Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En DNA/Ki67-baserad flödescytometrianalys för cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler hos vaccinerade möss

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61867
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 4, 5, 5, 2,6, 1
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 5Reithera Srl, 6IRCCS, Neuromed
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Klonisk expansion är en viktig egenskap hos antigenspecifika T-cellssvar. Cellcykeln av antigen-svarande T-celler har dock dåligt undersökts, delvis på grund av tekniska begränsningar. Vi beskriver en flöde cytometric metod för att analysera clonally expandera antigen-specifika CD8 T celler i mjälte och lymfkörtlar av vaccinerade möss.

Abstract

Cellcykeln av antigenspecifika T-celler in vivo har undersökts med hjälp av några metoder, som alla har vissa begränsningar. Bromodeoxyuridin (BrdU) markerar celler som är i eller nyligen avslutade S-fas, och karboxoxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) upptäcker dotterceller efter delning. Dessa färgämnen tillåter dock inte identifiering av cellcykelfasen vid tidpunkten för analysen. Ett alternativt tillvägagångssätt är att utnyttja Ki67, en markör som uttrycks starkt av celler i alla faser av cellcykeln utom den quiescent fas G0. Tyvärr tillåter Ki67 inte ytterligare differentiering eftersom det inte separerar celler i S-fas som är engagerade i mitos från de i G1 som kan förbli i denna fas, fortsätt till cykling eller flytta in i G0.

Här beskriver vi en flöde cytometrisk metod för att fånga en "ögonblicksbild" av T-celler i olika cellcykel faser i musen sekundära lymfoida organ. Metoden kombinerar Ki67 och DNA-färgning med större histokompatibilitetskomplex (MHC)-peptid-multimerfärgning och en innovativ gatingstrategi, vilket gör det möjligt för oss att framgångsrikt skilja mellan antigenspecifika CD8 T-celler i G0, i G1 och i S-G2/ M faser av cellcykeln i mjälten och dränera lymfkörtlarna hos möss efter vaccination med virusvektorer som bär modellantigenskämt av humant immunbristvirus (HIV)-1.

Kritiska steg i metoden var valet av DNA-färgämnet och gatingstrategin för att öka analyskänsligheten och inkludera högaktiverade/prolifererande antigenspecifika T-celler som skulle ha missats av nuvarande analyskriterier. DNA-färgämnet, Hoechst 33342, gjorde det möjligt för oss att få en högkvalitativ diskriminering av G0/ G1 och G2/ M DNA-toppar, samtidigt som membran och intracellulär färgning bevaras. Metoden har stor potential att öka kunskapen om T-cells respons in vivo och förbättra immunoövervakningsanalysen.

Introduction

Naiva T-celler genomgår klonisk expansion och differentiering vid antigenpriming. Differentierade T-celler uppvisar effektorfunktioner som är väsentliga för antigenfrigång och för underhåll av antigenspecifikt minne, vilket är nyckeln till långvarigt skydd. Under de första stegen i det primära svaret är naiv T-cellinteraktion med antigenpresenterande celler (APCs) inom specialiserade nischer i lymfoida organ avgörande för att inducera den enorma T-cellsproliferation som kännetecknar klonexpansionsfas1,2,3. T-cell-APC-interaktionen regleras fint av koncentration och persistens av antigen, samstimulerande signaler och lösliga faktorer (cytokiner och kemokner) som påverkar kvantiteten och kvaliteten på T-cellsklonalaavkomman 4,5,6,7.

Trots intensiva studier av T-cells klonurvalet expansion, är det fortfarande inte känt om antigen-primed T-celler slutföra hela sin cellcykel på platsen för antigen erkännande, eller om de migrerar till andra organ under cell cykel progression. Denna brist på kunskap beror på egenskaperna hos tillgängliga verktyg för cellcykelanalys. Dessa inkluderar monoklonala antikroppar (mAbs) som är specifika för kärnmarkören Ki67 och cellfärgämnen som antingen identifierar celler som har genomgått S-fasen av cellcykeln (t.ex. Bromodeoxyuridin (BrdU)) eller diskriminerar mellan dotterceller och deras förfäder (t.ex. karboxoxyfluoresceinsuccinimidyl ester (CFSE)).

Cellmärkningsfärgämnen, såsom CFSE och BrdU, tillåter dock inte bestämning av om celler som finns i ett visst organ förökade sig lokalt eller snarare migrerade till denna plats efter division8,9. Dessutom kan det intranukleära proteinet, Ki67, endast skilja celler i G0 (Ki67-negativa celler) från dem i någon annan cellcykelfas (Ki67-positiva celler). Således skiljer Ki67-analysen inte celler i aktiv spridning (dvs. i S, G2eller M) från dem i G1, som antingen snabbt kan utvecklas till delning eller stanna under långa perioder i G1 eller återgå till quiescence10,11.

Här beskriver vi en ny flödescytometrisk metod för cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler12 från mjälte- och lymfkörtlarna (LN) hos vaccinerade möss (figur 1). Metoden utnyttjar en kombination av Ki67 och DNA-färgning som tidigare användes för att analysera cellcykeln för musbensmärg (BM) hematopoetiska celler13,14. Här tillämpade vi framgångsrikt Ki67 plus DNA-färgning, tillsammans med den nyligen publicerade innovativa gatingstrategin12, på analysen av CD8 T-cellklonal expansion. Vi kunde tydligt skilja mellan antigenspecifika CD8 T-celler i G0, i G1, och i S-G2/ M faser i mjälten och dränera LNs av vaccinerade möss.

Protocol

Möss var inhyst på Plaisant Animal Facility, och arbetet utfördes under det italienska hälsoministeriets tillståndsnummer 1065/2015-PR. Protokollet följde djurvårdsriktlinjerna i enlighet med nationell och internationell lagstiftning och policy (UE-direktiv 2010/63/UE; Italiens lagstiftningsdekret 26/2014).

