Möss var inhyst på Plaisant Animal Facility, och arbetet utfördes under det italienska hälsoministeriets tillståndsnummer 1065/2015-PR. Protokollet följde djurvårdsriktlinjerna i enlighet med nationell och internationell lagstiftning och policy (UE-direktiv 2010/63/UE; Italiens lagstiftningsdekret 26/2014). 1. Beredning av medium- och färgningslösning Förbered komplett medium: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin/streptomycin, 50 μM beta-mercaptoethanol och 10% volym/volym (v/v) av fetala nötkreatur serum (FBS) Förbered färgningsbuffert: Fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2+/Mg2+ (PBS) med 1% vikt/volym (w/v) bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM etylendiamintetraacetic syradisodiumsalt (EDTA) 2. Musbehandling Prime 7-8-veckor gamla, kvinnliga Balb/c möss genom intramuskulära (i.m.) injektion i quadriceps av humant immunbristvirus (HIV)-1-gag-expressing-schimpans adenoviral vektor (ChAd3-gag) med en dos av 107 viruspartiklar. Vid 1-4 månader efter priming, öka när mössen genom i.m. injektion av HIV-1-gag-expressing modifierad vaccinia Ankara virus (MVA-gag) med en dos av 106 plackbildande enheter. På dag 3 efter boost, offra de boostade mössen genom livmoderhalscancer förskjutning, och analysera dem parallellt med obehandlade möss. Skörda LN som dränerar quadriceps (iliaca, popliteal och inguinal) och mjälten från boostade och obehandlade möss. Samla dessutom BM från de två bakbenen från obehandlade möss och använd denna BM för flödescytometerinställningar och som positiv kontroll för cellcykelanalys (figur 2).OBS: Generera ChAd3-gag och MVA-gag vektorer som beskrivs tidigare12,15,16,17. 3. Isolering av dränerande LN-, mjälte- och BM-celler Isolering av mjälte- och LN-celler Placera 5 ml komplett medium i vart och ett av två 15 ml-rör och håll dem på is, redo för organ som ska samlas in. Offra en vuxen mus genom livmoderhalscancer förskjutning. Placera musen på ryggen och sterilisera hudytan med 70% v/v etanol. För att samla inguinal LNs, gör ett ~ 1 cm längsgående snitt på buken med sax och sträck snittet med tången. Visualisera inguinal LNs på hudens inre yta och skörda dem med tångarna. Placera de inguinala LN i ett av de två 15 ml-rören som beretts i steg 3.1.1. För att samla mjälten, gör ett peritonealsnitt med sax och ta bort mjälten. Efter att ha skurit den omgivande bindväven, placera mjälten i det andra 15 ml-röret som bereds i steg 3.1.1. För att samla iliaca LNs, flytta tarmarna åt sidan och visualisera iliaca LNs nära den sämre vena cava, och sedan samla dem med hjälp av tångarna. Placera iliaca-LN:erna i samma rör som innehåller de inguinala LN: erna.OBS: För att få tillräckligt med LN-celler för färgning (se avsnitt 4) är det ofta nödvändigt att poola popliteal, inguinal och iliaca LNs från en mus. Dessa LN tömmer alla quadricepsna (platsen för i.m. vaccination). Detta protokoll använder bara ett 15 ml-rör med poolade LNs. För att samla popliteal LNs, ta tag i bakbenens hud och dra försiktigt den nedåt för att avslöja musklerna. Sätt sedan in tången mellan musklerna under knäleden och samla in popliteal LNs. Placera popliteal LNs i samma rör som innehåller inguinal och iliaca LNs.OBS: Se anmärkning efter 3.1.7. Placera mjälten i en 70 μm cellsil i en 60 mm odlingsskål fylld med 5 ml komplett medium. Använd en 5 ml sprutkolv och mosa försiktigt organet tills det är fullständigt upplöst. Ta bort silen och överför cellfjädringen till ett rent 15 ml-rör. Tillsätt 5 ml komplett medium till odlingsfatet och tvätta försiktigt skålen och silen för att säkerställa att alla celler har återställts. Pool med resten av mjältecellsupphängningen i 15 ml-röret. För poolade inguinal- eller ilsca och popliteal-LN: er, förbered en enda cell suspension efter en liknande procedur som används i steg 3.1.9 till 3.1.11 för mjälten. Centrifugceller vid 400 × g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelletsen