Summary
Dans cette étude, nous présentons un protocole pour la différenciation des cellules souches neurales et progénitrices (PNJ) uniquement induite par la stimulation par impulsions à courant direct (DC) dans un système microfluidique.
Abstract
Les champs électriques physiologiques (EF) jouent un rôle vital dans la migration cellulaire, la différenciation, la division et la mort. Cet article décrit un système microfluidique de culture cellulaire qui a été employé pour une étude à long terme de différenciation cellulaire utilisant la microscopie. Le système microfluidique se compose des principaux composants suivants : une puce électrotaxique optiquement transparente, un chauffe-eau transparent à oxyde d’indium-étain (ITO), une pompe de remplissage des médias de culture, une alimentation électrique, un amplificateur de puissance à haute fréquence, un multiplexeur EF, un stade motorisé X-Y-Z programmable et un microscope à contraste de phase inversé équipé d’un appareil photo numérique. Le système microfluidique est bénéfique pour simplifier la configuration expérimentale globale et, à son tour, le reagent et la consommation d’échantillons. Ces travaux impliquent la différenciation des cellules souches neurales et progénitrices (PNJ) induites par la stimulation pulsée à courant direct (DC). Dans le milieu d’entretien des cellules souches, les PNJ de souris se sont différenciés en neurones, astrocytes et oligodendrocytes après la stimulation par impulsions DC. Les résultats suggèrent que le traitement simple d’impulsion de DC pourrait contrôler le sort des mNPCs et pourrait être employé pour développer des stratégies thérapeutiques pour des désordres de système nerveux. Le système peut être utilisé pour la culture cellulaire dans plusieurs canaux, pour la stimulation à long terme ef, pour l’observation morphologique cellulaire, et pour l’acquisition automatique d’image time-lapse. Ce système microfluidique raccourcit non seulement le temps expérimental requis, mais augmente également la précision du contrôle sur le microenvironnement.
Introduction
Les cellules précurseurs neurales (PNJ, également connues sous le nom de cellules souches neurales et progénitrices) peuvent être un candidat prometteur pour la stratégie thérapeutiqueneurodégénérative 1. Les PNJ indifférenciés ont une capacité d’auto-renouvellement, une multi-puissance et une capacité proliférative2,3. Une étude précédente a rapporté que la matrice extracellulaire et les médiateurs moléculaires régulent la différenciation du PNJ. Le facteur de croissance épidermique (FEM) et le facteur de croissance fibroblaste de base (bFGF) favorisent la prolifération des PNJ, maintenant ainsi l’état indifférencié4.
Des études antérieures ont rapporté que la stimulation électrique peut réguler les activités physiologiques cellulaires telles que la division5,la migration6,7,8, la différenciation1,9,10, et la mort cellulaire11. Les champs électriques (FE) jouent un rôle vital dans le développement et la régénération du développement du système nerveux central12,13,14. De 2009 à 2019, ce laboratoire a étudié les réponses cellulaires à l’application de l’EF dans le système microfluidique1,6,7,8,15,16,17. Une puce électrotaxique multicanal, optiquement transparente et électrotaxique (MOE) a été conçue pour convenir à la coloration par immunofluorescence pour la microscopie confocale. La puce avait une grande transparence optique et une bonne durabilité et a permis la conduite simultanée de trois expériences de stimulation indépendantes et plusieurs conditions immunotachées dans une seule étude. Le système microfluidique est bénéfique pour simplifier la configuration expérimentale globale et, à son tour, le reagent et la consommation d’échantillons. Cet article décrit le développement d’un système de culture cellulaire microfluidique qui a été utilisé pour une étude de différenciation cellulaire à long terme.
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Protocol
1. Conception et fabrication de la puce MOE
- Dessiner des motifs pour les couches individuelles de méthacrylate polyméthyle (PMMA) et le ruban adhésif à double face à l’aide d’un logiciel approprié (Figure 1A, Tableau des matériaux). Coupez à la fois les feuilles PMMA et le ruban adhésif à double face à l’aided’un scriber de machine laser CO 2 (Figure 1B).
- Allumez lescriber laser CO 2 et connectez-le à un ordinateur personnel. Ouvrez le fichier de motifs conçu à l’aide du logiciel.