1. Beredning av medium- och färgningslösning

  1. Förbered komplett medium: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin/streptomycin, 50 μM beta-mercaptoethanol och 10% volym/volym (v/v) av fetala nötkreatur serum (FBS)
  2. Förbered färgningsbuffert: Fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2+/Mg2+ (PBS) med 1% vikt/volym (w/v) bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM etylendiamintetraacetic syradisodiumsalt (EDTA)

2. Musbehandling

  1. Prime 7-8-veckor gamla, kvinnliga Balb/c möss genom intramuskulära (i.m.) injektion i quadriceps av humant immunbristvirus (HIV)-1-gag-expressing-schimpans adenoviral vektor (ChAd3-gag) med en dos av 107 viruspartiklar.
  2. Vid 1-4 månader efter priming, öka när mössen genom i.m. injektion av HIV-1-gag-expressing modifierad vaccinia Ankara virus (MVA-gag) med en dos av 106 plackbildande enheter.
  3. På dag 3 efter boost, offra de boostade mössen genom livmoderhalscancer förskjutning, och analysera dem parallellt med obehandlade möss.
  4. Skörda LN som dränerar quadriceps (iliaca, popliteal och inguinal) och mjälten från boostade och obehandlade möss. Samla dessutom BM från de två bakbenen från obehandlade möss och använd denna BM för flödescytometerinställningar och som positiv kontroll för cellcykelanalys (figur 2).
    OBS: Generera ChAd3-gag och MVA-gag vektorer som beskrivs tidigare12,15,16,17.

3. Isolering av dränerande LN-, mjälte- och BM-celler

  1. Isolering av mjälte- och LN-celler
    1. Placera 5 ml komplett medium i vart och ett av två 15 ml-rör och håll dem på is, redo för organ som ska samlas in.
    2. Offra en vuxen mus genom livmoderhalscancer förskjutning.
    3. Placera musen på ryggen och sterilisera hudytan med 70% v/v etanol.
    4. För att samla inguinal LNs, gör ett ~ 1 cm längsgående snitt på buken med sax och sträck snittet med tången.
    5. Visualisera inguinal LNs på hudens inre yta och skörda dem med tångarna. Placera de inguinala LN i ett av de två 15 ml-rören som beretts i steg 3.1.1.
    6. För att samla mjälten, gör ett peritonealsnitt med sax och ta bort mjälten. Efter att ha skurit den omgivande bindväven, placera mjälten i det andra 15 ml-röret som bereds i steg 3.1.1.
    7. För att samla iliaca LNs, flytta tarmarna åt sidan och visualisera iliaca LNs nära den sämre vena cava, och sedan samla dem med hjälp av tångarna. Placera iliaca-LN:erna i samma rör som innehåller de inguinala LN: erna.
      OBS: För att få tillräckligt med LN-celler för färgning (se avsnitt 4) är det ofta nödvändigt att poola popliteal, inguinal och iliaca LNs från en mus. Dessa LN tömmer alla quadricepsna (platsen för i.m. vaccination). Detta protokoll använder bara ett 15 ml-rör med poolade LNs.
    8. För att samla popliteal LNs, ta tag i bakbenens hud och dra försiktigt den nedåt för att avslöja musklerna. Sätt sedan in tången mellan musklerna under knäleden och samla in popliteal LNs. Placera popliteal LNs i samma rör som innehåller inguinal och iliaca LNs.
      OBS: Se anmärkning efter 3.1.7.
    9. Placera mjälten i en 70 μm cellsil i en 60 mm odlingsskål fylld med 5 ml komplett medium. Använd en 5 ml sprutkolv och mosa försiktigt organet tills det är fullständigt upplöst.
    10. Ta bort silen och överför cellfjädringen till ett rent 15 ml-rör.
    11. Tillsätt 5 ml komplett medium till odlingsfatet och tvätta försiktigt skålen och silen för att säkerställa att alla celler har återställts. Pool med resten av mjältecellsupphängningen i 15 ml-röret.
    12. För poolade inguinal- eller ilsca och popliteal-LN: er, förbered en enda cell suspension efter en liknande procedur som används i steg 3.1.9 till 3.1.11 för mjälten.
    13. Centrifugceller vid 400 × g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelletsen i PBS.
    14. Räkna cellerna med en Neubauer-kammare med hjälp av röd blodcelllysbuffert och 0,04% v/v trypan blå i PBS.
  2. Isolering av BM-celler
    1. Placera 5 ml komplett medium i ett 15 ml-rör och håll det på is, redo för insamling av bakben.
    2. Offra en vuxen mus genom livmoderhalscancer förskjutning.
    3. Sterilisera hudytan med 70% v/v etanol.
    4. Gör ett ~1 cm tvärgående snitt på ventrala huden med sax, ta tag i huden på båda sidor av snittet och dra försiktigt nedåt för att avslöja bakbenens muskler.
    5. För att eliminera huden från baksidan av bakbenen, hålla musen i en supin position, placera klämman under knäet och dra uppåt för att exponera musklerna.
    6. Skär benen vid de två extremiteterna på ett bakben: bäcken-/höftleden och fotleden.
    7. Överför båda bakbenen till 15 ml-röret som beretts i steg 3.2.1. Håll röret på is.
    8. Ta bakbenen från 15 ml-röret och överför dem till vävnadspapper. Skär bakbenen strax under knäleden för att ta bort skenbenet. Dissekera lårbenet och skenbenet från de omgivande musklerna, ta bort överflödig vävnad med sax och blöt vävnadspapperet.
    9. Skär benändarna med sax för att exponera det inre märgskaftet. För in skenbenet och lårbenet i BM-extraktionsröret (se beredningen i 3.2.9.1-3.2.9.218), med den bredaste änden längst ner.
      1. Kapa en pipettspets på 200 μL vid linjen strax ovanför spetsens ände och vid 100 μL-linjen.
      2. Placera den mellersta delen i den övre, större delen av spetsen och placera den i ett 1,5 ml mikrobränslerör.
    10. Snurra BM-extraktionsröret vid 800 × g i 1 min.
    11. Kassera benet och återanvänd pelleten kraftigt i 1 ml komplett medium för att ta bort eventuella kluster. Filtrera cellfjädringen genom ett 70 μm-filter placerat ovanpå ett 15 ml-rör.
    12. Tvätta BM-extraktionsröret två gånger med 1 ml komplett medium varje gång. Filtrera genom ett 70 μm-filter och slå samman volymen med resten av cellfjädringen som erhålls i steg 3.2.11.
      OBS: Ett enda 15 ml-rör kommer att innehålla celler från båda bakbenen på en mus.
    13. Centrifugceller vid 400 × g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i PBS.
    14. Räkna cellerna med en Neubauer-kammare med hjälp av röd blodcelllysbuffert och 0,04% v/v trypan blå i PBS.