i PBS. Räkna cellerna med en Neubauer-kammare med hjälp av röd blodcelllysbuffert och 0,04% v/v trypan blå i PBS. Isolering av BM-celler Placera 5 ml komplett medium i ett 15 ml-rör och håll det på is, redo för insamling av bakben. Offra en vuxen mus genom livmoderhalscancer förskjutning. Sterilisera hudytan med 70% v/v etanol. Gör ett ~1 cm tvärgående snitt på ventrala huden med sax, ta tag i huden på båda sidor av snittet och dra försiktigt nedåt för att avslöja bakbenens muskler. För att eliminera huden från baksidan av bakbenen, hålla musen i en supin position, placera klämman under knäet och dra uppåt för att exponera musklerna. Skär benen vid de två extremiteterna på ett bakben: bäcken-/höftleden och fotleden. Överför båda bakbenen till 15 ml-röret som beretts i steg 3.2.1. Håll röret på is. Ta bakbenen från 15 ml-röret och överför dem till vävnadspapper. Skär bakbenen strax under knäleden för att ta bort skenbenet. Dissekera lårbenet och skenbenet från de omgivande musklerna, ta bort överflödig vävnad med sax och blöt vävnadspapperet. Skär benändarna med sax för att exponera det inre märgskaftet. För in skenbenet och lårbenet i BM-extraktionsröret (se beredningen i 3.2.9.1-3.2.9.218), med den bredaste änden längst ner. Kapa en pipettspets på 200 μL vid linjen strax ovanför spetsens ände och vid 100 μL-linjen. Placera den mellersta delen i den övre, större delen av spetsen och placera den i ett 1,5 ml mikrobränslerör. Snurra BM-extraktionsröret vid 800 × g i 1 min. Kassera benet och återanvänd pelleten kraftigt i 1 ml komplett medium för att ta bort eventuella kluster. Filtrera cellfjädringen genom ett 70 μm-filter placerat ovanpå ett 15 ml-rör. Tvätta BM-extraktionsröret två gånger med 1 ml komplett medium varje gång. Filtrera genom ett 70 μm-filter och slå samman volymen med resten av cellfjädringen som erhålls i steg 3.2.11.OBS: Ett enda 15 ml-rör kommer att innehålla celler från båda bakbenen på en mus. Centrifugceller vid 400 × g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i PBS. Räkna cellerna med en Neubauer-kammare med hjälp av röd blodcelllysbuffert och 0,04% v/v trypan blå i PBS. 4. Färgning av mjälte-, LN- och BM-celler Dela cellprover som skall färgas i tre undergrupper: cellprover mot ersättning, inklusive BM-celler från obehandlade möss som endast ska färgas med Hoechst 33342 (hädanefter kallad Hoechst) och mjälteceller från obehandlade möss som ska användas för att bereda en död/levande cellblandning för ersättning av döda celler. Positiv kontroll för cellcykelanalys, bestående av ett BM-prov från obehandlade möss. och experimentella prover som innehåller mjälte- och LN-prover från obehandlade och vaccinerade möss.OBS: Se till att det finns tillräckligt med mjälte- och LN-celler för analys av tillräckligt många gag-specifika CD8 T-celler. Det är ofta nödvändigt att använda poolade mjälteceller och poolade LN-celler från 3 vaccinerade möss och färga två eller flera identiska prover av poolade celler, var och en innehållande 3 × 106 celler. Sammanfoga identiska prover i steget av Hoechst färgning. På samma sätt, fläckade mjälteceller och LN-celler från 3 obehandlade möss, och slå samman identiska prover i slutet. Avsätt ett ouppnã¤rkat prov av mjälteceller från en obehandlad mus som ska användas för instrument- och kompensationsinställning. Förbered död/levande cellblandning för ersättning av döda celler (denna blandning av celler kommer endast att färgas med det döda cellfärgämnet). Värm ett vattenbad vid 65 °C. Ta en alikvot mjälteceller (~3 × 106). Överför cellfjädringen till ett mikrofugerör, placera den i vattenbadet vid 65 °C i 5 min och placera den omedelbart på is i 10 minuter. Blanda de värmedödade cellerna med levande mjälteceller (~3 × 106) i ett förhållande av 1:1 och överför hälften av blandningen till en 96 välrundad bottenplatta (~ 3 × 106 celler / brunn för den döda cellens