- Placez les feuilles PMMA (275 mm x 400 mm) ou le ruban adhésif à double face (210 mm x 297 mm) sur la plate-forme du scriber laser (figure 2A). Concentrez le laser sur la surface des feuilles PMMA ou sur le ruban adhésif à double face à l’aide de l’outil de mise au point automatique.
- Sélectionnez le scriber laser comme imprimante, puis « imprimez » le motif à l’aide du scriber laser pour commencer l’ablation directe sur la feuille PMMA ou le ruban adhésif à double face et obtenir des motifs individuels sur la feuille ou le ruban PMMA (figure 2B).
- Retirez le film protecteur des feuilles pmma et nettoyez la surface à l’aide de gaz azoté.
REMARQUE : Le dessin du modèle PMMA et l’usinage direct de la feuille pmma ont été effectués selon un rapport précédent17. - Pour lier plusieurs couches de feuilles PMMA, empilez trois morceaux de feuilles PMMA de 1 mm (couches 1, 2 et 3) et les lier sous une pression de 5 kg/cm2 dans un obligataire thermique pendant 30 min à 110 °C pour former l’assemblage du canal de stimulation électrique(figure 2C).
REMARQUE : Différents lots de feuilles PMMA obtenues commercialement ont une température de transition du verre légèrement différente (Tg). La température optimale de liaison doit être testée à des incréments de 5 °C près du Tg. - Adhérez 12 pièces d’adaptateurs aux ouvertures individuelles de la couche 1 de l’assemblage de puces MOE avec de la colle cyanoacrylate à action rapide.
REMARQUE : Les adaptateurs sont faits de PMMA par moulage par injection. Les surfaces plates en bas sont pour se connecter à la puce MOE. Les adaptateurs portant 1/4W-28 fil de vis femelle sont pour connecter les bouchons blancs finger-tight, connecteurs à fond plat, ou adaptateurs Luer. Soyez prudent lorsque vous utilisez de la colle cyanoacrylate à action rapide. Évitez de vous éclabousser dans les yeux. - Désinfectez les substrats PMMA de 1 mm (couches 1-3), le ruban à double face (couche 4) et le PMMA optique de 3 mm (couche 5) à l’aide de l’irradiation ultraviolette (UV) pendant 30 minutes avant d’assembler la puce (figure 1A).
- Adhérez aux substrats PMMA de 1 mm (couches 1-3) sur le PMMA optique de 3 mm (couche 5) avec le ruban à double face (couche 4) pour compléter l’assemblage PMMA (couches 1-5) (figure 1A).
- Préparer le verre de couverture propre pour l’assemblage sur la puce.
- Remplissez une dilution décuplé du détergent dans un bocal à taches (voir la table des matériaux)et nettoyez le verre de couverture dans ce détergent à l’aide d’un nettoyant à ultrasons pendant 15 min.
- Rincer soigneusement le bocal à taches sous l’eau courante du robinet pour enlever toutes les traces du détergent.
- Continuer le rinçage avec de l’eau distillée pour enlever toutes les traces d’eau du robinet, et répéter l’étape 1.7.2 deux fois.
- Séchez le verre de couverture nettoyé en le soufflant avec du gaz azoté.
- Désinfecter l’assemblage pmma (couches 1-5), le ruban à double face (couche 6) et le verre de couverture (couche 7) à l’aide d’irradiation UV à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pendant 30 minutes avant d’assembler la puce (figure 1A).
- Adhérez au verre de couverture nettoyé (couche 7) à l’assemblage PMMA (couches 1-5) avec le ruban adhésif à double face (couche 6) (figure 1A).
- Incuber la puce MOE dans une chambre à vide pendant la nuit; utiliser l’assemblage des puces MOE pour les procédures ultérieures( figure 3).
2. Revêtement poly-L-lysine (PLL) sur le substrat dans les régions de culture cellulaire
- Préparer le tube en polytétrafluoroéthylène, le connecteur à fond plat, le connecteur cône, l’adaptateur cone-Luer, le bouchon blanc serré au doigt (aussi appelé bouchon), l’adaptateur Luer, la seringue à serrure Luer et le bung en caoutchouc noir(figure 4A, tableau des matériaux). Stériliser tous les composants ci-dessus dans une autoclave à 121 °C pendant 30 min.