4. Färgning av mjälte-, LN- och BM-celler

  1. Dela cellprover som skall färgas i tre undergrupper: cellprover mot ersättning, inklusive BM-celler från obehandlade möss som endast ska färgas med Hoechst 33342 (hädanefter kallad Hoechst) och mjälteceller från obehandlade möss som ska användas för att bereda en död/levande cellblandning för ersättning av döda celler. Positiv kontroll för cellcykelanalys, bestående av ett BM-prov från obehandlade möss. och experimentella prover som innehåller mjälte- och LN-prover från obehandlade och vaccinerade möss.
    OBS: Se till att det finns tillräckligt med mjälte- och LN-celler för analys av tillräckligt många gag-specifika CD8 T-celler. Det är ofta nödvändigt att använda poolade mjälteceller och poolade LN-celler från 3 vaccinerade möss och färga två eller flera identiska prover av poolade celler, var och en innehållande 3 × 106 celler. Sammanfoga identiska prover i steget av Hoechst färgning. På samma sätt, fläckade mjälteceller och LN-celler från 3 obehandlade möss, och slå samman identiska prover i slutet. Avsätt ett ouppnã¤rkat prov av mjälteceller från en obehandlad mus som ska användas för instrument- och kompensationsinställning.
  2. Förbered död/levande cellblandning för ersättning av döda celler (denna blandning av celler kommer endast att färgas med det döda cellfärgämnet).
    1. Värm ett vattenbad vid 65 °C.
    2. Ta en alikvot mjälteceller (~3 × 106).
    3. Överför cellfjädringen till ett mikrofugerör, placera den i vattenbadet vid 65 °C i 5 min och placera den omedelbart på is i 10 minuter.
    4. Blanda de värmedödade cellerna med levande mjälteceller (~3 × 106) i ett förhållande av 1:1 och överför hälften av blandningen till en 96 välrundad bottenplatta (~ 3 × 106 celler / brunn för den döda cellens färgningskontroll).
  3. Döda cellfärgning av experimentella prover, positiv kontroll för cellcykelanalys och blandning av döda/levande celler
    1. Överför mjälte, LN, BM-celler (3 × 106 celler/brunn) och den döda/levande cellblandningen (avsnitt 4.2) till 96-brunns rundbottenplatta, enligt färgningsschemat (steg 4.1), och centrifugera vid 400 × g i 3 min vid 4 °C.
    2. Återanvänd varje cellpellet i 50 μL dött cellfärg som späds ut i PBS och återanvänds genom pipettering upp och ner 3 gånger omedelbart.
    3. Inkubera i 30 min vid 4 °C, skyddad mot ljus.
    4. Tvätta celler 2 gånger med färgbuffert; första gången med 200 μL och andra gången med 250 μL. För varje tvättcentrifuger plattan vid 400 × g i 3 min vid 4 °C.
    5. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 20 μL PBS.
  4. Membran cell färgning med stora histocompatibility complex (MHC)-peptid multimers och mAbs.
    1. Med beaktande av de nödvändiga volymerna enligt färgningsschemat (Flödescytometerinställningar, tabell 1), bered följande reagenser:
      1. Späd mAb 2.4G2 i färgbufferten enligt lämplig utspädning (se Tabell över material); Använd 10 μL av denna utspädning för varje prov.
        OBS: 2,4G2 mAb blockerar icke-antigenspecifik bindning av immunglobuliner till FcγII- och FcγII-receptorerna.
      2. Späd ut H-2k d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-märkt tetramer (Tetr-gag) i färgbufferten för att erhålla lämplig utspädning (se Tabell över material); Använd 20 μL av denna utspädning för varje prov.
      3. Förbered antikroppsblandningen genom att späda ut mAbs i färgbufferten enligt lämplig utspädning (se Materialtabellen)som tidigare har fastställts i titreringsexperiment. Använd 20 μL av denna antikroppsblandning för varje prov som ska färgas.
        OBS: Här användes anti-CD3e peridinin klorofyllprotein (PerCP-Cy5.5) (klon 145-2C11), anti-CD8a lysande ultraviolett (BUV805) (klon 53-6.7) och anti-CD62L fycoerythrin cyanin7 (PECy7) (klon MEL-14).
    2. Tillsätt 10 μL av den tidigare utspädda 2,4G2 mAb (steg 4.4.1.1) och inkubera i 10 min vid 4 °C, skyddad mot ljus.
    3. Tillsätt 20 μL av den tidigare utspädda Tetr-gag APC (steg 4.4.1.2) och 10 μL H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) pentamer (pent-gag). Inkubera i 15 min vid 4 °C, skyddad mot ljus.
    4. Tillsätt 20 μL av den tidigare beredda antikroppsblandningen (steg 4.4.1.3) och inkubera 15 min vid 4 °C, skyddad mot ljus.
      OBS: Därför är den slutliga volymen 80 μL per brunn (steg 4.3.5, steg 4.4.2 till 4.4.4).
    5. Tvätta cellerna med 200 μL färgbuffert. Centrifug vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.
    6. Återsuspendera cellpelleten i 250 μL färgningsbuffert och överför cellupphängningen till 5 ml-rör. Tillsätt 1 ml färgbuffert i röret och centrifugera vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.
    7. Ta alikvoten av BM-celler (3 × 106 celler) (se listan över cellprover, avsnitt 4.1) som ska användas för att kompensera Hoechst-kanalen (Hoechst 33342 är upphetsad av en ultraviolett laser (flödescytometerinställningar(tabell 2)) och överför cellupphängningen till ett 5 ml-rör. Tillsätt 1 ml färgbuffert i röret och centrifugera 400 × g i 5 min vid 4 °C.

5. Fixering/permeabilisering

  1. Förbered färsk fixerings-/permeabiliseringsbuffert genom att späda ut 1 del av fixerings-/permeabiliseringskoncentratet med 3 delar fixering/permeabiliseringsdluent, enligt tillverkarens instruktioner.
  2. Kassera supernatanten och pulsvirveln proverna för att helt disaggregera pelleten.
  3. Tillsätt 1 ml av den nyberedda fixerings-/permeabiliseringsbufferten till varje rör, inklusive ett rör med oförstådda mjälteceller (3 x 106, se en lista över cellprover, avsnitt 4.1) och virvel.
  4. Inkubera i 16 h vid 4 °C.
    PROTOKOLLET kan pausas här.

