb (trin 4.4.1.1) og inkuberes i 10 min ved 4 °C, beskyttet mod lys. Der tilsættes 20 μL af den tidligere fortyndede Tetr-gag APC (trin 4.4.1.2) og 10 μL af H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) pentamer (pent-gag). Inkuberes i 15 min ved 4 °C, beskyttet mod lys. Der tilsættes 20 μL af den tidligere forberedte antistofblanding (trin 4.4.1.3) og inkuberes 15 min ved 4 °C, beskyttet mod lys.BEMÆRK: Derfor er det endelige volumen 80 μL pr. brønd (trin 4.3.5, trin 4.4.2 til 4.4.4). Vask celler med 200 μL farvningsbuffer. Centrifuge ved 400 × g i 5 min ved 4 °C. Cellpillen genbruges i 250 μL farvningsbuffer, og celleaffjedringen overføres til 5 mL-rør. Røret tilsættes 1 minut og centrifuge ved 400 × g i 5 min ved 4 °C. Tag aliquot af BM-celler (3 × 106 celler) (se listen over celleprøver, punkt 4.1), der skal bruges til at kompensere Fort. Røret tilsættes 1 minut og centrifuge 400 × g i 5 min ved 4 °C. 5. Fiksering/permeabilisering Forbered ny fiksering /permeabilisering buffer ved fortynding 1 del af fiksering / permeabilisering koncentrat med 3 dele af fiksering / permeabilisering fortynding fortyndingsstof, i henhold til producentens anvisninger. Kassér supernatanten, og pulshvirvlen prøverne for helt at opdele pelleten. Der tilsættes 1 mL af den frisklavede fikserings-/permeabiliseringsbuffer til hvert rør, herunder et rør med ikke-farvede miltceller (3 x 106, se listen over celleprøver, afsnit 4.1) og vortex. Inkuberes i 16 timer ved 4 °C.BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. 6. Intracellulær farvning Ki67 farvning Forbered frisk permeabilisering buffer 1x ved fortynding permeabilisering buffer 10x med destilleret vand, i henhold til producentens anvisninger. Før brug skal permeabiliseringsbufferen 1x filtreres gennem et 0,45 μm filter for at eliminere aggregater. Fortynd mAb Ki67 fluorescein isothiocyanat (FITC) (klon SolA15) i permeabiliseringsbuffer 1x (se Materialetabel), som tidligere fastlagt i titreringsforsøg (sidste volumen på 100 μL pr. prøve). Tilsæt 3 mL permeabiliseringsbuffer 1x til hvert rør og centrifuge ved 400 × g i 5 min ved stuetemperatur (RT). Supernatanten kasseres, og trin 6.1.3 gentages. Supernatanten kasseres, og cellepillen genudsluses i 100 μL af tidligere fortyndet mAb Ki67 FITC (trin 6.1.2). Inkuber i 30 minutter på RT, beskyttet mod lys. Vask cellerne 2 gange med 4 mL permeabiliseringsbuffer 1x. For hver vask centrifuge ved 400 × g i 5 min på RT. Brug cellepillen i PBS på en genbrug af cellepillen i PBS i betragtning af følgende mængder: 350 μL PBS for de prøver, der skal udtages direkte ved flowcytometeret; 250 μL PBS for de prøver, der skal inkuberes med Hoechst kort før flowcytometri (punkt 6.2). DNA-farvning Der tilsættes 250 μL på 4 μg/mL Hoechst i PBS til hver prøve (den endelige koncentration af Hoechst er 2 μg/mL).BEMÆRK: Hvis der blev udtaget to eller flere identiske prøver på 250 μL i PBS, smeltes de ad ved dette trin, og der tilsættes lige store mængder 4 μg/mL Hoechst-opløsning i PBS (den endelige koncentration af Hoechst er 2 μg/mL). Antallet af celler påvirker i høj grad DNA-farvningstrinnet. Brug det samme cellenummer i hvert eksempel. Vær opmærksom på, at selv et lidt reduceret celletal (f.eks. på grund af celletab i tidligere vasketrin) resulterer i højere Hoechst-binding til DNA og højere Hoechst-intensitet. Inkuber i 15 minutter på RT, beskyttet mod lys. Centrifuge prøverne ved 400 × g i 5 min på RT. Brug cellepillen igen i 350 μL AF PBS. 7. Udarbejdelse af erstatning perleprøver 5 μL af antistoffet fremstilles ved at fortynde mAb i farvningsbufferen korrekt.BEMÆRK: For hver fluorkrom-konjugeret mAb, der anvendes i forsøget, skal du forberede den tilsvarende kompensationsperleprøve. Vortex Negativ Kontrol og Anti-Rat / Hamster Ig,κ Comp Perler før brug. For hver prøve skal der indføres en dråbe (~20 μL) af negative kontrolkompendier og en dråbe Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads. 5 μL af det prædiluterede antistof (trin 7.1) til røret og pipet op og ned. Inkuberes i 15 min ved 4 °C, beskyttet mod lys. Vask prøver med 2 mL farvningsbuffer. Centrifuge ved 400 × g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten, og genbrug pelleten ved at tilsætte 500 μL PBS til hvert rør og vortex. 8. Instrument- og kompensationsopsætning og eksperimentel prøveopkøb ved flowcytometeret BEMÆRK: Se flowcytometerindstillinger (Tabel 2) for cytometerkonfigurationen. Generel opsætning af instrument og kompensation Åbn softwaren til eksempelopsamling (se Materialetabel), og opret et nyt eksperiment ved at klikke på Nyt eksperiment i afsnittet arbejdsområdebånd og vælge Nyt tomt eksperiment. Dobbeltklik på det oprettede eksperiment for at åbne det. I vinduet Cytometerindstillinger skal du klikke på Parametre og vælge alle de kanaler (f.eks. PE, APC osv.), der bruges i farvningspanelet, herunder PARAMETRENE Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC). Vælg lineær skala som en Hoechst-parameter ved at fjerne markeringen af logskalaen, og kontroller bredden (W) af spændingspulsen for FCS, SSC og Hoechst.BEMÆRK: Alle parametre vises som standard i logaritmisk (log) skala, bortset fra FSC og SSC, der er i lineær skala. Alle parametre analyseres af spændingspulsens område (A) og højde (H). Opret et prikplot med FSC-A på x-aksen og SSC-A på y-aksen i det globale regneark. Kør det ikke-farvede milteksempel ved at klikke på Hent data på anskaffelsesdashboardet. Angiv de relevante FSC- og SSC-indstillinger for at visualisere cellerne ved at ændre spændingsværdierne i sektionen Parametre, og opret en port for at markere alle de celler, der vises i punktet FSC-A/SSC-A-A-punkt ved at klikke på Polygon Gate på arbejdsområdeværktøjslinjen i det globale regneark. Vis de indhegnede celler i histogrammer med hver fluorescensparameter på x-aksen. Kør ureblede og fuldt farvede miltprøver for at justere fluorescensdetektoren (PMT) for at have en klar adskillelse mellem negative og positive signaler fra de farvede celler for hver fluorescensparameter. Hvis du vil udføre kompensationsopsætning, skal du klikke på Eksperiment på båndet i arbejdsområdet og vælge Opret kompensationskontrolelementerunder Kompensationsopsætning . Fjern markeringen Medtag ikke-farvet kontrolrør /Brønd, og klik på OK.BEMÆRK: Denne handling vil resultere i oprettelsen af en prøve med navnet Kompensationskontrolelementer og et normalt regneark, der indeholder flere ark svarende til hver valgt parameter. Kør en prøve af kompensationsperler (se afsnit 7); indstille de relevante FSC- og SSC-indstillinger for at visualisere perlerne ved at ændre spændingsværdierne og anskaffelsestærsklen på 5.000 på FSC-parametre i Cytometer-vinduet. Juster P1-porten på perlepopulationen, og kontroller, at de positive og negative toppe begge er synlige på x-aksen. Gentag denne handling for hvert