- Sceller les ouvertures des adaptateurs du pont d’agar (Figure 1A) avec les bouchons blancs serrés aux doigts. Connectez le connecteur à fond plat à l’assemblage des puces MOE via les adaptateurs d’entrée et de sortie moyens (Figure 4B). Connectez l’adaptateur cône-Luer aux robinets d’arrêt à trois sens.
- Ajouter 2 mL de solution PLL de 0,01 % à l’aide d’une seringue de 3 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 sens de l’entrée moyenne (figure 4B-
). - Connectez une seringue vide de 3 mL au robinet d’arrêt à 3 sens de la prise moyenne (figure 4B-
). - Remplissez les régions de culture cellulaire avec la solution PLL. Pompez manuellement la solution de revêtement dans les deux sens lentement. Fermez les deux robinets à trois pour sceller la solution à l’intérieur des régions de culture.
- Incuber la puce MOE à 37 °C pendant la nuit dans un incubateur rempli d’une atmosphère de CO2 à 5 %.
).
).3. Préparation du réseau de ponts salés
- Après l’étape 2.6, ouvrez les deux robinets d’arrêt à trois voies et chassez les bulles dans les canaux en pompant manuellement la solution de revêtement dans les deux sens dans le canal à l’aide des deux seringues.
- Dessiner 3 mL de milieu complet (milieu d’entretien des cellules souches composé du mélange d’nutritifs moyen/jambon modifié de Dulbecco F-12 (DMEM/F12), supplément de 2 % B-27, 20 ng/mL EGF, et 20 ng/mL bFGF) dans une seringue de 3 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 sens de l’entrée moyenne (figure 4B- et figure 4B-
). - Ajouter 3 mL de milieu complet pour remplacer la solution de revêtement dans les régions de culture cellulaire. Connectez une seringue vide de 5 mL au robinet d’arrêt à 3 sens de la prise moyenne (figure 4B-
). - Préparer le réseau de ponts salés( figure 5).
- Couper l’élastique en caoutchouc noir pour produire un espace, et insérer les électrodes de chlorure d’argent (Ag)/argent (AgCl) à travers le cachot en caoutchouc noir et dans la seringue de verrouillage Luer (Figure 4A).
- Remplacez le bouchon fingertight blanc par l’adaptateur Luer et injectez 3% d’agarose chaude pour remplir l’adaptateur Luer.
REMARQUE : Pour la préparation de l’agarose chaude, dissoudre 3 g de poudre d’agarose dans 100 mL de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) et stériliser dans une autoclave à 121 °C pendant 30 min. - Connectez la seringue luer à l’adaptateur Luer. Injecter 3% d’agarose chaude à travers la bouse en caoutchouc noir pour remplir la seringue de verrouillage Luer à l’aide de la seringue avec l’aiguille. Laisser refroidir et solidifier de 10 à 20 minutes pour que l’agarose refroidisse et se solidifie.
REMARQUE : Afin d’augmenter la capacité de volume de l’agarose, la seringue de verrouillage Luer est montée sur l’adaptateur Luer (figure 4 et figure 5). Ensuite, les grosses électrodes sont insérées dans la seringue de verrouillage Luer. L’électrode est capable de fournir une stimulation électrique stable pour l’expérience à long terme.
).
).4. Préparation des MNPC
- Culture des mNPCs1 dans le milieu complet dans un flacon de culture cellulaire 25T à 37 °C dans un incubateur rempli de 5% d’atmosphère de CO2. Sous-culture des cellules tous les 3-4 jours, et effectuer toutes les expériences avec des cellules qui ont subi 3-8 passages de la source d’origine.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et faire tourner les neurosphères à 100 × g pendant 5 min. Aspirez le supernatant et lavez les neurosphères avec le PBS (DPBS) de Dulbecco. Faites tourner les neurosphères à 100 × g pendant 5 min.
- Aspirer le 1x DPBS, puis résusquer les neurosphères dans le milieu complet. Bien mélanger et délicatement.
- Ajouter 1 mL de suspension neurosphère à l’aide d’une seringue de 1 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 sens de la prise (Figure 4B- ).
5. Configuration du système microfluidique pour la stimulation par impulsions DC (Figure 6)
- Installez la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO transparent qui est fixé sur un stade motorisé X-Y-Z programmable.