6. Intracellulär färgning

  1. Ki67 färgning
    1. Förbered färsk permeabiliseringsbuffert 1x genom att späda permeabiliseringsbuffert 10x med destillerat vatten, enligt tillverkarens instruktioner. Före användning måste permeabiliseringsbufferten 1x filtreras genom ett 0,45 μm-filter för att eliminera aggregat.
    2. Späd mAb Ki67 fluorescein isotiiocyanate (FITC) (klon SolA15) i permeabiliseringsbuffert 1x (se Tabell över material),som tidigare fastställts i titreringsexperiment (slutlig volym på 100 μL per prov).
    3. Tillsätt 3 ml permeabiliseringsbuffert 1x till varje rör och centrifugera vid 400 × g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
    4. Kassera supernatanten och upprepa steg 6.1.3.
    5. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 100 μL tidigare utspädd mAb Ki67 FITC (steg 6.1.2).
    6. Inkubera i 30 min på RT, skyddad mot ljus.
    7. Tvätta celler 2 gånger med 4 ml permeabiliseringsbuffert 1x. För varje tvättcentrifuger vid 400 × g i 5 min vid RT.
    8. Återanvänd cellpelleten i PBS med hänsyn till följande volymer: 350 μL PBS för de prover som ska förvärvas direkt vid flödescytometern; 250 μL PBS för de prover som skall inkuberas med Hoechst strax före flödescytometri (avsnitt 6.2).
  2. DNA-färgning
    1. Tillsätt 250 μL 4 μg/ml Hoechst i PBS till varje prov (den slutliga koncentrationen av Hoechst är 2 μg/ml).
      OBS: Om två eller flera identiska prover på 250 μL i PBS bereddes, slå samman dem i detta steg och tillsätt lika stor volym på 4 μg/ml Hoechst-lösning i PBS (den slutliga koncentrationen av Hoechst är 2 μg/ml). Antalet celler påverkar i hög grad DNA-färgningssteget. Använd samma cellnummer i varje exempel. Tänk på att även ett något minskat cellnummer (t.ex. på grund av cellförlust i tidigare tvättsteg) resulterar i högre Hoechst-bindning till DNA och högre Hoechst-intensitet.
    2. Inkubera i 15 min på RT, skyddad mot ljus.
    3. Centrifugera proverna vid 400 × g i 5 minuter vid RT.
    4. Återsuspend cellpelleten i 350 μL PBS.

7. Beredning av prover av kompensationspärla

  1. Förbered 5 μL av antikroppen genom att späda ut mAb i färgbufferten på lämpligt sätt.
    OBS: För varje fluorokromkonjugerad mAb som används i experimentet, förbered motsvarande kompensationspärlaprov.
  2. Vortex negativ kontroll och anti-råtta/hamster Ig,κ Comp Pärlor före användning.
  3. För varje prov, introducera en droppe (~ 20 μL) av negative control compbeads och en droppe Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads.
  4. Tillsätt 5 μL av den prediluterade antikroppen (steg 7.1) till röret och rör upp och ner.
  5. Inkubera i 15 min vid 4 °C, skyddad mot ljus.
  6. Tvätta prover med 2 ml färgbuffert. Centrifug vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.
  7. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten genom att tillsätta 500 μL PBS till varje rör och virvel.

8. Instrument- och kompensationsinställning och experimentellt provförvärv vid flödescytometern

OBS: Se inställningarna för flödescytometer(tabell 2) för cytometerkonfigurationen.

  1. Allmänt instrument och kompensationsinställning
    1. Öppna programvaran för exempelförvärv (se Tabell över material) och skapa ett nytt experiment genom att klicka på Nytt experiment i menyfliksområdet på arbetsytan och välja Nytt tomt experiment.
    2. Dubbelklicka på det skapade experimentet för att öppna det.
    3. I fönstret Cytometerinställningar klickar du på Parametrar och väljer alla kanaler (t.ex. PE, APC, etc.) som används i färgningspanelen, inklusive parametrarna Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC).
    4. Välj linjär skala som en Hoechst-parameter genom att avmarkera loggskalan och kontrollera bredden (W) på spänningspulsen för FCS, SSC och Hoechst.
      OBS: Alla parametrar visas som standard i logaritmisk skala (logg) med undantag för FSC och SSC som är i linjär skala. Alla parametrar analyseras av spänningspulsens område (A) och höjd (H).
    5. Skapa en prickdiagram med FSC-A på x-axeln och SSC-A på y-axeln i det globala kalkylbladet.
    6. Kör det ouppdehållna mjälteprovet genom att klicka på Hämta data på instrumentpanelen för förvärv.
    7. Ange lämpliga FSC- och SSC-inställningar för att visualisera cellerna genom att ändra spänningsvärdena i avsnittet Parametrar och skapa en grind för att markera alla celler som visas i punktdiagrammet FSC-A/SSC-A genom att klicka på PolygonPorten i verktygsfältet Globalt kalkylblad.
    8. Visa de inhägnade cellerna i histogrammen med varje fluorescensparameter på x-axeln.
    9. Kör osedda och helt färgade mjälteprover för att justera fluorescensdetektorn (PMT) för att ha en tydlig separation mellan negativa och positiva signaler från de färgade cellerna för varje fluorescensparameter.
    10. Om du vill utföra kompensationsinställningar klickar du på Experiment i menyfliksområdet på arbetsytan och väljer Skapa kompensationskontrollerunder Avsnittet Kompensationsinställningar . Avmarkera Inkludera ostadslöst kontrollrör/brunn och klicka på OK.
      OBS: Den här åtgärden resulterar i att ett prov med namnet Kompensationskontroller skapas och ett normalt kalkylblad som innehåller flera blad som motsvarar varje vald parameter.
    11. Kör ett prov av kompensationspärlor (se avsnitt 7); ställ in lämpliga FSC- och SSC-inställningar för att visualisera pärlorna genom att ändra spänningsvärdena och förvärvströskeln på 5 000 på FSC-parametrar i cytometerfönstret.
    12. Justera P1-porten på pärlpopulationen och kontrollera att de positiva och negativa topparna båda är synliga på x-axeln. Upprepa den här åtgärden för varje exempel på kompensationspärla och spela slutligen in varje exempelfil genom att klicka på Spela in data på instrumentpanelen för förvärv (registrera minst 5 000 händelser för varje exempel).
    13. För varje registrerat pärlprov, ställ P2- och P3-portarna på de positiva respektive negativa topparna.
    14. Kör cellproverna för kompensation (se steg 4.2 och 4.4.7 och avsnitten 5 och 6). Ändra FSC- och SSC-spänningarna och tröskelvärdet för att visualisera cellerna, justera P1-porten och slutligen spela in varje exempelfil (registrera minst 10 000 händelser). Ställ P2- och P3-portarna på de positiva respektive negativa topparna.
      OBS: För kompensation av Hoechst-kanalen, använd G0/G1 som negativ topp (P3) och G2/M som den positiva (P2).
    15. Klicka på Experiment i menyfliksområdet för arbetsytan och välj Beräkna kompensationi avsnittet Kompensation .
    16. Namnge den skapade kompensationsinställningen, länken och spara den i det aktuella experimentet.
  2. Experimentellt provförvärv
    1. Öppna ett prov genom att klicka på Nytt exemplar i webbläsarens verktygsfält och skapa gatingstrategin i det globala kalkylbladet.
      OBS: Gitterstrategin för provförvärv liknar den för urvalsanalys som beskrivs i figur 3 och avsnitt 9.
    2. Visa alla händelser i ett histogram med CD3-A på x-axeln. Skapa en intervallport för att bara markera CD3+ -cellerna.
    3. På Hämtningsinstrumentpanelenväljer du lagringsporten som Alla händelser för LN-exempel och antingen Alla händelser eller CD3+ celler för mjälteexempel.
    4. Kör de experimentella proverna med låg hastighet och registrera slutligen alla filer och se till att samla in minst 100-200 antigenspecifika CD8 T-celler för varje prov från de vaccinerade mössen.
      OBS: Filstorleken på experimentella prover är vanligtvis stor (30-120 MB), särskilt när frekvensen av antigenspecifika CD8 T-celler är låg. Därför måste ett stort antal händelser (> 1 × 106) samlas in för att registrera minst 100-200 antigenspecifika CD8 T-celler. Stora filer kan sakta ner den efterföljande dataanalysprocessen. Det är bra att endast ta bort CD3+ celler i mjälteprover (se steg 8.2.2 ovan) för att hålla filstorleken mindre.
    5. Kör och registrera den positiva kontrollen för cellcykelanalys, dvs. BM-prov från obehandlade möss.