eksempel på kompensationsperle, og registrer til sidst hver eksempelfil ved at klikke på Postdata på anskaffelsesdashboardet (registrer mindst 5.000 hændelser for hvert eksempel). For hver registreret perleprøve skal du indstille henholdsvis P2- og P3-portene på de positive og negative toppe. Der køres celleprøverne for at få erstatning (se trin 4.2 og 4.4.7 og afsnit 5 og 6). Rediger FSC- og SSC-spændingerne og tærskelværdien for at visualisere cellerne, justere P1-porten og til sidst registrere hver eksempelfil (registrere mindst 10.000 hændelser). Indstil P2- og P3-portene på henholdsvis de positive og negative toppe.BEMÆRK: For kompensation for Hoechst-kanalen skal du bruge G0/G1 som den negative top (P3) og G2/M som den positive (P2). Klik på Eksperiment i områdets båndsektion, og vælg Beregn kompensationi sektionen Kompensationsopsætning . Navngiv den oprettede kompensationsindstilling, link og gem den i det aktuelle eksperiment. Eksperimentel stikprøve erhvervelse Åbn et eksempel ved at klikke på Ny prøve på browserens værktøjslinje, og opret gatingstrategien i det globale regneark.BEMÆRK: Gating-strategien for erhvervelse af stikprøver svarer til den strategi for stikprøveanalyse, der er beskrevet i figur 3 og afsnit 9. Vis alle hændelsespopulationer i et histogrammer med CD3-A på x-aksen. Opret en intervalport for kun at markere CD3+ -cellerne. Vælg lagerport som Alle hændelser for LN-eksempler på købsdashboardetog enten Alle hændelser eller CD3+ celler til milteksempler. Kør de eksperimentelle prøver ved lav hastighed, og til sidst optage alle de filer, der sørger for at indsamle mindst 100-200 antigen-specifikke CD8 T-celler for hver prøve fra de vaccinerede mus.BEMÆRK: Filstørrelsen af eksperimentelle prøver er normalt stor (30-120 MB), især når hyppigheden af antigenspecifikke CD8 T-celler er lav. Derfor skal der indsamles et stort antal hændelser (> 1 × 106) for at optage mindst 100-200 antigenspecifikke CD8 T-celler. Store filer kan bremse den efterfølgende dataanalyseproces. Erhvervelsen af kun CD3+ celler i miltprøver (se trin 8.2.2 ovenfor) er nyttigt at holde filstørrelsen mindre. Kør og registrer den positive kontrol til cellecyklusanalyse, dvs. BM-prøve fra ubehandlede mus. 9. Dataanalyse Åbn softwaren (se Materialetabel), og opret forskellige grupper, der svarer til de forskellige organer, der skal analyseres, ved at klikke på Opret gruppe i afsnittet arbejdsområdebånd (dvs. opret gruppen “a-LN’er”; “b-milt”; “c-BM”).BEMÆRK: Nyoprettede grupper vises på gruppelisten, mens gruppen “Kompensation” automatisk genereres af softwaren. Åbn vinduet Rediger gruppe ved at dobbeltklikke på gruppenavnet, og kontroller, at de nyoprettede grupper synkroniseres. Hvis ikke, skal du markere funktionen Synkroniseret. Træk hver .fcs-fil i den tilsvarende gruppe. Opret gating-strategien, der starter med gruppen “a-LNs”. Dobbeltklik på den fuldt farvede prøve i gruppen for at åbne grafvinduet. x-og y-aksen er mærket som i fcs-filerne (se flowcytometerindstillinger, tabel 2). Vis de samlede hændelser, der er opnået for denne prøve, i et prikplot med DNA-A på x-aksen og DNA-W på y-aksen. Marker kun enkeltcellepopulationen ved at klikke på Rektangel i gatingværktøjet i diagramvinduet.BEMÆRK: Enkelte celler har DNA-A-værdier som følger: 2N (lav): mellem 2N og 4N (mellemliggende) eller lig med 4N (høj), mens DNA-W-værdier er identiske for dem alle (trin 1 i figur 3). Dobbeltklik