REMARQUE : La température de surface de l’ITO est contrôlée par un contrôleur dérivé intégral proportionnel et maintenue à 37 °C. Un thermocouple de type K est serré entre la puce et le chauffe-eau ITO pour surveiller la température des régions de culture cellulaire à l’intérieur de la puce. La puce MOE est installée sur une scène motorisée X-Y-Z programmable et convient à l’acquisition automatique d’images en accéléré dans différentes sections de canaux. La fabrication du chauffe-eau ITO et la configuration du système de chauffage de culture cellulaire ont été décritesprécédemment 18,19. - Infuser les mNPCs en pompant manuellement dans la puce MOE via la prise moyenne. Incuber la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO de 37 °C pendant 4 h.
- Après 4 h, pomper le milieu complet à travers la puce MOE via l’entrée moyenne à un débit de 20 μL/h à l’aide d’une pompe à seringues.
REMARQUE : Les mNPC sont cultivés et maintenus dans la puce pendant 24 h supplémentaires avant la stimulation ef pour permettre l’attachement et la croissance cellulaires. Le liquide de déchets est recueilli dans une seringue vide de 5 mL reliée au robinet d’arrêt à trois sens de la prise, présentée comme des « déchets » à la figure 6A. La configuration du système microfluidique MOE est indiquée dans la figure 6. Ce système microfluidique fournit un approvisionnement continu en nutrition aux cellules. Le milieu frais complet est continuellement pompé dans la puce MOE pour maintenir une valeur de pH constante. Par conséquent, les cellules peuvent être cultivés en dehors d’un incubateur de CO2. - Utilisez des fils électriques pour connecter un multiplexeur EF à la puce MOE via les électrodes Ag/AgCl sur la puce. Connectez un multiplexeur EF et un générateur de fonction à un amplificateur pour produire des impulsions DC à ondes carrées d’une magnitude de 300 mV/mm à une fréquence de 100 Hz à 50 % de cycles de service (50 % de temps de repos et 50 % de temps libre) (figure 6B).
- Connectez les fils électriques au multiplexeur EF. Connectez les fils électriques à la puce MOE via les électrodes Ag/AgCl.
- Connectez le multiplexeur EF à l’amplificateur à l’aide de fils électriques. Connectez le générateur de fonction à l’amplificateur et à l’oscilloscope numérique.
REMARQUE : Le multiplexeur EF est un circuit qui inclut l’impedance de la chambre culturelle du circuit et relie toutes les chambres individuelles dans un réseau électronique parallèle. Chacune des trois chambres de culture est reliée électriquement en série à une résistance variable (Vr) et à un ammètre (indiqué sous le nom de μA dans la figure 6A)dans le multiplexeur. Le courant électrique à travers chaque chambre de culture est varié en contrôlant le Vr, et le courant est indiqué sur l’ammètre correspondant. La force du champ électrique dans chaque région de culture cellulaire a été calculée par ohm’s Law, I= νEA, où je suis le courant électrique, σ (fixé comme 1,38 S·m-1 pour DMEM/F1220) est la conductivité électrique du milieu de culture, E est le champ électrique, et A est la zone transversale de la chambre électrotaxique. Pour la dimension de la région de culture cellulaire indiquée à la figure 1,le courant électrique est de ~87 mA et ~44 mA pour l’impulsion DC et DC à 50% de cycle de service, respectivement.
- Soumettons les mNPCs à des impulsions carrées de DC d’une magnitude de 300 mV/mm à la fréquence de 100 Hz pendant 48h. Pompez continuellement le milieu complet à un taux de 10 μL/h pour fournir une nutrition adéquate aux cellules et maintenir une valeur constante de pH dans le milieu.
6. Analyses d’immunofluorescence des mNPCs après stimulation pulsée de DC
REMARQUE : Dans cette étape, tout le réaccente est pompé par l’entrée moyenne à l’aide d’une pompe à seringues.
- Après 3, 7 ou 14 jours de culture in vitro (DIV) après l’ensemencement1,laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 25 μL/min pendant 20 min.
- Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA). Pompez 4% PFA dans la puce à un débit de 25 μL/min pendant 20 min pour remplacer le 1x PBS. Pour remplacer le PFA de 4 %, lavez les cellules avec 1x PBS à un débit de 25 μL/min pendant 20 min.