9. Dataanalys

  1. Öppna programvaran (se Tabell över material) och skapa olika grupper som motsvarar de olika organ som ska analyseras genom att klicka på Skapa grupp i avsnittet arbetsytans menyfliksområde (dvs. skapa grupp "a-LNs"; "b-mjälte". "c-BM").
    NYskapade grupper visas i grupplistan, medan gruppen "Kompensation" genereras automatiskt av programvaran.
  2. Öppna fönstret Ändra grupp genom att dubbelklicka på gruppnamnet och kontrollera att de nyskapade grupperna är synkroniserade. Om inte, infoga en bock på funktionen Synkroniserad.
  3. Dra varje FCS-fil i motsvarande grupp.
  4. Skapa gating-strategin som börjar med gruppen "a-LNs".
  5. Dubbelklicka på det helt färgade exemplet i gruppen för att öppna diagramfönstret; x- och y-axeln är märkta som i FCS-filerna (se inställningar för flödescytometer, tabell 2).
  6. Visa de totala händelser som förvärvats för detta prov i ett prickdiagram med DNA-A på x-axeln och DNA-W på y-axeln.
  7. Markera bara encellspopulationen genom att klicka på Rektangel i avsnittet gatingverktyg i diagramfönstret.
    OBS: Enstaka celler har DNA-A-värden enligt följande: 2N (låg): mellan 2N och 4N (mellanliggande), eller lika med 4N (hög), medan DNA-W-värden är identiska för dem alla (steg 1 i figur 3).
  8. Dubbelklicka i mitten av den rektangulära porten om du vill visa enstaka celler i ett prickdiagram med FSC-A-parametern på x-axeln och färgämnet för döda celler på y-axeln.
  9. Markera bara den levande cellpopulationen genom att klicka på Polygon i avsnittet gatingverktyg i diagramfönstret. Levande celler är negativa för det döda cellfärgämnet (steg 2 i figur 3).
  10. Dubbelklicka i mitten av polygonporten om du vill visa cellerna i ett prickdiagram med FSC-A-parametern på parametern x-axis och SSC-A på y-axeln.
  11. Klicka på Rectangleoch skapa en "avslappnad" grind för att inkludera alla levande celler i det diagrammet12 (steg 3 i figur 3).
  12. Dubbelklicka i mitten av den "avslappnade" grinden för att visa cellerna i ett prickdiagram med CD3 på x-axeln och CD8 på y-axeln.
  13. Välj cellerna CD3+CD8+ genom att klicka på Polygon (steg 4 i bild 3).
  14. Dubbelklicka i mitten av CD3+CD8+ grinden för att visa cellerna i ett prickdiagram med Tetr-gag på x-axeln och Pent-gag på y-axeln.
  15. Välj de antigenspecifika CD8 T-cellerna (positiva för både Tetr-gag och Pent-gag) genom att klicka på Polygon (steg 5 i figur 3).
  16. Dubbelklicka i mitten av den munkavlespecifika porten för att visa cellerna i ett punktdiagram med DNA-A på x-axeln och Ki67 på y-axeln (bild 4).
  17. Markera cellerna i de olika cellcykelfaserna genom att klicka på Quad i avsnittet gatingverktyg i diagramfönstret.
    OBS: Cell i G0-fasen är Ki67neg-DNA-låga celler (nedre vänstra kvadranten); celler i G1 är Ki67pos-DNA låg (övre vänstra kvadrant); celler i S-G2/M är Ki67pos-DNA mellanliggande/hög (övre högra kvadranten) (figur 4).
  18. Kopiera gating-strategin som skapats i ett exempel till motsvarande grupp för att tillämpa portarna på alla exempel i gruppen.
  19. Upprepa steg 9.5 till 9.18 för "a-LN-gruppen".
  20. Kontrollera att alla grindar är lämpliga för varje prov i gruppen "b-mjälte". För att analysera cellcykeln bland BM-cellerna (positiv kontroll), klicka i mitten av den "avslappnade" porten för att visa cellerna i ett punktdiagram med DNA-A på x-axeln och Ki67 på y-axeln.
  21. Kontrollera att alla grindar är lämpliga för varje prov i de tre grupperna (dvs. för celler från mjälte, LN och BM).
    OBS: Encellspopulationsport (steg 9.7) och Quad gate för cellcykel (steg 9.17) kan ha olika grindkoordinater i olika prover, främst på grund av de möjliga små skillnaderna i Hoechst-färgintensiteten mellan proverna (avsnitt 6.2). Därför kan det vara nödvändigt att ändra porten för encellspopulation och Quad-portarna för cellcykel i varje prov. Detta görs på följande sätt: dubbelklicka på gruppnamnet och ta bort synkroniseringen från gruppegenskaperna. Den här åtgärden gör det möjligt att ändra portarna i ett exempel utan att ändra samma portar i alla andra exempel i gruppen. Efter synkroniseringsborttagning, ändra grindarna vid behov.
  22. Om du vill visualisera resultaten som erhålls genom den här analysen klickar du på Layoutredigeraren i menyfliksområdet för arbetsytan för att öppna den. Dra varje grind i gatingstrategin i exempelrutan till layoutredigeraren och placera tomterna enligt sekvensen i gatingstrategin. Om det behövs ändrar du diagramtypen genom att dubbelklicka på motsvarande diagram i layouten och välja lämplig typ i fönstret Diagramdefinition.
  23. Klicka på gruppen och iterera efter funktioner i layoutbandet för att visualisera resultaten som erhålls i varje organ och jämföra olika prover.