färgningskontroll). Döda cellfärgning av experimentella prover, positiv kontroll för cellcykelanalys och blandning av döda/levande celler Överför mjälte, LN, BM-celler (3 × 106 celler/brunn) och den döda/levande cellblandningen (avsnitt 4.2) till 96-brunns rundbottenplatta, enligt färgningsschemat (steg 4.1), och centrifugera vid 400 × g i 3 min vid 4 °C. Återanvänd varje cellpellet i 50 μL dött cellfärg som späds ut i PBS och återanvänds genom pipettering upp och ner 3 gånger omedelbart. Inkubera i 30 min vid 4 °C, skyddad mot ljus. Tvätta celler 2 gånger med färgbuffert; första gången med 200 μL och andra gången med 250 μL. För varje tvättcentrifuger plattan vid 400 × g i 3 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 20 μL PBS. Membran cell färgning med stora histocompatibility complex (MHC)-peptid multimers och mAbs. Med beaktande av de nödvändiga volymerna enligt färgningsschemat (Flödescytometerinställningar, tabell 1), bered följande reagenser: Späd mAb 2.4G2 i färgbufferten enligt lämplig utspädning (se Tabell över material); Använd 10 μL av denna utspädning för varje prov.OBS: 2,4G2 mAb blockerar icke-antigenspecifik bindning av immunglobuliner till FcγII- och FcγII-receptorerna. Späd ut H-2k d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-märkt tetramer (Tetr-gag) i färgbufferten för att erhålla lämplig utspädning (se Tabell över material); Använd 20 μL av denna utspädning för varje prov. Förbered antikroppsblandningen genom att späda ut mAbs i färgbufferten enligt lämplig utspädning (se Materialtabellen)som tidigare har fastställts i titreringsexperiment. Använd 20 μL av denna antikroppsblandning för varje prov som ska färgas.OBS: Här användes anti-CD3e peridinin klorofyllprotein (PerCP-Cy5.5) (klon 145-2C11), anti-CD8a lysande ultraviolett (BUV805) (klon 53-6.7) och anti-CD62L fycoerythrin cyanin7 (PECy7) (klon MEL-14). Tillsätt 10 μL av den tidigare utspädda 2,4G2 mAb (steg 4.4.1.1) och inkubera i 10 min vid 4 °C, skyddad mot ljus. Tillsätt 20 μL av den tidigare utspädda Tetr-gag APC (steg 4.4.1.2) och 10 μL H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) pentamer (pent-gag). Inkubera i 15 min vid 4 °C, skyddad mot ljus. Tillsätt 20 μL av den tidigare beredda antikroppsblandningen (steg 4.4.1.3) och inkubera 15 min vid 4 °C, skyddad mot ljus.OBS: Därför är den slutliga volymen 80 μL per brunn (steg 4.3.5, steg 4.4.2 till 4.4.4). Tvätta cellerna med 200 μL färgbuffert. Centrifug vid 400 × g i 5 min vid 4 °C. Återsuspendera cellpelleten i 250 μL färgningsbuffert och överför cellupphängningen till 5 ml-rör. Tillsätt 1 ml färgbuffert i röret och centrifugera vid 400 × g i 5 min vid 4 °C. Ta alikvoten av BM-celler (3 × 106 celler) (se listan över cellprover, avsnitt 4.1) som ska användas för att kompensera Hoechst-kanalen (Hoechst 33342 är upphetsad av en ultraviolett laser (flödescytometerinställningar(tabell 2)) och överför cellupphängningen till ett 5 ml-rör. Tillsätt 1 ml färgbuffert i röret och centrifugera 400 × g i 5 min vid 4 °C. 5. Fixering/permeabilisering Förbered färsk fixerings-/permeabiliseringsbuffert genom att späda ut 1 del av fixerings-/permeabiliseringskoncentratet med 3 delar fixering/permeabiliseringsdluent, enligt tillverkarens instruktioner. Kassera supernatanten och pulsvirveln proverna för att helt disaggregera pelleten. Tillsätt 1 ml av den nyberedda fixerings-/permeabiliseringsbufferten till varje rör, inklusive ett rör med oförstådda mjälteceller (3 x 106, se en lista över cellprover, avsnitt 4.1) och virvel. Inkubera i 16 h vid 4 °C.PROTOKOLLET kan pausas här. 6. Intracellulär färgning Ki67 färgning Förbered färsk permeabiliseringsbuffert 1x genom att späda permeabiliseringsbuffert 10x med destillerat vatten, enligt tillverkarens instruktioner. Före användning måste permeabiliseringsbufferten 1x filtreras genom ett 0,45 μm-filter för att eliminera aggregat. Späd mAb Ki67 fluorescein isotiiocyanate (FITC) (klon SolA15) i permeabiliseringsbuffert 1x (se Tabell över material),som tidigare fastställts i titreringsexperiment (slutlig volym på 100 μL per prov). Tillsätt 3 ml permeabiliseringsbuffert 1x till varje rör och centrifugera vid 400 × g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och upprepa steg 6.1.3. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 100 μL tidigare utspädd mAb Ki67 FITC (steg 6.1.2). Inkubera i 30 min på RT, skyddad mot ljus. Tvätta celler 2 gånger med 4 ml permeabiliseringsbuffert 1x. För varje tvättcentrifuger vid 400 × g i 5 min vid RT. Återanvänd cellpelleten i PBS med hänsyn till följande volymer: 350 μL PBS för de prover som ska förvärvas direkt vid flödescytometern; 250 μL PBS för de prover som skall inkuberas med Hoechst strax före flödescytometri (avsnitt 6.2). DNA-färgning Tillsätt 250 μL 4 μg/ml Hoechst i PBS till varje prov (den slutliga koncentrationen av Hoechst är 2 μg/ml).OBS: Om två eller flera identiska prover på 250 μL i PBS bereddes, slå samman dem i detta steg och tillsätt lika stor volym på 4 μg/ml Hoechst-lösning i PBS (den slutliga koncentrationen av Hoechst är 2 μg/ml). Antalet celler påverkar i hög grad DNA-färgningssteget. Använd samma cellnummer i varje exempel. Tänk på att även ett något minskat cellnummer (t.ex. på grund av cellförlust i tidigare tvättsteg) resulterar i högre Hoechst-bindning till DNA och högre Hoechst-intensitet. Inkubera i 15 min på RT, skyddad mot ljus. Centrifugera proverna vid 400 × g i 5 minuter vid RT. Återsuspend cellpelleten i 350 μL PBS. 7. Beredning av prover av kompensationspärla Förbered 5 μL av antikroppen genom att späda ut mAb i färgbufferten på lämpligt sätt.OBS: För varje fluorokromkonjugerad mAb som används i experimentet, förbered motsvarande kompensationspärlaprov. Vortex negativ kontroll och anti-råtta/hamster Ig,κ Comp Pärlor före användning. För varje prov, introducera en droppe (~ 20 μL) av negative control compbeads och en droppe Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads. Tillsätt 5 μL av den prediluterade antikroppen (steg 7.1) till röret och rör upp och ner. Inkubera i 15 min vid 4 °C, skyddad mot ljus. Tvätta prover med 2 ml färgbuffert. Centrifug vid 400 × g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten genom att tillsätta 500 μL PBS till varje rör och virvel. 8. Instrument- och kompensationsinställning och experimentellt provförvärv vid flödescytometern OBS: Se inställningarna för flödescytometer(tabell 2) för cytometerkonfigurationen. Allmänt instrument och kompensationsinställning Öppna programvaran för exempelförvärv (se Tabell över material) och skapa ett nytt experiment genom att klicka på Nytt experiment i menyfliksområdet på arbetsytan och välja Nytt tomt experiment. Dubbelklicka på det skapade experimentet för att öppna det. I fönstret Cytometerinställningar klickar du på Parametrar och väljer alla kanaler (t.ex. PE, APC, etc.) som används i färgningspanelen, inklusive parametrarna Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC). Välj linjär skala som en Hoechst-parameter genom att avmarkera loggskalan och kontrollera bredden (W) på spänningspulsen för FCS, SSC och Hoechst.OBS: Alla parametrar visas som standard i logaritmisk skala (logg) med undantag för FSC och SSC som är i linjär skala. Alla parametrar analyseras av spänningspulsens område (A) och höjd (H). Skapa en prickdiagram med FSC-A på x-axeln och SSC-A på y-axeln i det globala kalkylbladet. Kör det ouppdehållna mjälteprovet genom att klicka på Hämta data på instrumentpanelen för förvärv. Ange lämpliga FSC- och SSC-inställningar för att visualisera cellerna genom att ändra spänningsvärdena i avsnittet Parametrar och skapa en grind för att markera alla celler som visas i punktdiagrammet FSC-A/SSC-A genom att klicka på PolygonPorten i verktygsfältet Globalt kalkylblad. Visa de inhägnade cellerna i histogrammen med varje