- Pompez 0,1% Triton X-100 dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min pour perméabiliser les cellules. Réduisez le débit à 50 μL/h pendant 30 minutes supplémentaires pour réagir avec les cellules. Pour remplacer le Triton X-100 de 0,1 %, lavez les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 6 min.
- Bloquer les cellules avec PBS contenant 1% d’albumine de sérum bovin (BSA) pour réduire la liaison anticorps non spécifique. Pompez 1% BSA dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min. Réduisez le débit à 100 μL/h et pompez pendant 1 h.
- Pomper les anticorps pour une double immunostaining dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min, et incuber la puce pendant 18 h à 4 °C. Laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 15 min.
- Pomper les anticorps secondaires conjugués Alexa Fluor dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min. Réduisez le débit à 50 μL/h et pompez les anticorps pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 15 min.
- Pour la coloration nucléaire, pomper Hoechst 33342 dans la puce à un débit de 20 μL/min pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité. Laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 15 min.
- Après immunostaining, observez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence confoccale.
7. Analyse d’image et traitement de données
- Analyser les images fluorescentes à l’aide d’un logiciel à l’aide d’outils de mesure intégrés (voir le Tableau des matériaux).
- Comparez les noyaux hoechst-contre-tachés (nombre total de cellules) dans les groupes de contrôle et de traitement, et calculez le pourcentage de cellules exprimant chaque marqueur phénotypique.
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Representative Results
La configuration détaillée de la puce MOE est indiquée à la figure 1. La puce microfluidique offre une approche bénéfique pour réduire la taille expérimentale de configuration, le volume de l’échantillon et le volume des réaccents. La puce MOE a été conçue pour effectuer trois expériences indépendantes de stimulation ef et plusieurs conditions d’immunostaining simultanément dans une seule étude (Figure 3). En outre, la puce MOE, qui a une grande transparence optique est adapté pour les examens de microscopie confoccale. La puce MOE est également conçue pour étudier simultanément les effets de différentes conditions de culture cellulaire (p. ex., stimulation multiple de l’EF, plusieurs médicaments, substrat de revêtement différent, série multiple de cellules) simultanément dans une seule expérience.
Les mNPC ont été exposés à des impulsions DC à ondes carrées (magnitude 300 mV/mm à une fréquence de 100 Hz). La stimulation d’impulsion de DC a été conduite pendant 48 h. Les cellules différenciées ont été immunotachées avec Tuj1 (classe III spécifique aux neurones β-tubulin), la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP pour identifier les astrocytes), et le marqueur oligodendrocyte O4. Après le traitement d’impulsion de DC, les mNPCs ont exprimé le nombre sensiblement élevé de neurones (cellules de Tuj1+ à DIV 7. Au DIV 3, les astrocytes (cellules GFAP+ ) étaient présents à des niveaux relativement plus élevés dans les groupes de stimulation que dans le groupe témoin (CTL). Par rapport au groupe CTL, les oligodendrocytes (cellules O4+ ) étaient significativement plus élevés dans le groupe de stimulation à DIV 7 et DIV 14 (Figure 7). Ces résultats montrent que la stimulation d’impulsion de DC a eu comme conséquence des mNPCs différeciant dans les neurones, les astrocytes, et les oligodendrocytes simultanément dans le milieu d’entretien de cellules souches. Ces résultats suggèrent que le système microfluidique de MOE convient à une étude à long terme de différenciation cellulaire par microscopie.