Representative Results

Cellcykelfaserna av celler från mjälte, LNs och BM hos Balb/c-möss analyserades med hjälp av det fluorescerande DNA-färgämnet Hoechst och en anti-Ki67 mAb, enligt protokollet som sammanfattas i figur 1. Denna färgning möjliggjorde differentiering av celler i följande faser av cellcykeln: G0 (Ki67neg, med 2N DNA definierat som DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) och S-G2/M (Ki67pos, med en DNA-halt som består av mellan 2N och 4N, eller lika med 4N DNA definierat som DNAintermediate/high).

Vi utförde först cellcykelanalys av BM-celler för att reproducera tidigare publicerade resultat13,14 och analyserade sedan de celler som var av intresse, dvs CD8 T-celler. Figur 2 visar ett typiskt exempel på cellcykelanalys av BM-celler (figur 2A). Protokollet gav en låg variationskoefficient (CV) på G0/G1 och G2/M DNA-toppar, vilket indikerar den utmärkta kvaliteten på DNA-färgningen(figur 2B, som visar ett exempel med CV < 2.5; CV var alltid < 5 i alla experiment).

Vi tillämpade sedan samma protokoll på antigenspecifika CD8 T-celler från vaccinerade möss. BALB/c möss vaccinerades mot antigen gag av HIV-1 genom att använda Chad3-gag för priming och MVA-gag för boosting, båda konstruerade för att bära HIV-1 munkavle. På dag (d) 3 post-boost analyserade vi frekvensen av gag-specifika CD8 T celler från mjälten och dräneraNDE LNs. Vi utnyttjade den nyligen definierade gatingstrategin för T-celler i den tidiga fasen av immunsvaret, som i motsats till den konventionella strategin är lämplig för att upptäcka högaktiverade antigensvarande CD8 T-celler12. Vi genomförde den nya strategin i fem efterföljande steg. I steg 1 uteslöt vi dubbelgångare eller aggregat med DNA-A/ -W-grind, och i steg 2 identifierade vi levande celler genom uteslutning av döda celler. I steg 3 identifierade vi den intressepopulation som använde en icke-konventionell "avslappnad" FSC-A / SSC-A-grind(figur 3A) istället för den kanoniska smala lymfocytporten12. Efter gating på CD3+CD8+ celler (steg 4 i figur 3A) identifierade vi munkavlespecifika CD8 T-celler med hjälp av två olika MHC-multimerer, dvs. Pent-gag och Tetr-gag (steg 5 i figur 3A). Vi använde två multimerer istället för en för att förbättra känsligheten hos gag-specifika CD8 T-celldetektering hos vaccinerade möss, utan att öka färgningsbakgrunden hos obehandlade möss (figur 3B och C, steg 5). Således utmärkte vi framgångsrikt obehandlade möss (0,00% och 0,00% antigenspecifika CD8 T-celler i LN respektive mjälte) från vaccinerade möss (0, 46% respektive 0,29% antigenspecifika CD8 T-celler i LN respektive mjälte, figur 3B respektive C).

Protokollet tillät oss att ha en extremt låg bakgrund i den antigenspecifika CD8 T-cellporten av LNs och mjälte av obehandlade möss (vanligtvis 0,00% och högst 0,02%). Jämförelsen av gag-specifika och inte gag-specifika FSC-A / SSC-A tomter visade att de gag-specifika cellerna hade hög SSC-A och FSC-A (Figur 3D), bekräftar behovet av att använda en "avslappnad" FSC-A / SSC-A gate för att fånga dessa celler. Vi utvärderade sedan procentandelarna av gag-specifika CD8 T-celler i olika cellcykelfaser (figur 4A). Vi fann att gag-specifika CD8 T celler i mjälten och ännu mer i dränerande LNs innehöll en hög andel celler i S-G2/M faser på dag 3 post-boost (18,60% respektive 33,52%).

Dessutom fann vi att gag-specifika CD8 T-celler i S-G2/ M faser hade hög FSC-A och SSC-A, när de överlagrades på de totala CD8 T-cellerna från samma organ (figur 4B). CD62L-uttrycket av gagspecifika CD8 T-celler var lågt, som förväntat för aktiverade T-celler, med undantag för några celler i G0 i LN(figur 4C). Sammantaget bekräftade dessa resultat att den "avslappnade" porten (steg 3 i figur 3A, B och C) var skyldig att inkludera alla prolifererande antigenspecifika CD8 T-celler12. Protokollet var extremt värdefullt för en "ögonblicksbild" utvärdering av cell cykel faser av antigen-specifika CD8 T celler vid tidpunkten för analysen och av CD62L uttryck av celler i olika cell cykel faser.

Figure 1
Figur 1: Protokollsystemet för cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren. 