i midten af den rektangulære port for at få vist enkelte celler i et prikplot med FSC-A-parameter på x-aksen og døde cellefarve på y-aksen. Marker kun den levende cellepopulation ved at klikke på Polygon i gatingværktøjssektionen i grafvinduet. Levende celler er negative for det døde cellefarvestof (trin 2 i figur 3). Dobbeltklik i midten af den polygonale port for at få vist cellerne i et prikplot med FSC-A-parameter på x-aksen og SSC-A-parameteren på y-aksen. Klik på Rektangel, og opret en “afslappet” port for at medtage alle de enkelte dynamiske celler igrafen 12 (trin 3 i figur 3). Dobbeltklik i midten af den “afslappede” port for at få vist cellerne i et prikplot med CD3 på x-aksen og CD8 på y-aksen. Marker CD3+CD8+ cellerne ved at klikke på Polygon (trin 4 i figur 3). Dobbeltklik i midten af CD3+CD8+ porten for at få vist cellerne i et prikplot med Tetr-gag på x-aksen og Pent-gag på y-aksen. Vælg de antigenspecifikke CD8 T-celler (positiv for både Tetr-gag og Pent-gag) ved at klikke på Polygon (trin 5 i figur 3). Dobbeltklik i midten af den gag-specifikke port for at få vist cellerne i et prikplot med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen (Figur 4). Marker cellerne i de forskellige cellecyklusfaser ved at klikke på Quad i gatingværktøjet i grafvinduet.BEMÆRK: Celle i G0 fase er Ki67neg-DNA lavceller (nederst til venstre kvadrant); celler i G1 er Ki67pos-DNA lav (øvre venstre kvadrant); celler i S-G2/M er Ki67pos-DNA mellemliggende/høje (øverst til højre kvadrant) (Figur 4). Kopier den gating strategi, der er oprettet i et eksempel til den tilsvarende gruppe for at anvende portene på alle gruppens prøver. Gentag trin 9.5 til 9.18 for “a-LN-gruppen”. Kontroller, at alle porte er passende for hver prøve af “b-milten” gruppen. Hvis du vil analysere cellecyklussen mellem BM-cellerne (positiv kontrol), skal du klikke i midten af den “afslappede” port for at vise cellerne i et prikplot med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Kontroller, at alle porte er passende for hver prøve af de 3 grupper (dvs. for celler fra milt, LN og BM).BEMÆRK: Enkeltcellet population gate (trin 9.7) og Quad gate for cellecyklus (trin 9.17) kan have forskellige gate koordinater i forskellige prøver, hovedsagelig på grund af de mulige små forskelle i Hoechst farveintensiteten mellem prøverne (punkt 6.2). Af denne grund kan det være nødvendigt at ændre enkeltcellepopulationsporten og Quad-portene til cellecyklus i hver prøve. Dette gøres på følgende måde: Dobbeltklik på gruppenavnet, og fjern synkroniseringen fra gruppeegenskaberne. Denne operation gør det muligt at ændre portene i en prøve uden at ændre de samme porte i alle de andre prøver af gruppen. Når du har fjernet synkroniseringen, skal du ændre portene, hvor det er nødvendigt. Hvis du vil visualisere de resultater, der opnås ved denne analyse, skal du klikke på Layouteditor i afsnittet på båndet i arbejdsområdet for at åbne den. Træk hver port i gatingstrategien i eksempelruden til layouteditoren, og placer plottet i overensstemmelse med rækkefølgen af gatingstrategien. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre diagramtypen ved at dobbeltklikke på det tilsvarende afbildning i layoutet og vælge den relevante type i vinduet Grafdefinition. Klik på gruppen og iterate af funktioner på layoutbåndet for at visualisere de opnåede resultater i hvert organ, og sammenligne forskellige prøver.