Figure 1: Configuration détaillée de la puce électrotaxique optiquement transparente multicanal. (A) Vue explosée de l’assemblage des puces MOE. La puce MOE se compose de feuilles PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), de ruban adhésif à double face (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), d’adaptateurs (10 mm x 10 mm x 6 mm). ), une feuille PMMA de qualité optique (50 mm x 75 mm x 3 mm), du ruban adhésif à double face (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) et un verre de couverture (24 mm × 60 mm). Il y a trois chambres de culture cellulaire dans la puce MOE. La puce MOE a des trous de raccordement pour l’entrée/sortie moyenne et les ponts de sel d’agar. Les cellules ont été cultivés dans la région de culture cellulaire (largeur 3 mm x longueur 42 mm x hauteur 0,07 mm). La figure 1A a été modifiée à partir de Chang et coll.6. (B) Photographie de la puce MOE comprenant des adaptateurs, des feuilles PMMA, du ruban adhésif à double face et du verre de couverture. Abréviations : MOE= électrotaxique optiquement transparent multicanal ; PMMA = méthacrylate polyméthyle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 :Les procédés de fabrication et d’assemblage de la puce MOE. (A) Les motifs conçus des feuilles PMMA ou du ruban adhésif à double face ont été fabriqués à l’aide de micromachining laser. (B) Les feuilles individuelles pmma ont été coupées par un scriber laser CO2. (C) Les multiples couches des feuilles pmma nettoyées ont été collées entre elles par un obligataire thermique. Abréviations : MOE= électrotaxique optiquement transparent multicanal ; PMMA = méthacrylate polyméthyle; CO2 = dioxyde de carbone. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Photographie de la puce MOE. Ce chiffre a été modifié de Chang et coll.6. Abréviation : MOE= électrotaxique optiquement transparent multicanal. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Connexion moyenne et électrique à la puce MOE. (A) Photographie des composants du réseau à débit moyen et du réseau EF du système microfluidique MOE, y compris le tube PTFE, le connecteur à fond plat, le connecteur cône, l’adaptateur cone-Luer, le bouchon blanc à doigts serrés, l’adaptateur Luer, la seringue de verrouillage Luer, l’élastique en caoutchouc noir et les électrodes Ag/AgCl. (B) Photographie de la configuration du réseau à débit moyen. Abréviations : MOE= électrotaxique optiquement transparent multicanal ; EF = champ électrique; PTFE = polytétrafluoroéthylène; Ag = argent; AgCl = chlorure d’argent. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Photographie montrant la puce moe sur un microscope. Abréviations : MOE= électrotaxique optiquement transparent multicanal ; Ag = argent; AgCl = chlorure d’argent; ITO = indium-étain-oxyde. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 :La configuration et le système utilisés pour lastimulation par impulsions DC. (A) La configuration de l’ensemble du système pour la stimulation par impulsions DC. Les seringues reliées à la puce MOE ont été utilisées pour l’infusion moyenne et l’efflux de déchets. L’impulsion DC de la puce a été fournie par une alimentation électrique effectuée par les électrodes Ag/AgCl. La configuration de l’appareil a été installée sur la scène motorisée X-Y-Z d’un microscope à contraste de phase inversé équipé d’un appareil photo numérique. (B) Une photographie montrant la configuration sur un banc de laboratoire. Abréviations : MOE= électrotaxique optiquement transparent multicanal ; Ag = argent; AgCl = chlorure d’argent; ITO = indium-étain-oxyde; EF = champ électrique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: Différenciation des cellules mNPC dans le groupe témoin (CTL) et dans le groupe de stimulation d’impulsion de DC à DIV 3, 7, et 14. Le pourcentage de neurones (cellules Tuj1+), d’astrocytes (cellules GFAP+) et d’oligodendrocytes (cellules O4+ ) dans (A-C) le groupe CTL et (D-F) dans le groupe de stimulation (impulsions DC). Ce chiffre a été publié par Chang et coll.1. Abréviations: CTL: contrôle; DC = courant direct; Tuj1 = classe III spécifique aux neurones β-tubuline; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale; O4 = marqueur oligodendrocyte O4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Lors de la fabrication de la puce MOE, les adaptateurs sont fixés à la couche 1 de la puce MOE avec de la colle cyanoacrylate à action rapide. La colle est appliquée sur 4 coins des adaptateurs, puis la pression est appliquée uniformément sur les adaptateurs. Une quantité excessive de colle doit être évitée pour assurer une polymérisation complète de la colle. De plus, l’assemblage de puces MOE complété est incubé dans une chambre à vide. Cette étape permet d’éliminer les bulles entre la couche PMMA, le ruban adhésif à double face et le verre de couverture.
Le choix du matériau électrode est basé sur le fait que les ions chlorure, qui sont abondamment présents dans le milieu, sont les produits électrolytiques qui circulent à travers la région de culture cellulaire. Pendant l’expérience de stimulation EF, le pH autour des électrodes est resté constant. Une configuration plus simple utilisant le platine (Pt) car le matériau électrode électrolyse l’eau et génère des ions hydrogène (H+) et des ions hydroxyde (OH-) à l’électrode positive et à l’électrode négative, respectivement, induisant des changements de pH dans la région culturelle. Éviter l’utilisation d’électrodes Pt contourne le problème des changements de pH pendant l’expérience de stimulation EF.
L’agarose chaude et l’agarose sans bulles sont essentielles lors de la préparation du réseau de ponts salés. L’agarose chaude a une grande fluidité et peut être facilement injectée dans le réseau de pont de sel. Connectez la seringue de verrouillage Luer à l’adaptateur Luer après avoir injecté l’agarose à chaud de 3 % dans l’adaptateur Luer. Au cours de cette étape, l’agarose sera poussée vers le haut dans la seringue de serrure de Luer de sorte qu’une connexion ferme sans bulle du réseau de pont de sel puisse être réalisée. Les bulles dans les ponts de sel augmentent la résistance électrique et, par conséquent, le courant électrique prévu ne peut pas être atteint. Après l’injection d’agarose, il est important d’attendre que l’agarose refroidisse et se solidifie à température ambiante pendant 10-20 min pour empêcher la formation de débris d’agarose solidifiés dans la région de culture cellulaire.
La puce MOE est placée sur un chauffe-eau ITO verrouillé sur une scène motorisée X-Y-Z programmable. L’ensemble du système est construit sur un microscope inversé à contraste de phase équipé d’un appareil photo numérique pour surveiller la différenciation cellulaire dans les régions de culture cellulaire de la puce. Il est pratique d’observer la morphologie cellulaire et l’acquisition des images automatiques en accéléré dans le système microfluidique MOE à l’extérieur d’un incubateur. Ce système microfluidique raccourcit non seulement le temps expérimental requis, mais augmente également la précision du contrôle sur le microenvironnement.
Les cellules mNPC se développent comme une suspension dans les médias culturels. Toutefois, les mNPC adhérant à la plaque recouverte de PLL dans la puce MOE sont essentiels à la différenciation. Les neurosphères formées par 30-40 cellules sont préférées pour initier la différenciation mNPC. La prolifération des MNPC nuira à la survie cellulaire pendant le processus de différenciation. En outre, après la stimulation pulsée de DC, la coloration d’immunofluorescence expérimentale peut être affectée par le taux d’écoulement. Par conséquent, utilisez plusieurs débits pour différentes étapes pour éviter de détacher les cellules pendant le lavage.
Dans cette étude, une limitation de cette technique est que la puce MOE ne peut pas être réutilisée en raison de la difficulté dans le nettoyage en profondeur de la puce. Toutefois, la puce MOE peut être placée directement sous un microscope à contraste de phase ou un microscope confocal à balayage. La conception étanche du système microfluidique signalé garantit que l’évaporation tampon/moyenne ne se produit pas, maintenant la concentration précise du tampon/milieu et des propriétés électriques correspondantes. En réduisant les volumes de réaccente et le temps d’exploitation correspondant, le système microfluidique MOE offre une approche efficace pour étudier la différenciation cellulaire.
Une étude précédente a montré que le FEM et le BFGF favorisent la survie, l’expansion et l’entretien des PNJ dans l’étatindifférencié 4. Dans cette étude, les impulsions de DC ont induit la différenciation des mNPCs dans le milieu d’entretien de cellules souches qui a contenu EGF et bFGF. Des études antérieures ont rapporté que ef favorise la différenciation des PNJ dans les neurones et / ou les astrocytes dans le milieu de différenciation sans EGF et bFGF14,21,22. Ces résultats montrent que les mNPCs se sont différenciés en neurones, astrocytes, et oligodendrocytes après la stimulation d’impulsion de DC. Ils suggèrent également que le traitement simple d’impulsion de DC pourrait contrôler le sort des PNJ. Avec une optimisation plus continue sur le temps de stimulation, la force ef, ou le cycle de service, impulsions DC peuvent être appliquées pour manipuler la différenciation NPC et peut être utilisé pour le développement de stratégies thérapeutiques qui emploient des PNJ pour traiter les troubles du système nerveux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Tang K. Tang, de l’Institut des sciences biomédicales d’Academia Sinica, pour son aide dans la fourniture de cellules souches neurales et progénitrices (MNPCs) de souris. Les auteurs remercient également le professeur Tang K. Tang et Mme Ying-Shan Lee pour leur précieuse discussion sur la différenciation des MNPC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
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