fluorescensparameter på x-axeln. Kör osedda och helt färgade mjälteprover för att justera fluorescensdetektorn (PMT) för att ha en tydlig separation mellan negativa och positiva signaler från de färgade cellerna för varje fluorescensparameter. Om du vill utföra kompensationsinställningar klickar du på Experiment i menyfliksområdet på arbetsytan och väljer Skapa kompensationskontrollerunder Avsnittet Kompensationsinställningar . Avmarkera Inkludera ostadslöst kontrollrör/brunn och klicka på OK.OBS: Den här åtgärden resulterar i att ett prov med namnet Kompensationskontroller skapas och ett normalt kalkylblad som innehåller flera blad som motsvarar varje vald parameter. Kör ett prov av kompensationspärlor (se avsnitt 7); ställ in lämpliga FSC- och SSC-inställningar för att visualisera pärlorna genom att ändra spänningsvärdena och förvärvströskeln på 5 000 på FSC-parametrar i cytometerfönstret. Justera P1-porten på pärlpopulationen och kontrollera att de positiva och negativa topparna båda är synliga på x-axeln. Upprepa den här åtgärden för varje exempel på kompensationspärla och spela slutligen in varje exempelfil genom att klicka på Spela in data på instrumentpanelen för förvärv (registrera minst 5 000 händelser för varje exempel). För varje registrerat pärlprov, ställ P2- och P3-portarna på de positiva respektive negativa topparna. Kör cellproverna för kompensation (se steg 4.2 och 4.4.7 och avsnitten 5 och 6). Ändra FSC- och SSC-spänningarna och tröskelvärdet för att visualisera cellerna, justera P1-porten och slutligen spela in varje exempelfil (registrera minst 10 000 händelser). Ställ P2- och P3-portarna på de positiva respektive negativa topparna.OBS: För kompensation av Hoechst-kanalen, använd G0/G1 som negativ topp (P3) och G2/M som den positiva (P2). Klicka på Experiment i menyfliksområdet för arbetsytan och välj Beräkna kompensationi avsnittet Kompensation . Namnge den skapade kompensationsinställningen, länken och spara den i det aktuella experimentet. Experimentellt provförvärv Öppna ett prov genom att klicka på Nytt exemplar i webbläsarens verktygsfält och skapa gatingstrategin i det globala kalkylbladet.OBS: Gitterstrategin för provförvärv liknar den för urvalsanalys som beskrivs i figur 3 och avsnitt 9. Visa alla händelser i ett histogram med CD3-A på x-axeln. Skapa en intervallport för att bara markera CD3+ -cellerna. På Hämtningsinstrumentpanelenväljer du lagringsporten som Alla händelser för LN-exempel och antingen Alla händelser eller CD3+ celler för mjälteexempel. Kör de experimentella proverna med låg hastighet och registrera slutligen alla filer och se till att samla in minst 100-200 antigenspecifika CD8 T-celler för varje prov från de vaccinerade mössen.OBS: Filstorleken på experimentella prover är vanligtvis stor (30-120 MB), särskilt när frekvensen av antigenspecifika CD8 T-celler är låg. Därför måste ett stort antal händelser (> 1 × 106) samlas in för att registrera minst 100-200 antigenspecifika CD8 T-celler. Stora filer kan sakta ner den efterföljande dataanalysprocessen. Det är bra att endast ta bort CD3+ celler i mjälteprover (se steg 8.2.2 ovan) för att hålla filstorleken mindre. Kör och registrera den positiva kontrollen för cellcykelanalys, dvs. BM-prov från obehandlade möss. 9. Dataanalys Öppna programvaran (se Tabell över material) och skapa olika grupper som motsvarar de olika organ som ska analyseras genom att klicka på Skapa grupp i avsnittet arbetsytans menyfliksområde (dvs. skapa grupp “a-LNs”; “b-mjälte”. “c-BM”).NYskapade grupper visas i grupplistan, medan gruppen “Kompensation” genereras automatiskt av programvaran. Öppna fönstret Ändra grupp genom att dubbelklicka på gruppnamnet och kontrollera att de nyskapade grupperna är synkroniserade. Om inte, infoga en bock på funktionen Synkroniserad. Dra varje FCS-fil i motsvarande grupp. Skapa gating-strategin som börjar med gruppen “a-LNs”. Dubbelklicka på det helt