Figure 2
Figur 2: Cellcykelanalys av BM-celler. BM celler från obehandlade Balb/c möss färgades och analyseras av flöde cytometry. A) Exempel på gatingstrategi. Vi gated på enstaka celler i DNA-A/-W plot (vänster) och därefter på levande celler genom död cell färg uteslutning (mitten). Sedan användes en "avslappnad" FSC-A / SSC-A gate för alla BM-celler (höger). (B) Exempel på cellcykelanalys av BM-celler (vänster). Vi använde en kombination av Ki67 och DNA-färgning för att identifiera celler i följande faser av cellcykeln: G0 (nedre vänstra kvadranten, Ki67neg-DNAlow celler), G1 (övre vänstra kvadrant, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (övre högra kvadrant, Ki67pos-DNAintermediate/hög). Fluorescens minus en (FMO) kontroll av Ki67 mAb (mitten) och DNA histogram (höger) visas. I DNA-histogramdiagrammet motsvarar vänster och höger grindar G0/G1 respektive G2/M DNA-topp, och siffrorna representerar variationskoefficienterna (CV) för varje topp. I alla andra diagram representerar siffrorna cellprocent i de angivna portarna. Siffran visar 1 representativt experiment av 5. I varje experiment analyserade vi poolade BM-celler från 3 möss. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Analys av antigenspecifika CD8 T-celler från LN och mjälte. Balb/c möss primedes intramuskulärt (i.m.) med Chad3-gag och boosted i.m. med MVA-gag. Dag 3 efter boost, dränerande LN och mjälte celler från vaccinerade och obehandlade kontroll möss färgades och analyseras av flöde cytometri. A) Gitterstrategins system i fem steg för att identifiera enstaka celler (steg 1). levande celler (steg 2); lymfocyter (steg 3); CD8 T-celler (steg 4); och gag-specifika celler (steg 5). (B-C) Exempel på diagram: analys av celler från (B) LNs och (C) mjälte av obehandlade (övre) och vaccinerade (botten) möss. Vi identifierade enstaka celler på DNA-A/ -W-området i steg 1. Sedan, i steg 2, valde vi levande celler genom uteslutning av döda celler. I steg 3 använde vi en icke-kanonisk "avslappnad" grind för lymfocyter. I steg 4 identifierade vi CD8 T-celler genom deras dubbla uttryck av CD3 och CD8. Vi identifierade sedan gag-specifika celler och inte gag-specific i steg 5, baserat på deras förmåga att binda fluorokrom-märkt H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) och H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag), respektive inte. D) FSC-A/SSC-A-profiler av munkavlespecifika (blå) och inte gagspecifika (grå) celler efter gating enligt beskrivningen ovan. Tal representerar cellprocent i de angivna portarna. Siffran visar 1 representativt experiment av 5. I varje experiment analyserade vi poolade mjälte och poolade LN-celler från 3 vaccinerade möss och 3 obehandlade möss. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler. Möss vaccinerades som i figur 3 och cellcykelanalys av munkavlespecifika celler utfördes dag 3 efter boost, efter gating i 5 steg som i figur 3. (A)Exempel på cellcykelanalys av gagspecifika CD8 T-celler från LN (överst) och mjälte (botten) av vaccinerade möss. Cellcykelfaserna identifierades som i figur 2B. Panelerna representerar celler i G0, i G1och i S-G2/M (vänster) och Fluorescence Minus One (FMO) kontroll av Ki67 mAb (höger). Tal representerar cellprocent i de angivna portarna. B) FSC-A/SSC-A punktdiagram som visar gagspecifika CD8 T-celler i S-G2/M-faser (i rött) överlagrade på totalt CD3+CD8+ T-celler (i grått) från LN (överst) och mjälte (botten) av vaccinerade möss. C) Offset histogram som visar CD62L-uttryck genom munkavlerespecifika CD8 T-celler i G0 (grön), i G1 (blå) och i S-G2/M (röd) från LNs (överst) och mjälte (botten) av vaccinerade möss. Y-axlarna anger normaliserat antal händelser. Figuren visar 1 representativt exempel av 5 oberoende experiment med totalt 15 möss. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande material: Flödescytometerinställningar. Klicka här för att ladda ner den här filen. 

Discussion

Även om T-cellsklonal expansion har studerats intensivt, är vissa aspekter fortfarande okända, främst för att de verktyg som finns tillgängliga för att undersöka det är få och har sina egna nackdelar. Ur detta perspektiv sätter vi upp en mycket känslig flöde cytometrisk metod för att analysera cellcykeln av antigenspecifika CD8 T-celler tidigt efter vaccination i en musmodell. Protokollet är baserat på en kombination av Ki67 och DNA-färgning, som tidigare användes för att analysera cellcykeln av BM-hematopoetiska celler hos möss13,14. För att anpassa protokollet till antigenspecifika CD8 T-celler var vi tvungna att överväga några kritiska frågor, inklusive valet av DNA-färgämnet, lämpliga villkor för att erhålla jämförbar DNA-färgning över olika prover och gatingstrategin för dataanalys.

Många färgämnen finns tillgängliga för DNA-färgning, inklusive propidiumjodid och 7-aminoactinomycin D; vi valde Hoechst eftersom det var kompatibelt med membranfärgning och det milda fixerings- / permeabiliseringsprotokollet som krävs för Ki67-färgning. Samtidigt gjorde färgning med Hoechst det möjligt för oss att få ett DNA-histogram av utmärkt kvalitet, dvs. G0/ G1 och G2/ M DNA-topparna hade en mycket lägre variationskoefficient (CV) än DNA-toppar som vanligtvis erhålls med andra DNA-färgämnen, t.ex. DRAQ519. Faktum är att Hoechst kan färga DNA även i levande celler20.

Vissa strategier användes för att undvika fluktuationer i Hoechst-intensiteten i olika prover av samma experiment. Hoechst färgning utfördes strax före prov förvärv vid flödet cytometer för att minimera nedgången av färgämne intensitet under tiden. För dem som är intresserade av att reproducera protokollet i stora experiment med många prover rekommenderar vi att du utför Hoechst-färgning på några prover åt gången. En annan nackdel är att Hoechst-intensiteten kan påverkas kraftigt av cellantal under inkubation med färgämnet. Av denna anledning rekommenderar vi starkt att du alltid använder samma antal celler och samma volym per prov för DNA-färgning. Om ett stort antal celler krävs för förvärv vid flödescytometern rekommenderar vi att du förbereder två eller flera identiska prover och sedan sammanfogar dem strax före Hoechst-färgningssteget.