färgade exemplet i gruppen för att öppna diagramfönstret; x- och y-axeln är märkta som i FCS-filerna (se inställningar för flödescytometer, tabell 2). Visa de totala händelser som förvärvats för detta prov i ett prickdiagram med DNA-A på x-axeln och DNA-W på y-axeln. Markera bara encellspopulationen genom att klicka på Rektangel i avsnittet gatingverktyg i diagramfönstret.OBS: Enstaka celler har DNA-A-värden enligt följande: 2N (låg): mellan 2N och 4N (mellanliggande), eller lika med 4N (hög), medan DNA-W-värden är identiska för dem alla (steg 1 i figur 3). Dubbelklicka i mitten av den rektangulära porten om du vill visa enstaka celler i ett prickdiagram med FSC-A-parametern på x-axeln och färgämnet för döda celler på y-axeln. Markera bara den levande cellpopulationen genom att klicka på Polygon i avsnittet gatingverktyg i diagramfönstret. Levande celler är negativa för det döda cellfärgämnet (steg 2 i figur 3). Dubbelklicka i mitten av polygonporten om du vill visa cellerna i ett prickdiagram med FSC-A-parametern på parametern x-axis och SSC-A på y-axeln. Klicka på Rectangleoch skapa en “avslappnad” grind för att inkludera alla levande celler i det diagrammet12 (steg 3 i figur 3). Dubbelklicka i mitten av den “avslappnade” grinden för att visa cellerna i ett prickdiagram med CD3 på x-axeln och CD8 på y-axeln. Välj cellerna CD3+CD8+ genom att klicka på Polygon (steg 4 i bild 3). Dubbelklicka i mitten av CD3+CD8+ grinden för att visa cellerna i ett prickdiagram med Tetr-gag på x-axeln och Pent-gag på y-axeln. Välj de antigenspecifika CD8 T-cellerna (positiva för både Tetr-gag och Pent-gag) genom att klicka på Polygon (steg 5 i figur 3). Dubbelklicka i mitten av den munkavlespecifika porten för att visa cellerna i ett punktdiagram med DNA-A på x-axeln och Ki67 på y-axeln (bild 4). Markera cellerna i de olika cellcykelfaserna genom att klicka på Quad i avsnittet gatingverktyg i diagramfönstret.OBS: Cell i G0-fasen är Ki67neg-DNA-låga celler (nedre vänstra kvadranten); celler i G1 är Ki67pos-DNA låg (övre vänstra kvadrant); celler i S-G2/M är Ki67pos-DNA mellanliggande/hög (övre högra kvadranten) (figur 4). Kopiera gating-strategin som skapats i ett exempel till motsvarande grupp för att tillämpa portarna på alla exempel i gruppen. Upprepa steg 9.5 till 9.18 för “a-LN-gruppen”. Kontrollera att alla grindar är lämpliga för varje prov i gruppen “b-mjälte”. För att analysera cellcykeln bland BM-cellerna (positiv kontroll), klicka i mitten av den “avslappnade” porten för att visa cellerna i ett punktdiagram med DNA-A på x-axeln och Ki67 på y-axeln. Kontrollera att alla grindar är lämpliga för varje prov i de tre grupperna (dvs. för celler från mjälte, LN och BM).OBS: Encellspopulationsport (steg 9.7) och Quad gate för cellcykel (steg 9.17) kan ha olika grindkoordinater i olika prover, främst på grund av de möjliga små skillnaderna i Hoechst-färgintensiteten mellan proverna (avsnitt 6.2). Därför kan det vara nödvändigt att ändra porten för encellspopulation och Quad-portarna för cellcykel i varje prov. Detta görs på följande sätt: dubbelklicka på gruppnamnet och ta bort synkroniseringen från gruppegenskaperna. Den här åtgärden gör det möjligt att ändra portarna i ett exempel utan att ändra samma portar i alla andra exempel i gruppen. Efter synkroniseringsborttagning, ändra grindarna vid behov. Om du vill visualisera resultaten som erhålls genom den här analysen klickar du på Layoutredigeraren i menyfliksområdet för arbetsytan för att öppna den. Dra varje grind i gatingstrategin i exempelrutan till layoutredigeraren och placera tomterna enligt sekvensen i gatingstrategin. Om det behövs ändrar du diagramtypen genom att dubbelklicka på motsvarande diagram i layouten och välja lämplig typ i fönstret Diagramdefinition. Klicka på gruppen och iterera efter funktioner i layoutbandet för att visualisera resultaten som erhålls i varje organ och jämföra olika prover.