En viktig punkt i protokollet är gating-strategin för dataanalys. Vi publicerade nyligen en ny strategi för T-cellsanalys i tidiga tider av immunsvaret, vilket gjorde det möjligt för oss att öka känsligheten för detektion av antigenspecifika T-celler12. Vi tillämpade denna strategi på de uppgifter som visas här på följande sätt. Först uteslöt vi cellaggregat i DNA-A/W-området. För det andra, efter att ha gating ut döda celler, använde vi en ganska stor lymfocytport i FSC / SSC-tomten ("avslappnad grind"). Genom denna strategi kunde vi inkludera högaktiverade antigen-specifika CD8 T celler i S-G2/ M som vanligtvis missas av nuvarande gating strategier, eftersom dessa celler har hög FSC-A och SSC-A. Sammanfattningsvis representerar dataanalysen en kritisk del av metoden, vilket är viktigt för att erhålla en känslig detektion av aktiverade /prolifererande antigenspecifika T-celler.

Metoden förhindrar möjligheten att missa kritiska T-celldata i tidiga faser av immunsvaret och öppnar nya perspektiv för T-cellsimmunövervakning. En framtida förbättring kan vara att inkludera färgning för fospho-histon 3 som skulle möjliggöra differentiering mellan G2 och M21. En aktuell begränsning är att celler måste fixeras och permeabiliseras för att färga för kärnmarkören Ki67. Celler kan därför inte användas för andra typer av analyser, till exempel sortering och efterföljande funktionell analys. Dessutom stör DNA-färgämnen, inklusive Hoechst, vanligtvis den genomiska DNA-analysen och är inte lämpliga för denna typ av utvärdering. Identifiering av membranmarkörer som korrelerar med olika cellcykelfaser och som kan färgas på levande celler kan övervinna denna begränsning. Sammanfattningsvis har metoden stor potential för utvärdering av aktiverade/prolifererande T-celler i flera sammanhang såsom vaccination, infektion, immunmedierade sjukdomar och immunterapi.

Disclosures

A. Folgori och S. Capone är anställda av Reithera Srl. A. Nicosia namnges uppfinnare på patentansökan WO 2005071093 (A3) "Chimpanzee adenovirusvaccinbärare." De andra författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Reithera, av MIUR-projektet 2017K55HLC_006 och av 5 × 1000 bidrag från Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). Följande tetramer erhölls genom NIH Tetramer Facility: APC-konjugerad H-2K (d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-200 μL universal fit bulk packed pipet tips Corning  CLS4866-1000EA
2.4G2 anti-FcγR mAb  BD 553141 10 μg/ml final concentration
5 ml syringe plunger BD Emerald  307733
15 ml conical tubes MercK Millipore  SBHA025SB
60 mm TC-treated Cell Culture Dish Falcon 353002
70 μm cell strainer  Falcon 352097
96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate Falcon  353077
Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles BD- Bioscience 552845
Beta-mercaptoethanol   Sigma M3148
Bovine Serum Albumin Sigma A07030
BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a  BD- Bioscience 564920 4 μg/ml final concentration
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium  Euroclone ECB4004L 
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120159
Ethanol Sigma 34852-1L-M
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)  Sigma  E7889
Fetal Bovine Serum Corning 35-079-CV
Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 μm Falcon  352350
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBioscience 65-0865-14 1:1000 final concentration
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x
H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer provided by NIH Tetramer Core Facility 6 μg/ml final concentration
H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer Proimmune  F176-2A-E - 176 10 μL / sample 
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water ThermoFisher H3570
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC eBioscience 11-5698-82 5 μg/ml final concentration
L-Glutamine 100X (200 mM) Euroclone ECB3000D 
Millex-HA Filters 0,45 µm BD 340606
Penicillin/Streptomycin 100X Euroclone ECB3001D 
PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody Biolegend  104418 0.2 μg/ml final concentration
PerCP-Cy™5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e  BD- Bioscience 551163 4.4 μg/ml final concentration
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma R7757
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon  352058
RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red Euroclone ECB9006L 
Software package for analyzing flow cytometry data FlowJo v.10
Software for acquisition of samples at flowcytometer BD FACSDiva  v 6.2
Trypan Blue Solution Euroclone ECM0990D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).
  2. Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).
  3. Bajénoff, M., et al. Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).
  4. Bevan, M. J., Fink, P. J. The CD8 response on autopilot. Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).
  5. Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Beverley, P. C. Primer: making sense of T-cell memory. Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).
  8. Parretta, E., et al. CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow. Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).
  9. Di Rosa, F. Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation. Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).
  10. Di Rosa, F. Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory. Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).
  11. Di Rosa, F. Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription. Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).
  12. Simonetti, S., et al. Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination. Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).
  13. Wilson, A., et al. c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Genes & Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).
  14. Hirche, C., et al. Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo. Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).
  15. Colloca, S., et al. Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species. Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).
  16. Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
  17. Di Lullo, G., et al. The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use. Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).
  18. Mouse phenotype. , Available from: https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i (2020).
  19. Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus. PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).
  20. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  21. Vignon, C., et al. Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot. PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).

Tags

Immunologi och infektion nummer 167 antigenspecifika CD8 T-celler cellcykel Ki67 DNA-färgämne flödescytometri mjälte lymfkörtlar mus

Erratum

Formal Correction: Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice
Posted by JoVE Editors on 11/03/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice. The Authors section and a figure were updated.

The authors section was updated from:

Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR),
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”,
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia,
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II,
5Reithera Srl
* These authors contributed equally

To:

Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR),
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”,
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia,
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II,
5Reithera Srl
6IRCCS, Neuromed
* These authors contributed equally

Figure 1 was updated from:

Figure 1
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. Please click here to view a larger version of this figure.

To:

Figure 1
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. Please click here to view a larger version of this figure.

En DNA/Ki67-baserad flödescytometrianalys för cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler hos vaccinerade möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simonetti, S., Natalini, A.,… More

Simonetti, S., Natalini, A., Peruzzi, G., Nicosia, A., Folgori, A., Capone, S., Santoni, A., Di Rosa, F. A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice. J. Vis. Exp. (167), e61867, doi:10.3791/61867 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter